Agradecimentos
À Profa. Dra. Elenice A. de Moraes Ferrari que me orientou com carinho e dedicação, sempre pronta a esclarecer minhas dúvidas e dificuldades.
Ao Prof. Dr. Luiz Roberto Giorgetti Britto que me abriu as portas do seu laboratório na USP, possibilitando assim, a realização das análises imuno-histoquímicas deste trabalho.
Agradeço em especial, à grande amiga Ivana Brito, que com muita paciência e confiança, me ensinou a trabalhar com os pombos nas várias fases laboratoriais, me auxiliando prontamente quando lhe pedia ajuda.
Foi uma parceria incrível.
Ao pessoal do laboratório do Prof. Dr. Britto pela generosa acolhida.
A todos do meu laboratório, amigos que de uma forma ou de outra, me ajudaram a resolver as questões operacionais na realização dos experimentos.
A todos do Departamento, pela presença amigável e por me receberem com generosidade.
À minha família, que muito me incentivou e me apoiou.
Aos pombos, “companheiros de trabalho”, anônimos e queridos; aprendi a amá-los e a respeitá-los mais.
O presente trabalho teve suporte financeiro oriundo de auxílio da FAPESP, do CNPq e do FAEP-UNICAMP.
RESUMO
SPERANDÉO, M. L. A. Evocação da memória aversiva: participação do receptor NMDA
e análise da ativação de ZENK no hipocampo de pombos, 2005. 91p.
O presente estudo investigou os efeitos do antagonista do receptor NMDA, MK-801 na expressão do produto do zenk no hipocampo (Hp) de pombos, submetidos ao condicionamento clássico aversivo. Antes do treino, administrou-se MK-801, i.p, para o grupo condicionado MK (GCMK, n=6), salina para o grupo condicionado salina (GCS, n=6) e nenhum tratamento para os grupos-controle: randômico (GCR, n=6), contexto (GCC=7) e manipulação (GM=4). GCMK e GCS receberam três associações de som (1000-Hz, 83 dB,1 s) e choque (10 mA, 35ms) numa sessão de 20 min. Para GCR os estímulos foram aleatórios e o GCC não recebeu estímulos. O teste de re-exposição ao contexto ocorreu 24 h após o treino. A análise de freezing no treino mostrou maior ocorrência para o GCS em comparação ao GCC (p<0,05), com aumento gradual na sessão (p<0,01). No teste, GCS expressou maior ocorrência de freezing em comparação a todos os grupos (p<0,001). A expressão de zenk foi avaliada por imuno-histoquímica. O GCS teve maior número de núcleos ZENK-positivos no Hp ventral, especificamente no Hp ventro-medial, comparativamente aos outros grupos (p<0,01). A baixa ocorrência de freezing ao contexto no GCMK evidencia o efeito amnésico do MK-801. A análise da marcação de núcleos ZENK-positivos no Hp sugeriu sua ativação regionalizada na evocação de memória contextual aversiva em pombos. O presente estudo indica o envolvimento de receptores de glutamato do tipo NMDA em mecanismos sinápticos de plasticidade neural durante a evocação de memória aversiva ao contexto.
Palavras-chave: condicionamento clássico aversivo, hipocampo, MK-801, antagonista dos receptores NMDA, recuperação da memória aversiva, zenk.
ABSTRACT
SPERANDÉO, M. L. A. Retrieval of the aversive memory: participation of NMDA
receptor and examination of ZENK expression in the hippocampus of pigeons, 2005.
91p.
The present study investigated the effects of the antagonist of the glutamate NMDA receptor, MK- 801, in the activation of zenk in the hippocampus of pigeons (Hp) submitted to the classical aversive conditioning. Two groups of pigeons received MK-801 (MKG, n=6) or saline (SG, n=6) 30 min before training with tone-shock associations. The control groups received unpaired stimulation (RCG, n=6), exposure to the context (CCG=7) or manipulation alone (MG=4). During the 20 min training session MKG and SG received three sound (1000-Hz, 83 dB, 1 s) and shock associations (10 mA, 35ms). The test to the context occurred 24 hours after the training. During the training session SG animals showed more freezing as compared with CCG (p<0,05). During the test, SG expressed higher freezing than all the other groups (p<0,001). ZENK analysis was conducted with imunohistochemistry. The density of ZENK-positive nuclei in the ventral hippocampus, specifically in the ventromedial hippocampus, was higher for SG as compared to the other groups (p<0,01). The fact that the animals from the MKG expressed lower freezing to the context may be considered as indicative of an amnesic effect of the MK-801. The density of ZENK-positive nuclei in the hippocampus suggests a regional activation that may be related to the retrieval of contextual aversive memory. The present study indicates that synaptic mechanisms mediated by NMDA glutamate receptors participate in the neural plasticity related to the retrieval of contextual aversive memory.
Key-Words: classical aversive conditioning, hippocampus, MK-801, NMDA receptors antagonist, aversive memory retrieval, zenk.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...1
1.1 Condicionamento clássico aversivo e a memória...1
1.2 O condicionamento clássico aversivo e o hipocampo ...5
1.3 Importância funcional da transmissão glutamatérgica no hipocampo para a aprendizagem, memória e plasticidade neuronal...9
1.4 As relações entre o hipocampo, os genes de expressão imediata (GEIs), a aprendizagem e a memória ...12
1.5 Efeitos amnésicos do MK-801 no aprendizado e memória hipocampo- dependentes ...16
1.6 A caracterização do sistema hipocampal em aves...21
1.6.1 Aspectos neuroquímicos da formação hipocampal em aves ... 23
1.6.2 Relações entre áreas das regiões hipocampais de aves e de mamíferos .... 24
1.7 Justificativa do trabalho ...25 2 OBJETIVOS ...27 3 MATERIAIS E MÉTODOS...28 3.1 Sujeitos...28 3.2 Procedimentos...29 3.2.1 Drogas e reagentes... 29
3.2.2 Adaptação às condições do biotério ... 29
3.2.3 Implante de eletrodos púbicos ... 30
3.2.4 Adaptação às condições do laboratório ... 30
3.2.5 Treino em condicionamento som-choque ... 30
3.2.6 Teste ao contexto de condicionamento... 31
3.2.7 Perfusão ... 32
3.2.8 Tratamento imuno-histoquímico do tecido cerebral ... 33
3.3 Análise dos dados comportamentais...33
3.4 Análise da marcação de células ZENK-positivas ...35
3.5 Análise estatística...36
4 RESULTADOS ...38
4.1 Análise da ocorrência de freezing no treino e no teste...38
4.2 Análise do número de células ZENK-positivas ...45
5 DISCUSSÃO...53 6 CONCLUSÃO...64 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...65 APÊNDICE A...74 APÊNDICE B...79
1 INTRODUÇÃO
1.1 Condicionamento clássico aversivo e a memória
A sobrevivência de indivíduos de todas as espécies depende, em grande parte, da sua habilidade em reagir adequadamente aos perigos, aos desafios e às ameaças a sua integridade física e comportamental. Esta habilidade é diretamente relacionada com a capacidade de prever eventos aversivos e de coordenar as reações defensivas diante deles. Nesse sentido a previsão e a antecipação desses eventos têm importância fundamental, de tal forma que os animais aprendem a evitá-los, usando as informações referentes às associações dos estímulos às quais são submetidos e às características do ambiente no qual lhes são apresentados. Como é característico da aprendizagem, esse tipo de habilidade decorre de uma interação do indivíduo com o meio ambiente (STADDON, 1983) pela qual o ambiente altera o comportamento e este altera o ambiente (CATANIA, 1999). As informações relativas aos eventos e às experiências da vida adquiridas por meio da aprendizagem são armazenadas no sistema nervoso central e podem ser evocadas. Essa capacidade característica do encéfalo, que é conhecida como memória, constitui uma das mais importantes formas de plasticidade do sistema nervoso central. A memória é criticamente dependente do hipocampo e de estruturas límbicas relacionadas, tal como a amígdala (LEDOUX et al., 1990; SELDEN et al., 1991; KIM e FANSELOW, 1992; PHILLIPS e LEDOUX, 1992; EICHENBAUM, OTTO e COHEN, 1992; IZQUIERDO e MEDINA, 1993; MAREN, AHARONOV e FANSELOW, 1997; HALL, THOMAS e EVERITT, 2001).
Um tipo de aprendizagem que é responsável pela modificação do comportamento respondente ou reflexo envolve o controle de contingências estímulo-estímulo, no qual os sujeitos aprendem sobre a relação entre dois estímulos ou entre
um estímulo e um comportamento (KANDEL, 2001). A essência do condicionamento clássico é o pareamento de dois estímulos, condição que o caracteriza como aprendizagem associativa. O processo comportamental resultante é denominado de condicionamento clássico (CATANIA, 1999) e foi descrito pelo fisiologista russo Ivan Pavlov no início do século XX.
O aprendizado associativo de medo é estudado em laboratório por meio de um procedimento referido como condicionamento clássico aversivo, ou, condicionamento Pavloviano do medo (SANDERS, WILTGEN e FANSELOW, 2003). Tal condicionamento é um processo que resulta da experiência dos animais que são expostos a uma situação aversiva em que ocorre o estímulo incondicionado (EI), por exemplo, um choque elétrico. Os comportamentos que são eliciados pelo EI são chamados de respostas incondicionadas, as quais são características da espécie e independem de aprendizagem. A aprendizagem do medo ocorre quando se associa um estímulo inicialmente neutro ao EI. Inicialmente, o estímulo associado ao EI produz uma resposta não relacionada com as respostas incondicionadas. A partir de associações com o EI, esse estímulo inicialmente neutro, por exemplo, um som, adquire a capacidade de eliciar as respostas incondicionadas (KANDEL, SCHWARTZ e JESSEL, 2000; WHITE e SALINAS, 2003) e torna-se um estímulo condicionado (EC). Como resultado, esse estímulo adquire controle sobre as respostas que são eliciadas pelo EI (respostas condicionadas comportamentais, vegetativas e endócrinas) tais como: aumento dos batimentos cardíacos, alterações gastrointestinais, da pressão sanguínea, da temperatura corporal, da salivação, da respiração, aumento de sobressaltos e/ou imobilidade somato-motora (SCHAFE et al., 2001). Nessas situações o EI também se associa com o ambiente onde ocorre o condicionamento, referido como contexto de treinamento (LANDEIRA-FERNANDEZ,
1996; REIS et al., 1999). Quando exposto a esses estímulos contextuais mais tarde, o animal manifesta uma resposta de medo que se caracteriza como uma imobilidade total tensa ou resposta de congelamento (freezing), a qual é a principal medida dependente neste tipo de experimento. Em roedores, o freezing se caracteriza por ausência de qualquer movimento com exceção dos movimentos respiratórios, por pelo menos 5 s (HALL, THOMAS e EVERITT, 2001). Em pombos, o estado de imobilidade tensa ou freezing apresenta as seguintes características: o animal permanece geralmente num canto da caixa experimental, corpo encolhido ou inclinado para frente, com base alargada, apoio do peito no piso ou numa parede, imóvel, desnível da asa em relação à cauda, extensão restrita do pescoço, cabeça direcionada para um ponto fixo, olhos abertos e respiração ofegante (REIS et al., 1999).
O aprendizado Pavloviano de medo é extremamente rápido, porque é adquirido em uma única sessão de condicionamento com poucas apresentações dos estímulos que são associados; é duradouro, pois o animal expressa ainda esse comportamento condicionado, dentro de uma janela de tempo relativamente grande (HALL, THOMAS e EVERITT, 2001). Além disso, o condicionamento Pavloviano do medo é um processo comportamental usado para estudar os mecanismos subjacentes ao aprendizado e memória de medo, devido à simplicidade de análise que oferece e, pelas possibilidades de associações a contextos específicos (FENDT e FANSELOW, 1999; MAREN, 2001).
A memória das relações aprendidas estabelece-se por meio de interações entre um número de estruturas que compõem um circuito neural, ou seja, o conjunto de entradas e saídas neurais, e de sistemas de armazenamento que garantem a organização de respostas de adaptação ao meio ambiente (SANDERS, WILTGEN e FANSELOW, 2003).
A memória de eventos aversivos, tal como qualquer outra memória, pode ser classificada em duas formas distintas quanto à duração: memória de curto-prazo, com a duração de segundos, minutos e horas; e memória de longo-prazo que persiste por horas, dias e mesmo semanas (PANG e LU, 2004) com a duração de pelo menos 24 horas (KANDEL, SCHWARTZ e JESSEL, 2000). Uma característica fundamental que distingue a memória de curto e a de longo-prazo é que esta última depende de mecanismos de síntese de novas proteínas (SQUIRE e BARONDES, 1973). As memórias de curto-prazo devem ser consolidadas para se tornarem memórias de longo-prazo. Esse fato relaciona-se diretamente à existência de fases distintas de processamento da memória que são: a codificação ou aquisição, a consolidação, e a recuperação ou evocação (NADER e MOSCOVITCH, 1997; SCHAFE et al., 2001; NADER, 2003).
A codificação se refere aos processos pelos quais as informações são recebidas, transformadas em códigos neurais (padrões de potenciais de ação) e processadas no sistema nervoso central. A informação codificada deve ser associada de forma significante e sistemática com os conhecimentos já estabelecidos na memória, de tal forma a permitir que se integre a nova informação com o que já é conhecido.
A consolidação se refere àqueles processos que alteram as informações recém-armazenadas e ainda instáveis, de forma a torná-las mais estáveis para o armazenamento de longo-prazo. Pode-se, assim, considerar que a consolidação é o processo pelo qual as memórias transientes tornam-se persistentes (NADER, 2003) e resistentes à desorganização. Para que a memória seja consolidada e armazenada por longo prazo é necessário que haja a expressão de genes e a síntese de novas proteínas, dando origem a mudanças estruturais que armazenam a memória
estavelmente ao longo do tempo (KANDEL, SCHWARTZ e JESSEL, 2000; HALL, THOMAS e EVERITT, 2001; NADER, 2003).
A recuperação ou evocação da memória se refere ao processo que permite acessar e usar informações armazenadas em diferentes regiões neurais. A recuperação da informação é mais efetiva quando ocorre no mesmo contexto no qual a informação foi adquirida e na presença das mesmas pistas (pistas de recuperação) que estavam disponíveis durante o aprendizado (LEE, EVERITT e THOMAS, 2004). Pode-se considerar que quando uma memória consolidada é evocada, novamente ela se torna instável e passa por um processo de reconsolidação (LEE, EVERITT e THOMAS, 2004; PANG e LU, 2004). A reconsolidação permitiria que uma memória já formada se altere, e, assim, poderia requerer uma outra fase de síntese protêica, tal como na consolidação. Nos últimos anos, vários grupos de pesquisa investigaram se as mesmas moléculas e vias medeiam a formação de uma memória e a sua reconsolidação (SHAFE et al., 2001; DEBIEC, LEDOUX e NADER, 2002; NADER, 2003; LEE, EVERITT e THOMAS, 2004).
1.2 O condicionamento clássico aversivo e o hipocampo
O conhecimento sobre os mecanismos celulares e moleculares, subjacentes aos processos de aprendizagem e memória, teve um grande desenvolvimento, por meio de estudos com modelos animais e de diferentes tipos de situações de aprendizagem, dentre as quais destacamos o condicionamento aversivo (ANTONIADIS e MCDONALD, 2000; SHAFE et al., 2001).
A amígdala foi enfatizada inicialmente pelos trabalhos de LeDoux (1990) e a partir daí foi considerada como um componente central do circuito neural do medo, um lugar de plasticidade importante para a formação e armazenamento de memórias
de medo (LEDOUX et al., 1990; PHILLIPS e LEDOUX, 1994; MAREN, AHARONOV e FANSELOW, 1997). De fato, o bloqueio da atividade na amígdala impede o condicionamento de medo para diferentes tipos de EC (MISERENDINO et al., 1990).
Hall, Thomas e Everitt (2001) evidenciaram que, em ratos, os neurônios dos núcleos basal, lateral e central da amígdala estão envolvidos na recuperação de associações de medo ao som, indicando um papel importante destes núcleos na recuperação de memórias relativas de medo ao som.
Posteriormente aos estudos referentes a amígdala, o hipocampo passou a receber maior atenção quanto ao seu envolvimento nesse processo de aprendizado e memória (KIM et al., 1991; PHILLIPS e LEDOUX, 1992; IZQUIERDO e MEDINA, 1993; FANSELOW e KIM, 1994; MAREN, AHARONOV e FANSELOW, 1997; HALL, THOMAS e EVERITT, 2001; PANG e LU, 2004). A amígdala e o hipocampo desempenham um papel importante na organização e no controle de diversas respostas motoras e vegetativas, relativas ao condicionamento aversivo, como por exemplo, a locomoção, o freezing e as vocalizações ultrassônicas (TEYLER e DISCENNA, 1985).
O trabalho de Kim e Fanselow (1992) foi um marco importante na análise do papel do hipocampo na consolidação de memória emocional aversiva em ratos. Nesse trabalho, foi usado o pareamento som-choque em ratos submetidos a lesões hipocampais 1, 7, 17 ou 28 dias, após o treino. Os animais com lesão 1 dia após o treino tiveram menor intensidade de freezing quando re-expostos ao contexto. No teste realizado em outro contexto com reapresentação do som, todos os grupos apresentaram freezing. Esses dados mostraram o papel dinâmico do hipocampo na formação de memórias e indicaram um processamento diferente para o
armazenamento das informações aversivas, relativas ao pareamento dos estímulos num contexto, e ao som, quando apresentado em outro contexto.
Muitos trabalhos emergiram, no sentido de analisar, como o contexto ambiental influencia o aprendizado e a memória, e principalmente as relações das funções do hipocampo na memória contextual (HOLT e MAREN, 1999; REIS et al., 1999; MAREN e HOLT, 2000). Na espécie humana também já é bem conhecida a influência da informação contextual sobre o comportamento (PENICK e SOLOMON, 1991). A informação contextual é dada por um estímulo multimodal, dessa forma, o contexto é caracterizado como uma configuração de estímulos (MAREN, AHARONOV e FANSELOW, 1997). Assim, o condicionamento de um contexto ambiental, implica na aquisição e na retenção do valor funcional de uma situação ou contexto que foi associado a eventos, podendo ambos, valor funcional e eventos, serem positivos ou negativos (ANTONIADIS e MCDONALD, 2000). Portanto, foi proposto que uma função do hipocampo seria montar uma representação contextual que, por ela mesma, pode se tornar associada com o EI, tal como um choque (FANSELOW, 2000). Assim, os mecanismos de plasticidade e de memória do hipocampo seriam fundamentais no circuito neural de condicionamento de medo (IZQUIERDO e MEDINA, 1993; PHILLIPS e LEDOUX, 1994; MAREN AHARONOV e FANSELOW, 1997; PANG e LU, 2004).
Existe um considerável conjunto de investigações que discutem a participação do hipocampo no condicionamento de medo. Embora haja estudos que indiquem que o hipocampo dorsal de mamíferos participaria fundamentalmente do condicionamento contextual aversivo, mas não do condicionamento a um estímulo discreto, como o som ou a luz (KIM e FANSELOW, 1992; MAREN, AHARONOV e FANSELOW, 1997), as evidências recentes indicam que o hipocampo dorsal participa do condicionamento
de medo ao som (QUINN et al., 2002; BAST, ZHANG e FELDON, 2003) e o hipocampo ventral também participa de forma importante no condicionamento ao contexto (ZHANG, BAST e FELDON, 2001).
De um modo geral, os estudos indicam que as memórias contextuais podem ser armazenadas em outras regiões, além do hipocampo. O’Reilly e Rudy (2001) sugerem que, em mamíferos, essas regiões seriam o hipocampo e o neocórtex, e que elas teriam diferentes características operacionais. Esses autores sugerem que o hipocampo é ideal para o aprendizado rápido e incidental que é necessário para o condicionamento contextual. Similarmente, Fanselow (2000) propôs que o hipocampo normalmente forma a representação contextual, mas o neocórtex poderia exercer essa função na sua ausência.
Embora muitos dos dados referentes à função do hipocampo no condicionamento de medo sejam provenientes de estudos com lesões, é necessário considerar que as lesões de uma estrutura neural causam danos estruturais nos corpos celulares e também destróem fibras de passagem. Assim, mesmo as lesões excitotóxicas podem causar superexcitação em estruturas para as quais se projetam e resultar em disfunção no próximo estágio do circuito neural específico (ANAGNOSTARAS, GALE e FANSELOW, 2002). Desse modo, uma alternativa eficaz para as intervenções que usam as lesões do tecido neural é mostrada pelos estudos que utilizam a intervenção farmacológica. De fato, por meio da inativação temporária, e o bloqueio da ação de neurotransmissores numa determinada região, é possível investigar as funções de núcleos específicos no circuito neural subjacente ao condicionamento de medo (SANDERS, WILTGEN e FANSELOW, 2003).
Muitos estudos focalizaram os efeitos de alterações funcionais em vias neuroquímicas no hipocampo e abrangeram a análise dos diferentes
neurotransmissores que atuam nos circuitos hipocampais (STIEDL et al., 2000 WALLENSTEIN e VAGO, 2001; GALÉ, ANAGNOSTARAS e FANSELOW, 2001; BAST, ZHANG e FELDON, 2003). Contudo, observa-se que na literatura sobre a neuroquímica hipocampal, os circuitos glutamatérgicos foram alvos de um elevado número de investigações, em diferentes laboratórios (BUTELMAN, 1988; VENERO e SANDI, 1997; ZHANG, BAST e FELDON, 2001).
1.3 Importância funcional da transmissão glutamatérgica no hipocampo para a aprendizagem, memória e plasticidade neuronal.
Dentre os vários neurotransmissores já descritos como presentes no hipocampo de mamíferos e de aves, destaca-se o glutamato, o qual parece exercer papel fundamental nos processos de aprendizagem e memória (KREBS, ERICHSEN, BINGMAN, 1991).
O glutamato é classificado como um neurotransmissor Tipo I, porque é um aminoácido simples, como a glicina e o GABA (ácido gama-amino butírico), perfazendo, em conjunto, cerca de 90% das sinapses existentes em todo o SNC de mamíferos (NICHOLLS, 1994, apud ROSINHA, 2003) 1. A importância da ação de sinapses glutamatérgicas como sendo o sítio de desencadeamento do processo de potenciação sináptica de longa duração cresceu a partir da descoberta de Bliss e Lomo (1973) de que um estímulo breve, mas de alta freqüência, em qualquer uma das três principais vias sinápticas do hipocampo aumenta a amplitude do potencial excitatório pós-sináptico (PEPS) no neurônio alvo. O hipocampo de mamíferos tem três principais vias sinápticas: a via perfurante oriunda do córtex entorrinal
1- NICHOLLS, D.G. Proteins, transmitters and synapses. Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, 1994.
(principal via de entrada de informações para o hipocampo) para o giro denteado, a via das fibras musgosas que contêm os axônios das células granulares que direcionam para as células piramidais na região CA3 do hipocampo e a via colateral de Schaffer, constituída por axônios glutamatérgicos das células piramidais da região CA3, que fazem sinapses com as células piramidais da região CA1 do hipocampo.
As evidências indicam uma importante participação dos circuitos glutamatérgicos hipocampais nos processos de memória que, envolvem a aquisição, consolidação e, pelo menos por algum tempo, a recuperação de medo ao contexto (SANDERS, WILTGEN e FANSELOW, 2003).
Os receptores sinápticos para o glutamato são classificados em duas grandes categorias diferentes de acordo com a sua funcionalidade: ionotrópicos ou metabotrópicos. Sumariamente, os receptores ionotrópicos são os do tipo AMPA (alfa-amino-3-hidroxi-5-metilixazole-4-ácido propiônico) kainato e NMDA (N- metil- D-aspartato) que funcionam como canais iônicos permeáveis aos íons sódio, potássio e cálcio (HUME et al., 1991). Os receptores metabotrópicos interagem com a proteína G determinando cascatas de segundos mensageiros, dentre as quais vias bioquímicas da enzima fosfolipase C; são classificados em oito tipos, sendo alguns inibitórios (MADDEN, 2002).
Os receptores pré-sinápticos do tipo kainato presentes nas sinapses das fibras musgosas podem iniciar uma cascata que libera Ca++ dos estoques intracelulares os quais são importantes na plasticidade de curto e longo-prazo (LAURI et al., 2003).
Os receptores NMDA são receptores para glutamato presentes em membranas pós-sinápticas do SNC e envolvidos nos mecanismos de LTP (LTP; do inglês long- term potentiation). A LTP constitui uma forma de plasticidade neuronal, propriedade cerebral que se relaciona com as transformações funcionais permanentes em
sistemas específicos de neurônios, como resultado de estímulos apropriados ou de suas combinações, como ocorre em situações de aprendizagem. Vários estudos demonstraram que a estimulação de alta freqüência de aferentes para o hipocampo leva a um reforçamento de longo-prazo da transmissão sináptica (STAUBLIN et al., 1989; SHAFFE et al., 2001; FUJISAKI et al., 2004). Como a LTP no hipocampo foi referida como tendo um papel preponderante nos fenômenos de plasticidade sináptica, cognição e memória, resulta que intervenções que alterem a funcionalidade desses receptores NMDA afetariam esses processos (KIM e FANSELOW, 1992; FANSELOW e KIM, 1994; BAKER e AZORLOSA, 1996; BAST, ZHANG e FELDON, 2003).
Os receptores NMDA são receptores e canais iônicos de estrutura pentamérica formados a partir de duas subunidades; NR1 e NR2 (NR2A, 2B, 2C e 2D), podendo existir em diferentes isoformas. São altamente permeáveis ao Ca++, bem como ao Na+ e K+ (HUME, DINGLEDINE e HEINEMAMM, 1991; GOOSENS e MAREN, 2004). A sua abertura é voltagem-dependente, pois no potencial da membrana em repouso (-65mV), o canal receptor NMDA é bloqueado por Mg++. Mas, quando a membrana é despolarizada na presença do glutamato, o Mg++ é expelido do canal por repulsão eletrostática, permitindo que Na+ e Ca++ entrem. A entrada de cálcio pode ativar cascatas de segundos mensageiros, dependentes de cálcio.
Assim, durante o processo de aprendizagem ocorre a ativação de receptores glutamatérgicos AMPA, em seguida, os NMDA que poderiam induzir a LTP. A ativação desses receptores levaria a um aumento da concentração de Ca++ no neurônio pós-sináptico ativando os receptores metabotrópicos e as vias de segundos mensageiros, como as proteínas cinase serina-treonina dependente de Cálcio, a proteína cinase dependente de Cálcio/Calmodulina (CAMKII), a proteina cinase C
(PKC) e a proteína tirosina cinase-fyn (IZQUIERDO et al., 1999; KANDEL, SCHWARTZ e JESSEL, 2000). A ativação dessas cascatas bioquímicas caracterizando a fase inicial da LTP resulta na atividade de enzimas que controlam a expressão de outros mensageiros, como o óxido nítrico (NO). O NO atua sobre o terminal pré-sináptico, aumentando a liberação do neurotransmissor (glutamato), o que mantém a potenciação de força sináptica (MAREN e BAUDRY, 1995; JOHNSON, BAKER e AZORLOZA, 2000). Os segundos mensageiros iniciam mecanismos de transcrição gênica e de tradução de novas proteínas que são necessárias para a manutenção de mudanças a longo-prazo nas sinapses, fosforilando a proteína CREB (elemento de resposta AMPc ligador de proteína) que induz a expressão de famílias de genes de expressão imediata (GEIs; por exemplo Krox 24).
1.4 As relações entre o hipocampo, os genes de expressão imediata (GEIs), a aprendizagem e a memória
Os genes de expressão imediata são uma classe de genes que são ativados rápida e transitoriamente em resposta a atividade neuronal. Esses GEIs, que seriam as vias de terceiros mensageiros - dentre eles o zenk , e seu produto o fator de transcrição ZENK, ativam genes de expressão tardia responsáveis pela expressão de proteínas formadoras de receptores, proteínas estruturais e sinapsinas causando alterações no fenótipo sináptico, ou seja, a plasticidade sináptica, formando o traço de memória (RICHARDSON et al., 1991; LANAHAN e WORLEY, 1998; WALTON et al., 1999; WALLENSTEIN, VAGO e WALBERER, 2001; BRITO, 2002).
São geralmente descritos como GEIs regulatórios, os quais codificam proteínas que podem aumentar ou diminuir à montante (na direção 5’ na molécula do DNA) a expressão do gene, ou como GEIs efetores, que codificam proteínas que têm um
papel funcional mais diretamente relacionado com a sinapse (DAVIS, BOZON e LAROCHE, 2003).
Lanahan e Worley (1998) estimaram que aproximadamente 30-40 genes são GEIs neuronais e desses, 10 a 15 são genes regulatórios tais como o c-fos e zif/268 ou zenk, enquanto os demais são genes efetores tais como arg3.1, Homer e BDNF (DAVIS, BOZON e LAROCHE, 2003). No presente trabalho será usada a terminologia zenk para nomear o gene e ZENK para nomear o produto da sua expressão.
Os GEIs foram originalmente descritos como oncogenes virais (HANLEY, 1988), os quais eram necessários para a replicação viral e o desenvolvimento de tumores. Mais tarde foi evidenciado que esses genes estavam presentes no DNA de todos os vertebrados e que respondiam aos fatores de crescimento ou mitógenos. Os GEIs poderiam constituir uma resposta genômica precocemente requerida para o disparo dos mecanismos subjacentes às modificações persistentes das células (MORGAN et al.,1987). Isso explicaria a sua ativação rápida e transitória, e sua resistência aos inibidores de síntese protêica. Os GEIs neuronais codificam fatores de transcrição, proteínas citoesqueléticas, fatores de crescimento, enzimas metabólicas, e proteínas envolvidas em sinais de tradução (LANAHAN e WORLEY, 1998). Os fatores de transcrição codificados por GEIs como o zenk, atuam como mensageiros relacionados à atividade neural de curto prazo, com alterações no nível de transcrição gênica (JOHNSON, 2000). Essas modificações em neurônios teriam funções biológicas importantes, tais como: manter ou estabilizar a plasticidade neuronal e a formação de memórias de longo prazo. Clayton (2000) postulou uma hipótese para o papel dos GEIs na consolidação de memória, comparando o funcionamento da ativação dos GEIs a um potencial de ação fisiológico, embora em um tempo e curso muito mais lentos. A ativação dos GEIs poderia ser considerada como um potencial
de ação genômico, que funcionaria para integrar múltiplos estímulos aplicados em neurônios individuais dentro do circuito.
O zenk, também conhecido como zif/268, Krox-24, NGFI-A, egr1e TIS 8, foi um dos GEIs inicialmente clonado e encontrado no cérebro (COLE et al., 1989). O gene de expressão imediata zenk codifica o fator de transcrição ZENK, com alta expressão cerebral. Os seus genes alvos ainda não foram identificados, embora já se conheça a seqüência específica de DNA (GCCGG/TGGGCG) com alta afinidade onde se liga ativando a expressão gênica (CHRISTY e NATHANS, 1989, apud BRITO, 2002) 2. O condicionamento Pavloviano do medo é um processo comportamental complexo que envolve a ativação neuronal polissináptica, e a ação integrada de diferentes áreas cerebrais. A atividade desses neurônios ativados polissinapticamente pode ser evidenciada pela marcação da expressão desses genes através da imunorreatividade às proteínas controladas por eles (HALL, THOMAS e EVERITT, 2001).
Evidências experimentais suportam a hipótese de que a regulação transcricional rápida do gene zenk seja um mecanismo molecular-chave implicado na formação de memória de longo-prazo (RICHARDSON et al., 1991; ROBERTS e HIGGINS, 1996). No trabalho de Hall, Thomas e Everitt (2001) foi analisada a expressão do zif/268 (zenk) no hipocampo e na amígdala de ratos durante a recuperação de memória de medo ao contexto ou ao som, 24 h ou 28 dias após o teste. Houve elevada ocorrência de freezing condicionado na recuperação 24 h após o treino e forte expressão de zenk na camada CA1, quando comparados aos animais controles. Não houve mudanças na expressão do zenk no giro denteado, indicando
2- CHRISTY, B.; LAU, L.; NATHANS, D. DNA binding site of the growth factor-inducible protein Zif/
268. Proc. Acad. Sci. USA., v. 86, p. 8737-8741, 1989.
uma ativação diferenciada de regiões hipocampais. No grupo 28 dias observou-se que os animais não apresentaram diminuição de freezing ao contexto quando comparados com os animais testados após 24 h, porém não houve diferença entre os grupos na expressão do zenk após 28 dias. Os dados sugeriram que os neurônios da região CA1 do hipocampo têm um papel limitado no tempo para a consolidação e recuperação da memória. Uma explicação possível seria que os traços de memória se tornam consolidados em áreas corticais extra-hipocampais ao longo do tempo, com suas recuperações se tornando independentes do hipocampo (BONTEMPI et al., 1999; TENG e SQUIRE, 1999).
Num outro estudo, Lee, Everitt e Thomas (2004) analisaram se a consolidação da memória é dependente de zif/268 (zenk) A infusão de oligodesoxinucleotídeos (ODN) anti-senso e de ODN missenso de ZENK no hipocampo, 90 min antes do condicionamento, não ocasionou efeito sobre o freezing condicionado ao contexto medido 24 h mais tarde, sugerindo que o ZENK não é necessário para a consolidação de condicionamento de medo ao contexto. Para testar se o zenk estaria envolvido na reconsolidação de memória de medo contextual após sua reativação, os ratos foram infundidos com ODN anti-senso de ZENK 90 min antes da reativação de memória de medo contextual. Comparados aos controles, que receberam infusão de ODN missenso de ZENK, os animais experimentais apresentaram amnésia ao contexto para o teste de pós-reativação de retenção, realizado num período maior que 24 h depois do condicionamento, mas não apresentaram amnésia ao teste realizado 24 h após o condicionamento. Os dados sugeriram que o zenk é necessário especificamente para a reconsolidação, mas não na consolidação de memória dependente de hipocampo.
Brito (2002) investigou a marcação imuno-histoquímica do ZENK para avaliar a sua participação nos processos de aquisição (memória de curto prazo) das
informações envolvidas no condicionamento clássico aversivo em pombos. Os animais foram treinados numa sessão de 20 min. Os resultados mostraram aumento na ocorrência de freezing no grupo experimental, que foram treinados com associação som-choque e, no grupo que foi exposto apenas ao choque. Houve expressão diferenciada de ZENK, com maior densidade de núcleos marcados no hipocampo ventro-medial no grupo experimental som-choque em relação aos demais grupos. No hipocampo dorsal a densidade de marcação foi significativamente maior nos grupos som-choque e grupo choque em relação aos grupos controles. Na região ventro-lateral, não houve diferença significativa entre os grupos. Esses resultados podem ser considerados como evidências de indução da expressão desse gene, e portanto, de ativação neuronal do hipocampo de pombos induzida por aprendizagem de medo condicionado. Assim, os resultados do trabalho de Brito (2002) sugeriram que a expressão aumentada desse gene poderia estar envolvida na aquisição dos traços de memória de longo-prazo, o que gerou a continuidade da mesma linha de pesquisa usada no presente trabalho.
1.5 Efeitos amnésicos do MK-801 no aprendizado e memória hipocampo-dependentes
A ativação dos receptores NMDA é bloqueada pelo MK-801 (5R,10S-(+)-5-metil-10,11-dihidro-5H-dibenzo [a,d] ciclohepteno-5,10-imino maleato), descrito como um antagonista não competitivo do receptor NMDA. O antagonista não competitivo impede a ação do agonista, ou seja, quando se liga a um outro sítio específico do receptor impede a ação do agonista (GILMAN et al., 1993). O MK-801 se liga a um sítio específico dentro do poro do canal aberto, que é distinto do sítio de ligação do Mg++ e, portanto, não precisa competir com ele para se ligar ao canal e nem com o
glutamato para se ligar ao receptor (BAKER e AZORLOSA, 1996; ZHANG, BAST e FELDON, 2001)
Muitos estudos usaram o MK-801 como droga de intervenção no sistema de transmissão glutamatérgico, seja por administração sistêmica ou por infusões intracerebrais (XU e DAVIS, 1992; ZHANG, BAST e FELDON, 2001; GOULD, MCCARTHY e KEITH, 2002).
Os antagonistas não-competitivos de receptores NMDA, como o MK-801, mostraram eficiência no bloqueio da plasticidade neural (STAUBLIN et al., 1989; WHISHAW e AUER, 1989). Vários estudos mostraram, ainda, que essa classe de compostos prejudica o desempenho em testes de aprendizagem, principalmente no que diz respeito à fase de aquisição (BUTELMAN, 1988; STAUBLI et al., 1989; WHISHAW e AUER, 1989). Na década de 1990, foram realizados estudos com administração de MK-801 em animais de diferentes espécies para analisar mais precisamente os seus efeitos sobre os processos de aprendizagem e memória.
Butelman (1988) analisou o desempenho de ratos em tarefas de aprendizado espacial dependente de hipocampo. Os animais experimentais receberam MK-801, i.p. nas doses: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 mg/Kg, imediatamente antes de serem testados. Os controles receberam igualmente o mesmo volume de veículo (solução de cloreto de sódio a 0,75%). Foi determinado que as doses 0,1 e 0,2 mg/kg de MK-801 não causavam aumento de atividade motora nos ratos. Assim, os animais foram previamente treinados no labirinto radial de oito braços. Antes do teste, os animais receberam 0,1 ou 0,2 mg/kg de MK-801. Os resultados indicaram que essas doses causaram prejuízos na eficiência das tarefas, sem ocorrer efeitos motores.
Pitkänen et al (1995) investigaram a participação do receptor NMDA em duas tarefas de aprendizado e memória espacial, no labirinto radial e no labirinto aquático
de Morris. A administração de MK-801 (0,1 mg/kg, i.p.) antes do teste prejudicou a aquisição da resposta de fuga no labirinto aquático, aumentando a latência e a distância percorrida para encontrar a plataforma. Além disso, no labirinto radial, o MK-801 alterou a locomoção, aumentou as latências, diminuiu a freqüência de entradas no braço correto e aumentou o número de reentradas nos braços do labirinto já visitados. Baker e Azorlosa (1996) treinaram ratos em condicionamento Pavloviano do medo, num procedimento de resposta emocional condicionada. Na terceira sessão de treino ao bebedouro, ocorreu o condicionamento, após 20 min de acesso à água. Cada tentativa consistia de 10 s de luz (EC) pareada com choque nas patas de 0,5 s (EI), apresentado 9,5 s após o início da luz. O medo à luz foi extinto durante 5 dias nos quais houve cinco apresentações de luz, sem o choque. O tratamento dos animais com MK-801, por administração subcutânea, ocorreu após a extinção. A sessão de recondicionamento ocorreu no dia seguinte após a última sessão de extinção. A administração de MK-801, em duas doses 0,1 ou 0,05 mg/Kg ocorreu cinco min antes do recondicionamento. Os resultados mostraram que o MK-801 interferiu com o recondicionamento, o qual foi bloqueado com a dose de 0,1 mg/Kg de MK-801.
Gould, McCarthy e Keith (2002) mostraram os efeitos de injeções subcutâneas de MK-801, antes ou após o treino em condicionamento de medo ao som e condicionamento de medo contextual, em ratos. Quando administradas antes do treino, as injeções de MK-801 (0,3 e 1,0 mg/kg) prejudicaram o condicionamento ao medo contextual, mas não o condicionamento de medo ao som. As injeções pós-treino não prejudicaram o condicionamento de medo ao som ou ao contexto, sugerindo que os receptores NMDA estariam envolvidos na aquisição de condicionamento de medo contextual, mas não na consolidação de medo contextual.
Os efeitos do MK-801 foram analisados também em ratos, de modo mais específico, em trabalhos que usaram a infusão intracerebral.
Zhang, Bast e Feldon (2001) examinaram o condicionamento clássico aversivo ao som e ao contexto, após bloqueio dos receptores NMDA no hipocampo ventral em ratos. Foram realizadas infusões bilaterais, antes do condicionamento de MK-801 (6,25 µg/lado). O condicionamento de medo foi acessado usando uma mensuração automática de freezing. O MK-801 bloqueou seletivamente o condicionamento de medo ao contexto, indicando que o condicionamento clássico de medo ao contexto, mas não ao som, requer ativação dos processos mediados pelos receptores NMDA no hipocampo ventral.
Em outro estudo, Bast, Zhang e Feldon (2003) caracterizaram os efeitos do bloqueio dos receptores NMDA na região dorsal do hipocampo por infusão local bilateral de MK-801 (6,25 µg/lado) ou de NMDA (0,7µg/lado), respectivamente, em ratos submetidos ao condicionamento clássico de medo ao som e ao contexto. Foi usado o freezing para medir o condicionamento de medo. Um grupo de animais foi submetido ao condicionamento de som-choque pareados, como também um grupo condicionado ao choque não sinalizado, que recebeu a infusão ou de NMDA ou de MK-801 antes do condicionamento. Houve diminuição de freezing ao contexto de condicionamento, indicando a função do hipocampo dorsal nesse processo. Contudo, no teste ao som num novo contexto, o grupo MK-801 não mostrou prejuízo de memória aversiva, embora o grupo NMDA tivesse forte redução de freezing ao som, sugerindo o envolvimento do hipocampo dorsal no condicionamento ao som.
Os resultados desses trabalhos podem sugerir que a ativação de receptores NMDA no hipocampo dorsal e ventral estaria envolvida na aquisição de memória de
medo ao contexto em ratos, enquanto que a ativação dos receptores NMDA no hipocampo dorsal estaria envolvida na aquisição de memória de medo ao som.
Outro conjunto de investigações mostra que os efeitos do MK-801 também foram analisados em aves, por infusão intracerebral.
Assim, Venero e Sandi (1997) mostraram em pintainhos de um dia, os efeitos do MK-801 cuja memória de longo-prazo foi anteriormente facilitada por corticosterona. Os animais foram previamente treinados em aprendizado de tarefa de esquiva passiva, na qual os pintainhos bicavam uma bolinha revestida com uma substância desagradável (usando 100% de metilantranilato como agente aversivo) e assim, aprendiam a não bicar uma bolinha similar durante alguns dias ou semanas. Os animais controle recebiam somente o veículo (solução salina contendo 1% de etanol). A droga MK-801 foi diluída em salina estéril em uma concentração de 100 nM, da qual 5 µl foram injetados em cada hemisfério. A injeção de corticosterona foi feita 30 ou 60 min após o treinamento. O MK-801 foi injetado 10 min antes do treinamento. O grupo veículo-corticosterona aumentou a retenção de longo-prazo da resposta de esquiva, comparada com o controle (veículo-veículo). O grupo MK-801-corticosterona não apresentou diferenças na resposta de esquiva em relação aos controles, pois o MK-801 eliminou os efeitos de facilitação da corticosterona. O resultado desse trabalho sugere que a ativação dos receptores NMDA no hipocampo de aves pode estar envolvida na evocação da memória de longo prazo.
Os efeitos do MK-801 foram analisados em peixes da espécie Carassius auratus. por Xu e Davis (1992). Eles mostraram que a administração intracranial de MK-801 bloqueou o aprendizado de condicionamento clássico de medo nesses animais. O prejuízo de aprendizado foi diminuído quando os peixes receberam um pré-treino de menor duração sugerindo que somente a fase precoce do
condicionamento pode ser sensível ao bloqueio pelo MK-801. Xu (1997) investigou a possibilidade de que o condicionamento clássico em Carassius auratus consistia de duas fases sucessivas, e que somente a fase inicial dependia criticamente da função dos receptores NMDA. Uma série de experimentos mostrou que os efeitos da amnésia anterógrada de MK-801 foi diminuída ou eliminada quando o peixe recebia pré-treinamento consistindo de seis ou doze tentativas de condicionamento, respectivamente. Com treinamento superior a doze tentativas o aprendizado foi insensível ao 801. Os resultados indicaram que o aprendizado sensível ao MK-801 é associativo, e que esta droga seletivamente prejudicou o aprendizado da contigüidade de EC -EI.
Esses estudos evidenciam que a ação do MK-801, como um bloqueador do receptor NMDA, interfere no aprendizado associativo, cujos estímulos incondicionados e condicionados são apresentados pareados, com relação de contingência e contigüidade, tal como no condicionamento clássico de medo utilizado no presente trabalho.
1.6 A caracterização do sistema hipocampal em aves
Da mesma maneira que as investigações do hipocampo em mamíferos, os estudos em aves têm abordado questões relacionadas com os processos de aprendizagem e memória, especialmente as contextuais e espaciais.
Os resultados gerais dessas investigações sugerem similaridades funcionais, entre o hipocampo de aves e de mamíferos para diversos tipos de aprendizagem (BINGMAN et al., 1989; REIS et al., 1999; COLOMBO e BROADBENT, 2000; WATANABE, 2001). Lesões hipocampais em pombos e em ratos confirmam essa idéia (COLOMBO e BROADBENT, 2000).
Em mamíferos, o hipocampo está localizado bilateralmente na região do lobo temporal, fazendo parte do sistema límbico. É formado por uma dobra interna da parte ínfero-medial do próprio lobo temporal que se curva em direção ao ventrículo lateral.
A região especificamente referida como hipocampo interconecta-se a várias estruturas que são funcionalmente relacionadas, sendo possível admitir-se a presença de uma formação hipocampal em aves. A formação hipocampal de mamíferos é constituída das seguintes regiões: hipocampo (Corno de Amon), o giro denteado, o subículo e o córtex entorrinal (BUTLER e HODOS, 1996).
Nas aves, em uma das primeiras tentativas para a identificação das regiões que formam o hipocampo, a porção dorso-medial do cérebro anterior foi dividida em dois grandes segmentos: a área para-hipocampal (APH) localizada dorsolateralmente e o hipocampo (Hp) propriamente dito, localizado ventro-medialmente (CAMPBELL e HODOS, 1970). Essa divisão foi sustentada pelas regiões possuírem dois padrões distintos de camadas celulares que as diferenciavam. Esses autores descreveram o hipocampo como a continuação do manto cortical com alguma laminação, ou seja, com presença de camadas celulares. Porém, a delimitação de uma fronteira entre a área para-hipocampal e o hipocampo não ficou clara (CAMPBELL e HODOS, 1970).
Ambos, hipocampo de mamíferos e de aves, derivam do córtex dorso-medial, do mesmo ancestral de linhagem aminiota, com uma correspondência filogenética (CAMPBELL e HODOS, 1970). Destaca-se também a presença de diferentes tipos celulares, e uma estreita proximidade ao ventrículo lateral (KARTEN e HODOS, 1967; BINGMAN et al., 1989; SZÉKELY, 1999).
Apresentam padrões similares de vias aferentes e eferentes, ou seja, a região hipocampal recebe projeções do hipocampo contralateral, tálamo, hipotálamo, locus ceruleus e núcleos da rafe, e projeta-se para o núcleo septal, banda diagonal e
hipotálamo (BENOWITZ e KARTEN, 1976; KRAYNIAK e SIEGEL, 1978; CASINI, BINGMAN e BAGNOLI, 1986; BINGMAN et al., 1989; SHIMIZU e KARTEN, 1990; ATOJI e WILD, 2001; ATOJI et al., 2002).
Apesar dos aspectos anatômicos similares entre o hipocampo de aves e mamíferos, há também os aspectos não similares entre eles, tais como: as projeções da região hipocampal de aves para o complexo amigdalóide (anteriormente referido como archistriatum) se dá de forma indireta, através da área septal contralateral, que também conecta o hipocampo ao hipotálamo lateral. Nos mamíferos essas projeções são diretas. O hipocampo de aves recebe projeções indiretas do complexo amigdalóide, através de projeções desta região para a área para-hipocampal, que por sua vez, possui conexões recíprocas com o hipocampo (Atoji et al., 2002). Nos mamíferos o hipocampo recebe essas projeções de forma direta.
1.6.1 Aspectos neuroquímicos da formação hipocampal em aves
Para descrever com maior precisão a organização da formação hipocampal de aves, Krebs et al. (1991) dividiram-na em quatro regiões, que foram posteriormente ampliadas para seis subdivisões, com os estudos de ERICHSEN et al. (1991).
O mapeamento de células imunorreativas a diferentes neurotransmissores sugeriu então, uma divisão hipocampal em seis áreas, distribuídas no eixo ântero-posterior, entre os níveis A3.75 e A9.00 do Atlas Estereotáxico de Cérebro de Pombos de Karten e Hodos (1967), (KREBS et al., 1991, ERICHSEN et al., 1991). A área das fibras do trato medial é composta por fibras aferentes que atravessam a junção septohipocampal e se estendem dorsalmente em direção à região ventro-medial da formação hipocampal. Na área em forma de “V” são evidenciadas duas faixas de células, quando se usa a técnica de Nissl, nas porções laterais da região
medial. Estas apresentam grandes células piramidais (PISANA, 1986). A área medial entre o “V”, inclui a parte inferior da região dorso-medial e a região ventro-medial. A área das células VIP (peptídeo intestinal vasoativo) é a região que apresenta, células VIP positivas localizadas ventralmente à região dorso-medial. A área dorso-medial é a região que ocupa as áreas mais dorso-mediais da formação hipocampal e a área lateral é a região lateral à área medial, que seria o limite entre o hipocampo e a área parahipocampal. Além disso, há uma outra área, que é identificada por células imunorreativas contra o anticorpo para a substância P, delimitando a fronteira-SP (SPf) lateral ao hipocampo, um possível limite com a área para-hipocampal.
Assim, paralelos podem ser traçados entre algumas áreas da região hipocampal de aves e de mamíferos.
1.6.2 Relações entre áreas das regiões hipocampais de aves e de mamíferos
A área em forma de “V” no encéfalo de pombo poderia relacionar-se ao Corno de Amon no mamífero, em ambas as regiões são encontradas as grandes células piramidais circundadas por outras em forma de cesto (PISANA 1986). Estas células, nas aves, estendem campos dendríticos perpendiculares aos braços do “V”. Nas células adjacentes às células piramidais nas aves, foi evidenciada a presença de colecisticinina, semelhante ao que ocorre no Corno de Amon e nas camadas de células granulares do giro denteado nos mamíferos (ERICHSON et al., 1991).
A área medial do hipocampo de aves poderia relacionar-se à região hilar em mamíferos, as células dessas regiões são morfologicamente semelhantes (ANDERSON e REINER, 1990). A área das células VIP em pombos poderia relacionar-se às camadas granulares do giro denteado em mamíferos, porque neste local também ocorre marcação imunopositiva ao anticorpo contra VIP (KÖLER, 1983).
Além disso, também pode ser associada à área das fibras do trato medial ao alveus (camada alvear) e fimbria-fórnix do mamífero, pois em ambas as regiões aparecem aferentes colinérgicos, serotonérgicos e catecolaminérgicos que formam os tratos ali existentes (KÖLER, 1983).
Metzger (2002) descreveu a presença marcante de fibras serotonérgicas na porção imediatamente inferior à região dorso-medial, o que repete o padrão encontrado em mamíferos, onde as camadas granulares relacionam-se intimamente ao giro denteado. Com relação às fibras musgosas do hipocampo, apesar de várias similaridades, ainda não foi encontrada no hipocampo de pombos, uma região equivalente à dos mamíferos (ERICHSEN, BINGMAN e KREBS, 1991).
De acordo com critérios neuroquímicos, agora se define a região hipocampal em pombos como aquela área entre o ventrículo lateral e a parede medial, lateralmente separada da área parahipocampal por uma região imunorreativa aos anticorpos contra substância P, leucina- encefalina e enzima tirosina-hidroxilase (ERICHSEN et al., 1991 apud ROSINHA, 2003) 3.
1.7 Justificativa do trabalho
O presente trabalho, tais como outros já desenvolvidos no nosso laboratório, baseia-se na consideração de que são necessários estudos que investiguem de forma integrada em aves e em mamíferos, algumas questões centrais para o entendimento das funções básicas do hipocampo (EICHENBAUM, OTTO e COHEN, 1992). Dentre estas, estão as questões relativas aos tipos de memória que são essenciais ao
3- ERICHSEN, J. T.; BINGMAN, V. P.; KREBS, R. J. The distribution of neuropeptides in the Dorsomedial Telencephalon of the pigeon. J. Comp. Neurol., v. 314, p. 478-492, 1991.
sistema hipocampal, o envolvimento do hipocampo na aquisição, consolidação e armazenamento dos diferentes tipos de informações e os mecanismos celulares e moleculares relacionados a esses processos. Nesse sentido, o sistema hipocampal, cuja importância é bem descrita em estudos com mamíferos, também é estudado em aves para investigar questões que, principalmente, envolvem relações espaciais e contextuais de aprendizagem e memória. De um modo geral, os estudos com lesões hipocampais em ratos e em pombos sugerem uma similaridade funcional entre o hipocampo de mamíferos e de aves, em diversos tipos de aprendizagem (BINGMAN et al., 1989; REIS et al., 1999; COLOMBO e BROADBENT, 2000; WATANABE, 2001). Como já citado anteriormente, Brito (2002) relatou a ativação da expressão do GEI zenk no hipocampo de pombos submetidos ao condicionamento clássico aversivo. Além disso, foi verificada uma ampla distribuição de receptores de glutamato do tipo AMPA em toda a formação hipocampal de pombos (ROSINHA, 2003).
Assim, baseando-se nas evidências experimentais apresentadas nas seções anteriores, considera-se que a investigação dos processos de plasticidade neuronal, no hipocampo de pombos, relativos à aquisição, consolidação e à recuperação da memória de medo contextual, poderá contribuir para o conhecimento dos eventos celulares e moleculares subjacentes às suas diferentes fases.
2 OBJETIVOS
O presente trabalho teve três objetivos principais. O primeiro foi investigar, em pombos, os efeitos da administração, i.p., de um antagonista do receptor de glutamato NMDA, o MK-801 no condicionamento aversivo a um contexto em que ocorreram associações som-choque. O segundo objetivo foi verificar, por meio da marcação imuno-histoquímica de células ZENK-positivas, a ativação da expressão de zenk no hipocampo de pombos, durante o teste ao contexto do condicionamento aversivo. O terceiro objetivo foi avaliar se a administração do MK-801 alteraria a marcação de células ZENK-positivas em diferentes regiões do hipocampo dos pombos testados.
3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Sujeitos
Foram utilizados pombos, machos, adultos, aproximadamente com 18 meses de vida, com peso médio de 300g, da espécie Columba livia, adquiridos de um único criadouro local. Ao chegarem ao biotério, os animais foram banhados em água corrente usando um xampu neutro, os olhos e bicos examinados e quando necessário, tratados com violeta de genciana. Foram então alojados em grupos de 4 a 5, em gaiolas-viveiro (50 x 50 x 50 cm), por 7 dias. Nesse período foram submetidos a procedimentos profiláticos para controle de parasitas e verminoses com Licor de Cacau (1 gota no bico, durante 4 dias) e o vermífugo Thuya (diluído na água do bebedouro) durante 3 dias. Após essa semana, os animais foram alojados em gaiolas individuais (50 x 50 x 50 cm). Durante todo o período do experimento os animais receberam água e alimentação à vontade e foram mantidos sob ciclo claro-escuro de 12:12h, com luz acesa às 06:00h e apagada às 18:00h. A alimentação consistia de uma mistura de quirera de milho, semente de girassol, ração para pombos, areia e farinha de ostra. Além disso, receberam complementação com o complexo vitamínico Vitalgold diluído na água do bebedouro, uma vez por semana. Todos os procedimentos seguiram o protocolo experimental de respeito aos princípios éticos em experimentação animal aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, sob o protocolo número 834-2.
Os pombos foram distribuídos, de forma aleatória, em cinco grupos:
1- Grupo manipulação (GM; n=4) animais que foram submetidos à manipulação, ou seja, pesados e devolvidos às suas gaiolas-viveiro, sem exposição à câmara experimental ou aos estímulos.
2- Grupo controle-contexto (GCC; n=7): animais que foram expostos ao contexto, por 20 min, sem apresentação de estímulos.
3- Grupo controle-randômico (GCR; n=6): expostos a uma seqüência de estímulos som e choque não pareados e distribuídos ao acaso ao longo da sessão.
4- Grupo condicionado - salina (GCS; n=6): administração via intraperitonial (i.p.) de salina (solução aquosa de cloreto de sódio a 0,9%) 30 min antes da sessão de condicionamento.
5- Grupo condicionado - MK-801 (GCMK; n=6): receberam, a administração i.p. de MK-801, 30 min antes da sessão de condicionamento.
3.2 Procedimentos
3.2.1 Drogas e reagentes
O composto MK-801 (RBI, USA) foi dissolvido em solução salina na concentração de 0,01mg/ml. Os animais experimentais (GCMK) receberam a droga por via intraperitonial ( 0,1ml/100g de peso corporal). Os animais do GCS receberam 0,1ml/100g de peso de solução salina. Os animais dos demais grupos não foram submetidos a tratamento com MK-801 ou salina, servindo como controles do GCS. A solução administrada aos animais era preparada no dia do experimento.
3.2.2 Adaptação às condições do biotério
Após a mudança para as gaiolas-viveiro individuais, os animais foram submetidos à adaptação às condições do biotério por um período mínimo de 15 dias, sendo mantidos sob temperatura média de 25oC, ciclo-claro escuro 12:12H e com alimentação ad libitum.
3.2.3 Implante de eletrodos púbicos
O animal era retirado do biotério e anestesiado por inalação de Sevoflurano. Em seguida, o pombo era manipulado de modo a expor o osso da pelve. Com auxílio de algodão embebido em solução de álcool era feita a assepsia local. Um fio de aço ortodôntico (0,5 mm de espessura, 10 cm de comprimento) era introduzido ao redor de cada osso púbico e conectado a fios ligados a uma pequena tomada fixa numa jaqueta de couro sintético no dorso do animal, encaixando-se suas asas em cada abertura.
3.2.4 Adaptação às condições do laboratório
Os animais de todos os grupos foram pesados e habituados por quatro dias consecutivos que precederam o dia do treino. Os animais foram colocados em uma câmara que media 60 x 60 x 60 cm, com três paredes e teto revestidos de fórmica branca, a parede frontal de vidro unidirecional e com iluminação feita por lâmpada fria, fosforescente, onde permaneceram por 40 min sem receber qualquer estimulação.
3.2.5 Treino em condicionamento som-choque
Para a realização das sessões experimentais de treino, foi utilizada uma câmara de observação (30 x 30 x 40 cm), com paredes revestidas por chapas galvanizadas e a porta frontal construída com um espelho de visão unidirecional emoldurado por madeira.
Nesta câmara havia um alto-falante embutido no teto, ligado a um áudio-estimulador, com variação de freqüência entre 125 e 8000 Hz; como também um fio para entrada de energia. Os choques elétricos foram aplicados através dos eletrodos instalados no osso pélvico do animal, bilateralmente, utilizando uma fonte (Foringer, USA), controlada por marcadores de tempo eletromecânicos. A câmara experimental
foi iluminada com uma lâmpada vermelha de 25 W, em sua parede lateral. Todas as sessões foram registradas por um sistema de filmagem em fitas VHS (filmadora Panasonic CCD-TR377).
O treinamento em condicionamento clássico som-choque foi feito em uma sessão de 20 min. Os pombos foram removidos de suas gaiolas, transportados até o laboratório, pesados, injetados com a solução de MK-801 (GCMK) ou salina (GCS) e reconduzidos às gaiolas-viveiro, 30 min antes do início do treino.
Durante essa sessão ocorreu a apresentação de um som (1000Hz, 83dB, 1-s) cujo término coincidia com a apresentação de um choque (10mA, 35-ms). Os estímulos foram apresentados no quinto, décimo e décimo quinto min durante a sessão de 20 min.
O treino dos animais do grupo controle-randômico (GCR) consistiu numa sessão de 20 min, na qual os pulsos sonoros e os choques foram apresentados sem relação de contingência e/ou contigüidade na seguinte seqüência: som no segundo min, choque no quinto min, choque no nono min, som no décimo segundo min, som no décimo terceiro min e choque no décimo sétimo min. Os pombos do grupo controle-contexto (GCC) foram expostos somente ao controle-contexto de condicionamento na câmara experimental por 20 min, mas não receberam nenhum estímulo. Após o treino os animais eram reconduzidos às suas gaiolas-viveiro.
3.2.6 Teste ao Contexto de Condicionamento
O teste de memória aversiva ao contexto, ou de medo condicionado foi realizado 24 h após o treino. Nesse teste os animais, GCC, GCR, GCS e GCMK foram recolocados na mesma câmara de condicionamento som-choque durante 20 min sem apresentação programada de qualquer estímulo. Após o teste, todos foram
reconduzidos ao biotério onde permaneceram por 60 min. Os animais GM foram novamente retirados de suas gaiolas-viveiro, transportados, pesados e reconduzidos ao biotério, onde permaneceram por 80 min.
3.2.7 Perfusão
A perfusão foi realizada 80 min após o início da sessão de teste, ou após a pesagem dos animais do grupo manipulação, sob anestesia profunda com Ketamina (Francotar, VIRBAC, 0,06ml/100g de peso corporal, i.m.) e Xylazina (Rompum, MILES- LAB, 0,04ml/100g de peso corporal, i.m.). Cirurgicamente, a caixa torácica foi exposta, e injetada heparina (heparina sódica 0,2 ml/100g de peso) no ventrículo esquerdo, seguida de perfusão por via transcardíaca com solução salina tamponada 9%, 100ml/100g de peso (pH 7,4), para a remoção do sangue presente no cérebro, e, a seguir, com solução de paraformaldeído (PFA), a 4% em tampão fosfato (TF) 0,1M; pH 7,4 em uma temperatura de 4° C para a fixação do tecido nervoso. Os cérebros foram retirados do crânio e mantidos por 4-6 horas na mesma solução de PFA, para pós-fixação. Depois disso, os cérebros foram transferidos para uma solução crioprotetora de sacarose a 30% em TF 0,1 M, pH 7,4 e mantidos em uma temperatura média de 4° C por 48 h. Terminado o período de crioproteção, os cérebros foram fixados em um micrótomo deslizante de congelamento (Leitz 1208), congelados com gelo seco e seccionados a uma espessura de 30 µm , no plano estereotáxico coronal (frontal).
Os cortes foram coletados em recipientes contendo solução de PFA a 4%, em TF 0,1M, pH 7,4 e distribuídos igualmente em seis compartimentos onde foram mantidos a 4o C. Em seguida os cortes foram submetidos ao processamento imuno-histoquímico.
3.2.8 Tratamento imuno-histoquímico do tecido cerebral
Os cortes foram lavados três vezes em TF por 10 min cada. Para investigar ZENK foi usado o anticorpo primário contra zenk. Os cortes foram incubados overnight com o anticorpo primário de coelho Egr-1 (c-19), (Sc-189-Santa Cruz Biotechnology, USA) numa concentração de 1:1000 em uma solução de triton X-100, diluído a 0,3% em TF. No dia seguinte, foram lavados por três vezes em TF por 10 min cada. Em seguida, foram incubados, com o anticorpo secundário biotinilado feito em cabra (Jackson ImunoResearch) durante 90 min, permanecendo em rotação lenta (de 6 a 7 rotações por minuto) à temperatura ambiente.
Terminado esse período, os cortes foram de novo submetidos a três lavagens em TF de 10 min cada. Seguiu-se a incubação em uma solução com o complexo ABC (avidina-biotina-peroxidase) e cloreto de sódio, por 90 min, permanecendo em rotação lenta, à temperatura ambiente. Nova bateria de três lavagens em TF por 10 min cada foi realizada. Depois disso foram então colocados em solução de diaminobenzidina em TF, adicionando-se 0,2 ml de H2O2 0,03%, por um período de 2 a 6 min e novamente
lavados três vezes, 10 min cada, em TF. Foram feitas as montagens das lâminas, que ficaram secando por aproximadamente quatro dias e, posteriormente, foram desidratadas mediante a exposição a uma série de soluções alcoólicas com concentrações crescentes (70%, 90%, 100%, 100%), por um período de 5 min em cada solução, e ao clareador (Hemo-De). Em seguida as lâminas foram cobertas com lamínulas usando-se Permount.
3.3 Análise dos dados comportamentais
As gravações em VHS das sessões de treino e de teste dos animais dos grupos, GCC, GCR, GCMK e GCS foram transcritas com registros de todos os
comportamentos, no momento em que os animais os apresentavam, usando-se o programa EthoLog 2.2 (Ethological Transcription Tool, 1995-99, Ottoni, 2000).
A partir da seqüência comportamental obtida foram computados os comportamentos registrados em blocos de 30 segundos. A análise foi feita considerando-se a freqüência acumulada em blocos de cinco (5) intervalos de registro, obtendo-se assim um total de oito (8) blocos de intervalos de registro para cada sessão.
O registro dos comportamentos foi feito de acordo com a descrição e definição das categorias e itens comportamentais, contidas no catálogo de comportamento de pombos (REIS et al., 1999; BRITO, 2002). Essas categorias foram:
-Movimentos isolados (MOV): nesta categoria foram incluídos todos os comportamentos que resultam em mudanças de localização espacial e/ou extensão de partes do corpo do animal.
-Comportamentos pré-exploratórios (PRE): constituem reações que foram geralmente observadas antecedendo o explorar (sobressalto, murchar, estremecer o corpo).
-Comportamentos exploratórios (EXP): movimentos relacionados à orientação para a investigação de partes ou do ambiente como um todo (esticar o pescoço, alerta, explorar, escanear, rotação da cabeça, fixar).
-Locomoção (LOC): deslocamento no espaço, usando como referencial um ponto qualquer que não ele mesmo (andar, circular, pisotear, esvoaçar, voar, pular).
-Manutenção (MAN): comportamentos relacionados com ajustes corporais e vegetativos (bocejar, estremecer a cabeça, deglutir, vomitar, piscar) e de auto-estimulação como coçar e limpar.
-Postura de imobilidade relaxada ou parada (PAR): ausência de movimentos observáveis do corpo ou de parte deste; o animal interrompe o movimento em curso
ou fica sem se mover, em pé, geralmente no centro da câmara experimental e sem apoio peitoral, com o pescoço encolhido ou em pequena extensão.
-Postura de imobilidade tensa ou freezing (FR): ausência de movimentos observáveis do corpo ou parte deste: o animal fica imóvel, agachado ou encolhido com alargamento da distância entre os pés, geralmente num canto da câmara experimental, com o corpo inclinado para frente e apoio peitoral no assoalho ou parede, as asas e caudas apresentam-se desalinhadas; o pescoço com extensão restrita, a cabeça fica imóvel e direcionada para um único ponto do ambiente; os olhos apresentam-se totalmente abertos e a respiração ofegante.
Os registros foram discutidos e revistos por observadores-controle, para fins de controle de validade dos dados.
3.4 Análise da marcação de células ZENK-positivas
Foi feita a análise da marcação das células ZENK-positivas através de microscopia de campo claro e contraste de interferência, sendo que na contagem dos núcleos dos neurônios marcados nas regiões definidas do hipocampo utilizou-se o programa Image (NIH, USA).
A contagem foi realizada em três a cinco cortes de cada animal, correspondentes aos níveis A8.00 a A7.00 (KARTEN e HODOS, 1967). Para cada corte, foram realizadas as contagens nas três regiões hipocampais: hipocampo dorsal (HpD), hipocampo ventro-medial (HpVm) e hipocampo ventro-lateral (HpVl). Inicialmente delimitava-se a área correspondente à região, procedendo-se à contagem. A média da contagem considerando-se o total de cortes de cada animal em que cada região foi analisada, foi considerada como o número de marcação de cada animal para a análise estatística. Os resultados são expressos em densidade, ou
melhor, os números correspondem à quantidade de células ZENK-positivas em cada milímetro quadrado:
D= (n 1000000)/ A (µm2)
D= número de células ZENK-positivas por mm2
N= número de células ZENK-positivas
A= área delimitada para a contagem de células ZENK-positivas em µm2
3.5 Análise estatística
Para a análise estatística dos dados comportamentais foi utilizada a análise de variância (ANOVA) de uma via, sendo o comportamento de freezing a variável dependente e os grupos a variável independente, tanto durante a sessão de treino como de teste. O mesmo foi feito para analisar os outros tipos de comportamentos. Foi utilizada a ANOVA de duas vias para comparar os grupos de animais e os blocos de intervalos de registros (variáveis independentes) quanto ao comportamento de freezing (variável dependente) durante as sessões de treino e de teste. As análises post hoc foram realizadas com o teste para múltiplas comparações de Tukey-Kramer.
Para a análise estatística da densidade das células ZENK-positivas no hipocampo total, como também para a análise na região HpVm e HpVl, foi utilizada a ANOVA de uma via, sendo o grupo a variável independente e a densidade da marcação, a variável dependente. As análises post hoc foram realizadas com o teste para múltiplas comparações de Tukey-Kramer.
A comparação dos dados das regiões HpD e HpV foi feita com o teste ANOVA de duas vias, considerando a densidade da marcação como variável dependente, e os
grupos e as regiões hipocampais como variáveis independentes. O teste bilateral de Dunnett para múltiplas comparações foi utilizado nas análises post hoc.
