Toxicidade ocular experimental do Perfluorotributilamine
ElCpe rimental ocula r tOlCicity Df
perjluorotributy/amine
Magno A Ferreiral') Omar Elzawarhyl"l Mauro Camposll) Michel Eid Farahl3l Martha Leel4J Thomas OgdelllSJ Stephen Ryalll6J
Trabalho realizado no Departamento de Oftalmologia da Universidade do Sul da Califórnia (Doheny Eye Institute)
(I) Estagiários do setor de retina e vítreo do Departamento de OftaLmologia da Universidade do Sul da Califórnia (Doheny Eye Institute).
(2) Estagiário do setor de retina e vítreo da USC (Doheny Eye Instih.te) e professorassi.1ente da Universidade do Cairo-Egito
(l) Chefe do setor de retina e vítreo da Escola Paulista de Medicinae Doutorem Medicina pela Escola Paulista de Medicina.
(') PhD responsável pelo setor de bioestatística da USC. (') Professor Adjunto da USC (Doheny Eye Institute).
(') Professor Titular da Oftalmologia (Doheny Eye Institute) e Reitor da Universidade do Sul da Califórnia.
20
Endereço para correspondência: Dr. Magno Antônio Ferreira - Rua Teixeira Santana 19. apto 800
38401 -003 -Uberlândia - MG
RESUMO
Perfluorotributilamine
(
PFTA) é um importante adjunto na cirurgiavítrea. Alterações do eletrorretinogram a em c oelhos tem sido reportadas após PFT A ser deixado na cavidade vítrea por duas a quatro sem anas. Neste estudo nós nos propusemos a determinar se estas alterações são
reversíveis após a remoção do mesmo. Dezessete coelhos submeteram-se à
vitrectomia e PFT A foi injetado em 13 olhos. Em oito olhos o PFT A foi removido após 1 2 dias (Grupo 1), em 5 olhos PFT A foi manti d o intra ocular até o dia da enucleação, que ocorreu 35 dias após a inj eção (Grupo 2) e 4 olhos submeteram-se à cirurgia sem utilização de PFTA (G rupo 3). Nenhu m a alteração clínica foi observada por oftalm oscopia indireta em nenhum c oelho. Eletrorretinogram a foi registrado em 12 coelhos antes da cirurgia (dia O) e n os dias 9, 19, 25 e 35. Nós observam os uma diminuição da amplitude da onda b na estimulação escotópica 8x e 1 6x em todos os grupos, sen do mais severa no grupo 2. A rem oção do PFTA resulta em recuperação da am plitude da onda b para valores próx i m os do valor pré operatório. Em coelhos, as alterações funcion ais induzidas pela substitui ção temporária do PFTA mostraram ser reversíveis.
Palavras-chave: perfluorotributilamine. eletrorretinograma, toxicidade, substituto vitreo.
INTRODUÇÃO
Perfluorotributilamine
(pITA)
é um importante adjooto na cirurgia vitreor retiana (1,3). Experiências cirúrgicas pre liminares indicam que estes líquidos de alta gravidade específica podem aplicar a retina sem retinotomia posterior e estabilizá-Ia durante a separação mecâ nica de membranas pré-retinianas(4).A
abordagem per-operatória de áreas de tração residual e membranas subreti nianas é aumentado com estes líqui dos(4). Em decorrência das característi cas físico-químicas destes líquidos, opticamente transparentes com densi dade maior que a água e biologicamen te inertes, o interesse nessas substân cias tem aumentado nos últimos anos em relação a sua utilização não como um instrumento intra-operatório mascomo um substituto vítreo temporário como são o óleo de silicone e gases perfluorocarbonados porém com a van tagem de prover um tamponamento na região inferior da cavidade VÍtrea e reti na.
Nesse estudo, nós nos propusemos a determinar a possibilidade de uso do mesmo por um período de 1 2 dias se guido por remoção do mesmo. Estudos anteriores mostraram que alterações anatômicas e funcionais eram reversí ve is após remoção do PITA deixado por 48 horas.
MATERIAIS B MÉTODOS
o perfluorocarbono líquido usado neste estudo foi perfluorotributilamine (C l 2F27N) PCR Chemicals, Gaines ville, Florida) com pureza de 97%.
Ou-ARQ. BRAS. OfTAL. 57( 1 ), FEVEREIRO/1994
tros fluorocarbonos saturados, pelo processo de fluorinação estavam pre sentes em pequenas quantias. As pro priedades fisicas do PFT A usado aqui são descritas na Tabela
I .
TABELA 1
Propriedades frsicas do perfluorotribulilamine
Fórmula qufmica Peso molecu lar Gravidade especifica Tensão superficial Indice da refração Pressão de vapor Viscosidade (C4F9)3N 6 7 1 1 .89 1 6 1 .29 1 . 1 4 2 . 6
Dezessete coelhos albinos, adultos, pesando 3 e 4 quilos foram usados neste estudo. O uso de animais neste estudo estava em acordo com as regulamenta ções da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para pesquisa laboratoriais em oftalmologia. Somente o olho direito de cada ani mal foi usado. Os coelhos foram aneste siados com injeção intramuscular de Ketamina (3 5mglkg) e xilazina (5mgl kg). Duas esclerotomias foram feitas a 2mm do limbo corneano na posição de 1 0 e 2hs. A cânula de infusão foi fixada na esclerotomia temporal com, poli vricril 6-0 pré-suturado. A esclero� tom ia nasal serviu de entradas para a ponta do vitreófago. Iluminação coa xial foi fornecida por um microscópio cirúrgico (Zeiss OPMI 6, Oberkochen, Germany). A observação do vítreo foi possível pelo uso de fluoresceína só dica na concentração de 8 mg/ml . Ví treo foi removido o máximo possível. Em 13 olhos, 1 ,0 mi de PFT A foi infun dido na cavidade vítrea após a realiza ção da vitrectomia resultando em 50% do preenchimento da cavidade vítrea. Em 8 desses olhos, o PFT A foi removi do após 1 2 dias (Grupo
I)
através de uma agulha calibre 26 posicionada in feriormente enquanto solução salina balanceada (B S S , A l co n , Dallas , E.U. A) foi infundido superiormenteARQ. BRAS. OFTAL. 57( 1 ), FEVEREIRO/1 994
Toxicidade oClIlar experimental do Perflllorotriblllilamine
atra vés da e s clerotom i a pre via. Freqüentemente uma pequena bolha de PFT A permanecia na cavidade vítrea. Nos 5 outros olhos o PFT A foi deixado por 3 5 dias (Grupo 2). Quatro olhos serviram como controle, sendo que a cavidade vítrea foi deixada com BSS (grupo 3). Este grupo submeteu-se a troca BSSIBSS após 1 2 dias pelo mes mo processo realizado com o Grupo
I .
Após vitrectomia e i nj e ção de PFT A ou substituição do vítreo por BSS, oftalmoscopia indireta e exame com lâmpada de fenda foram realiza dos para avaliação da córnea, cristali no, cavidade vítrea e retina. Exames foram realizados diariamente durante a primeira semana e 3 vezes por sema na a partir da primeira semana, até a enucleação. A enucleação foi realiza da 3 5 dias após a cirurgia em todos os grupos.
Eletrorretinogramas (ERG) foram registrados em 1 2 coelhos (4 de cada grupo) de acordo com técnica descrita pelo comitê internacional de padroni zação para eletrorretinograma(Sl, com modificações para coelhos. Coelhos fo ram primeiramente dilatados com tro pi cam ida a
I
% e fenilefrina a 1 0% e adaptados ao escuro por um tempo mí nimo de 20 minutos. Após dilatação ocular e anestesia como descrita acima os coelhos foram posicionados de lado, com o olho a ser examinado direcio nado para cima a 65cm do fotoes timulador (Grass Instruments, modelo PS22, Quincy, Massachussets, EUA). A cabeça dos animais foram suportadas por um anel opaco que prevenia a pas sagem de luz para o outro olho.Eletrodos foram posicionados intra dermicamente logo acima dos olhos (eletrodo terra) e na pálpebra inferior do olho a ser medido (eletrodo de refe rência). Um eletrodo de lente de conta to (ERG-JET"') foi colocado na córnea usando Hidroxiprop i l metilcelulose (2,5%) para aderência. Medidas do es tímulo escotópico foram feitas de res postas a um simples flash do "strobe" filtrados com filtro neutro de densidade
2.0. A resposta de cada flash foi repre sentada numa tela sendo, a amplitude registrada e documentada fotografica mente com filme polaroid 667. A res posta do eletrorretinograma do olho contralateral que não havia sido opera do, foi obti�a, para controle do olho pesquisado. Eletrorretinogramas foram realizados no Grupo
I
nove dias após a cirurgia e uma semana, duas semanas e três semanas após remoção do PFT A. Foram realizado eletrorretinogramas no Grupo 2 e 3 nos dias 9, 1 9 , 25 e 3 5 após a cirurgia. Não foram realizados ERGs em cinco animais.Microscopia Óptica: Imediatamente após enucleação todos os olhos foram fixados por imersão em glutaraldeído a 2.5% mais formaldeído a 2% em solu ção tampão de cacodilato de sódio O,
I M.
A retina, coróide e esclera foram divididas em porções superiores e infe riores, sendo que cada porção foi divi dida em duas seções menores. Os espé cimes foram lavados 3 vezes em O, I M d e cacodilato d e buffer, desidratado em concentrações ascendentes de etanol, e então infiltrados e embebidos em meta crilato de glicol. Os espécimes foram seccionados em uma espessura de 3 micra e foram corados com hemato xilina e eosina (HE).RESULTADOS A spectos CIí"icos
Inicialmente o PITA permanece em uma larga e homogênea bolha que ocu pa a porção inferior da cavidade vítrea. Dentro de poucas semanas de pós ope ratório, a bolha de PITA começa a se dispersar em pequenas bolhas, usual mente no menisco perfluorocarbono vítreo. Após
l O
a 1 2 dias de cirurgia, todos os olhos tiveram determinado grau de dispe�são das bolhas. No grupo 2, a formação de pequenas bolhas con tinuava durante os35
dias, sendo que o volume inteito de PFr A apresentava uma aparência de "ovas-de-peixe". Um olho desenvolveu moderada he morràgia vít�a durante a troca PIT AIBSS que resol veu completamente após 2 semanas.
Estudos Eletro rreti"ográficp�
Toxicidade retiniana devido a repo sição intra vítrea de PFT A foi avaliada de acordo com as respostas aos estímu los escotópicos. O grupo
I
(PFT A re movido) demonstrou a diminuição da resposta a intensidade de e stímul o escotópico de 8x e 1 6x nos dias 9 (antes da remoção) , 1 9 (uma semana após a remoção) e 25 (duas semanas após a remoção) . A resposta de ERG m elho rou consideravelmente neste grupo no trigésimo quinto dia após a cirurgia i ni cial que coincide com três se manas após a remoção do PFT A. O Grupo 2(PFT A não removido) mostrou uma
contínua diminuição na resposta do ele trorretinograma durante todas as medi das do experimento. O grupo 3 (B S S controle grupo) mostrou u m a discreta diminuição do eletrorretinograma se guindo a vitrectomia inicial e o décimo segundo dia no qual foi realizado a tro ca BSSIBSS, porém a resposta retomou a l inha basal no final do experimento.
Estudos Histológicos
À
microscopia ópti ca, a retina mos trou alterações vacuolares nas camadas retinianas internas, fotorreceptores e epitélio pigmentar da retina em todos os grupos. Em dois dos olhos no Grupo 2, nós observamos wna queda de n ú cleos dentro da camada de cones e bastonetes "photoreceptor drop-down".Perfluorotributilamine tem sido usa do durante cirurgia de vítreo e retina como um instrumento intra-operatório para aplicar novanlente a retina(I.) . A sua gravidade específica e maior que as soluções salinas, sendo útil como me canismo de tamponamento. A tensão superficial é baixa, resultando em uma alta tensão interfacial com soluções sa linas e limitando sua passagem através de roturas na retina(7). O PFT A é
opti-22
Tvxiciáade ocular experimental do Perfluorotribl/tilamine
camente claro com índice de refração de 1 ,29(7). Possui baixa viscosidade per mitindo conveniente injeção e remoção através de instrumental microcirúrgico. As alterações anatômicas e funcionais após a remoção do PFT A tem sido testadas em curto tempo de manuten ção do mesmo ( l h-2 diasy�·6.7.8). Entre tanto o uso de perfluorocarbonos por wn tempo mais prolongado tem a van tagem de permitir a adesão cori or retiana principalmente na região infe rior da retina, nas quais o uso de óleo de si licone, bem como gases não propi cia tamponamento nesta região.
Para avaliação da tolerância reti niana ao PFT A, foram estudadas as al terações func ionais e estruturais em coe l hos após v itre ctom ia e i nj e ç ão intravítrea de PFTA por 1 2 dias. Quan do nós comparamos as alterações de ERGs usando os estímulos escotópi cos de 8x e 1 6x nos 3 grupos, nós observa mos que a remoção do PFT A no déci mo segundo dia (Grupo I) foi seguida por uma recuperação da amplitude do ERG perto dos valores pré-operatórios. Entretanto, a manutençào do PFT A na cavidade vítrea induz a danos funcio nais progressivos como foi demonstra do por eletroretinogramas realizados em séries. Nossos achados funcionais estão em acordo com outros estudos(4.6). Os achados histológicos descritos aqui são sim ilares em todos os grupos, não parecendo estarem relacionados com o uso de PFT A, embora manutenção de PFT A por wn tempo mais prolongado provoque alterações histológicas mais intensas. Desprendimento dos núcleos dos fotorreceptores dentro da camada dos cones e bastonetes ("photoreceptor drop-down") são consideradas nào es pecíficas de olhos injetados com PFT A e são observados nas espécies humanas e outras(IO.I I). Embora estudos tenham demonstrado que perfl uorocarbonos compostos somente de carbono e flúor sej am b iologi camente mais inertes quando comparados com perfluoro carbonos que contenham outros áto mos, como o nitrogênio no caso do·
PFT A( 1 2), Nós demonstramos a tendên cia de recuperação da função retiniana após estes compostos tere m sidos re movidos após um tempo relativamente grande ( l 2 dias) em olhos de coelhos. Os resultados deste estudo estimulam mais pesquisas relac ionadas ao uso de perfl uorocarbonos como substituto ví treo e não simplesmente e tão somente como instrumento intra-operatório.
SUM�IARY Inl1'Gvilreal inSlillalion of perjluorolribllt)'iamine (PFTA) is ali ill/portalll adjllllcl in vilreclomy sllrgel)'. Elect/'oretinogram changes iII rabbits Itave been reporled after PFTA I I'(IS left iII the vitreous cavit)' for 111'0 to four weeks. ln lhe sllld)'
described herein, we sOllght to determine II'ltelher these chal/ges are reversible ajter PFTA is /'emoved. Sel'enteell rabbits 1lI1derwent I'itreclom)' after which PFTA was instilled ill J 3 eyes. ln 8 eyes lhe PFTA was remol'ed afieI' 12 days (Grollp J), and iII 5 eyes lhe PFTA was left in place IInlil enucleation (Group 2); fOllr eyes Illldel1l'ent surgely Il'ilhoUl inslillalion of PFTA (Grollp 3). No c1íllical changes were observed by illdirect
Ophlhalmoscopy iII ally of lhe
rabbits. ERGs were serially
recorded in J 2 rabbits before
surgely (day O) alUI on days 9, 19, 25 and 35. We observed a decreased
amplitude of lhe b- wave in ali gror/ps, bra lhis was greatesl in the first grOllps 1 and 2. The removal of
PFTA resulted in a recovely of b- wave amplitude to near baseline leveis. It thlls appears lhat, the frmclional changes illdllced by
lempOraty placement of PFTA wilhin the vitreolls are reversible.
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