Detecção e genotipagem do papilomavírus humano (HPV) em mucosa oral de pacientes do Estado de Sergipe, Brasil

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA. NÚCLEO DE PÓS GRADUAÇÃO E PESQUISA. Detecção e Genotipagem do Papilomavírus Humano (HPV) em Mucosa Oral de Pacientes do Estado de Sergipe, Brasil. MARIANA GOVEIA MELO RIBEIRO. São Cristóvão 2014.

(2) MARIANA GOVEIA MELO RIBEIRO. ___________________________________________________. ORIENTADOR: Prof. Dr. Silvio Santana Dolabella. Detecção e Genotipagem do Papilomavírus Humano (HPV) em Mucosa Oral de Pacientes do Estado de Sergipe, Brasil. Projeto de Pesquisa apresentado ao Programa de Pós-graduação. em. Biologia. Parasitária. da. Universidade Federal de Sergipe para obtenção do título de Mestre.. São Cristóvão 2014.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. R484d. Ribeiro, Mariana Goveia Melo Detecção e genotipagem do papilomavírus humano (HPV) em mucosa oral de pacientes do Estado de Sergipe, Brasil / Mariana Goveia Melo Ribeiro ; orientador Silvio Santana Dolabella. – São Cristovão, 2014. 93 f. : il. Dissertação (mestrado em Biologia Parasitária) – Universidade Federal de Sergipe, 2014.. 1. Papillomavírus humano. 2. Mucosa bucal Papilomavírus - Sergipe. I. Dolabella, Silvio Santana, orient. II. Título. CDU 616.31-006.52(813.7).

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(5) RIBEIRO, M.G.M.; DOLABELLA, S.S. Detecção e genotipagem do Papilomavírus Humano (HPV) em mucosa oral de pacientes do estado de Sergipe, Brasil. RESUMO. A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é a doença viral sexualmente transmissível mais prevalente no mundo. Suas infecções podem variar de assintomáticas à indução de Carcinomas de Células Escamosas. Entre os agentes infecciosos associados ao câncer oral, tem-se discutido a correlação da infecção por HPV em mucosa oral e o desenvolvimento e/ou agravamento das lesões. O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência do HPV e seus genótipos em pacientes com lesão oral e em mucosa oral saudável de usuários e nãousuários de drogas no estado de Sergipe, Brasil. Foram avaliados 39 pacientes com idade entre 2 e 83 anos, com lesões clinicamente detectáveis na mucosa oral e 106 pacientes com mucosa oral saudável entre 11 e 79 anos. As amostras foram coletadas por esfoliação da mucosa oral. Para o controle de qualidade da extração de DNA foi utilizado PCR para beta-globina. DNA-HPV foi detectado utilizando primers MY09/MY11 e GP5+/GP6+. A genotipagem foi realizada através de multiplex-PCR com primers específicos para os tipos virais 6, 16 e 18. Nosso estudo detectou DNA-HPV em todos os tipos de lesões avaliadas. A prevalência do HPV foi de 76,92% (30/39) nos pacientes com lesões orais. O tipo viral mais frequente foi o HPV-6, presente em 56,67% (17/30), seguido do HPV-18 em 26,67% (8/30) e do HPV-16 em 6,67% (2/30). DNA-HPV foi encontrado em 83,02% (88/106) dos pacientes com mucosa oral sadia. O tipo viral mais frequente foi o HPV-6, presente em 45,45% (40/88), seguido do HPV-18 em 35,23% (31/88) e do HPV-16 em 4,54% (4/88). Entre usuários de múltiplas drogas 86,67% (52/60) foram positivos e infecções múltiplas por mais de um tipo viral foram identificadas em 23,08% (12/52) dos indivíduos. Entre os "não usuários" a taxa de infecção pelo HPV foi de 78,26% (36/46). Desta forma, foi verificada uma alta ocorrência do HPV em nosso estudo, tanto em lesões orais quanto em mucosas saudáveis. As taxas de detecção do vírus em cavidade oral variam acentuadamente no mundo e tornam a relação do HPV com o processo de carcinogênese oral ainda controversa. Isso faz necessária a realização de estudos adicionais que avaliem o papel do Papilomavírus Humano no desenvolvimento de lesões na mucosa oral. Há poucos dados disponíveis sobre a frequência de infecção oral por HPV na população brasileira e especialmente entre usuários de drogas. Novos estudos sobre a prevalência do HPV entre usuários de drogas são necessários para melhor compreensão da sua exposição ao vírus e o desenvolvimento de estratégias de prevenção. Palavras-chave: Papilomavírus Humano; lesões orais; mucosa oral; PCR; Brasil.. Orientador: Prof. Dr. Silvio Santana Dolabella, Universidade Federal de Sergipe..

(6) RIBEIRO, M.G.M.; DOLABELLA, S.S. Detection and genotyping of Human Papillomavirus (HPV) in oral mucosa of patients in Sergipe State, Brazil. ABSTRACT. Infection with Human Papillomavirus (HPV) is the sexually transmitted viral disease most prevalent in world. The infections can range from asymptomatic establishment to induction of squamous cell carcinomas. It has been discussed the correlation of HPV infection and the development and/or aggravation of lesions in the oral mucosa. The aim of this study was to evaluate the occurrence of HPV and its genotypes in patients with oral lesions and in healthy oral mucosa of users and non-users of drugs in the state of Sergipe, Brazil. Thirty-nine patients aged 2 to 83 years with clinically detectable lesions in the oral mucosa and 106 patients with healthy oral mucosa between 11 and 79 years were evaluated. Samples were collected by exfoliating the oral mucosa. For quality control of DNA extraction beta-globin PCR was performed. HPV DNA was detected using primers MY09/MY11 and GP5+/GP6+. Genotyping was performed by multiplex-PCR with specific primers for HPV types 6, 16 and 18. Our study detected the virus in all types of lesions evaluated. The occurrence of HPV was 76.92% (30/39) in patients with oral lesions. The most common virus type was HPV-6 in 56.67% (17/30), followed by HPV-18 in 26.67% (8/30) and HPV-16 in 6.67% (2/30). Positive results were found in 83.02% (88/106) of patients with healthy oral mucosa. The most common virus type was HPV-6 in 45.45% (40/88), followed by HPV-18 in 35.23% (31/88) and HPV-16 in 4.54% (4/88). Between multiple drug users 86.67% (52/60) were positive and multiple HPV infections were identified in 23.08% (12/52). At "non-users" the occurrence was 78.26% (36/46). A high occurrence of HPV was found in the study, both in oral lesions and in healthy mucosa. Rates of HPV detection in the oral cavity vary markedly in the world and make the relationship between HPV and oral carcinogenesis still controversial. Additional studies to evaluate the role of human papillomavirus in the development of lesions in the oral mucosa are necessary. There are few data available on the frequency of oral HPV infection in Brazilian population and especially among drug users. Other studies on HPV prevalence among drug users are needed for a better understanding of their exposure to the virus and for the development of prevention strategies. Key-words: Human papillomavirus; oral lesions; oral mucosa; PCR; Brazil.. Orientador: Prof. Dr. Silvio Santana Dolabella, Universidade Federal de Sergipe..

(7) AGRADECIMENTOS. Agradeço inicialmente a Deus por ter me dado forças a cada tropeçada ao longo desse caminho, muitas vezes colocando pessoas em minha vida sem as quais esses anos teriam sido muito mais árduos. A meus pais, Ivanaldo e Sandra, por todo suporte e amor que me deram e por torcerem confiantemente por cada nova conquista minha durante toda minha vida. Não tenho dúvidas de que eu não teria conseguido sem vocês sempre me apoiando e acreditando que eu conseguiria, mesmo muitas vezes sem nem entender direito os assuntos que eu tanto estudava ou meus horários loucos. A meu irmão, Luiz Antônio, por, com seu jeito brincalhão, torcer sempre pelos meus novos passos. Muito obrigada, amo muito vocês! Ao professor Dr. Silvio Dolabella, não só por ter aceitado me orientar e por ter abraçado minha linha de pesquisa, mas principalmente por ter se tornado para mim um exemplo de profissional dedicado e de orientador presente. Muito obrigada por cada ensinamento e por todo o suporte que me deu ao longo desses anos! A melhor turma de colegas que eu poderia ter tido no mestrado pela ajuda coletiva a cada matéria e, sobretudo, pelos risos e brincadeiras que tornaram os exaustivos períodos de aula algo mais leve e descontraído. Em especial Alda, Aline, Israel, Mércia e Tiago pelos momentos de comilança e gargalhadas, pelas saudosas sessões de “cine trash” e pela amizade formada dentro e fora das cercas da UFS. A todos do Lepat (Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical), em especial às minhas queridas “Lab Girls” (Alda, Érica, Letícia, Lynna, Mércia, Polly e Yrna), pela sempre agradável companhia diária, pelo carinho, pelos almoços e finais de semana compartilhados na UFS, pelas inúmeras horas de descontração e até mesmo pelas faxinas mais engraçadas de minha vida. Agradeço aqui a Israel também pela ajuda, companhia, conversas e companheirismo constantes durante esses anos. Com vocês o caminho foi mais sorridente e nossa convivência já deixa saudades, obrigada! Ao professor Dr. Cleverson Trento por ter aberto as portas do Ambulatório de Diagnóstico Oral do HU-UFS e pelas contribuições dadas ao meu trabalho, sempre prestativo e sorridente. Agradeço também a toda a equipe e pacientes do ambulatório, em especial à Vande e à Kátia, pelo acolhimento e por me tratarem de maneira tão afetuosa a cada novo dia de coleta e a Fábio e Eduardo por toda ajuda e por estarem sempre interessados em aprender. À Elaine por ter sido o meu braço direito durante, e mesmo depois, do período de coletas e por ter confiado em mim em seu turbilhonado período de conclusão de curso e monografia. Você se tornou para mim um exemplo de carisma, responsabilidade e dedicação. Obrigada, sobretudo, pela amizade. Às equipes da Fazenda Bethesda, do Hospital de Cirurgia, do Hospital São José e novamente do Ambulatório de Diagnóstico oral pela receptividade e por nos acolher em suas rotinas. Agradeço aqui principalmente aos pacientes que tão prestativamente aceitaram participar deste projeto e sem os quais este trabalho não existiria. À professora Drª Márcia Guimarães por ter me recebido no Laboratório de Imunopatologia da Relação Materno Fetal da Unesp de Botucatu e ter sido de extrema importância para a conclusão deste trabalho e a todos do LabMatFet por terem me acolhido tão bem. Agradeço especialmente à Larissa, não só por ter me acompanhado no laboratório e dividido comigo ansiedades, angústias e comemorações a cada novo gel revelado, mas por além de tudo ter transformado completamente a sua rotina, me acolhendo com tanto carinho em sua casa e em sua família desde minha primeira chegada em Botucatu até os.

(8) momentos em que voltei para casa. Por esse acolhimento agradeço também ao Juliano, à Japa, à Fofa e à família da Larissa por terem me feito sentir em casa mesmo quando ainda nem me conheciam. Muito obrigada! Ao professor Dr. Alexandre Onofre por ter religado meu interesse pelas análises clínicas e por, ao me apresentar à citologia oncótica e à infecção celular pelo HPV, ter de certa forma sido um dos responsáveis pelo caminho que trilhei de minha graduação até este momento. Agradeço também a algumas pessoas que indiretamente contribuíram para a conclusão deste trabalho, mas que foram essenciais em mais essa etapa de minha vida. À minha avó, Conceição, por todo carinho, por suas orações diárias e pela saudade mais singela a cada viagem ou período de ausência meu, até mesmo nos mais curtos. A meus tios e tias, em especial a tia Raquel, tia Lucinha, tio Carlinhos, tia Idália e tio Luiz pela torcida constante pelo meu sucesso, pela comemoração a cada boa notícia e pela força nos momentos em que tudo parecia não parar de dar errado. Aos meus primos e primas, em especial a minhas maguinhas (Aurinha, Karlinha e Sandrinha) e a Riva por estarem sempre comigo mesmo quando não fisicamente, por todo o amor compartilhado e pelo orgulho que sempre tiveram a cada conquista minha. A meus priminhos Cadu, Biel, Arthur Felipe, Lucas, Malu, Larinha e Marina pelo amor mais puro e pela capacidade de me arrancar sorrisos mesmo nos momentos mais conturbados ao longo desses anos. Aos amigos que estão comigo desde o Colégio de Aplicação e que se tornaram parte de minha família, em especial a Jéssica, Geraldo, Alécia, Guilherme, Victor, Igor, Christian e Bruno, por acompanharem de perto esse meu caminhar, torcendo sempre para que tudo desse certo e pelo amor mantido desde nossos tempos de criança. Aos amigos feitos durante a graduação em Farmácia e que até hoje se mantem presentes em minha rotina pelos incontáveis risos, reuniões, festas e conversas das mais sérias às mais bobas. Em especial à Carina, Lolô, Fábio, Paty e Glegle. À Cacá pelo compartilhamento de tristezas e alegrias vividos pelas duas em seus respectivos mestrados e também na vida e por todos os momentos em que fui acolhida em sua casa como se fosse minha. À Lolô por estar presente em muitos dos meus momentos mais felizes, loucos e até mesmo dos mais traumáticos. Aos amigos mais chatos e fofos que alguém pode ter, Paty e Fabu, e a Glegle por nossos encontros gordos semanais, nossas viagens anuais, nosso riso fácil, pelas incontáveis conversas sérias e até mesmo pelo direito de implicar com o outro sem preocupação. Obrigada por sempre me acalmarem, mesmo quando nem era essa a intenção. A Diego pela amizade sempre presente em minha rotina, desde meus tempos de graduação até o mestrado, mesmo com toda a distância geográfica. Obrigada pelas inúmeras conversas aleatórias, pelos artigos baixados, pelas opiniões trocadas e até mesmo pelas fotos editadas após pedidos de socorro. À Larissa pela amizade antiga, pela torcida sincera e empolgada a cada nova notícia minha ou possibilidade de novo passo, por tantas horas de conversa e inclusive por toda a implicância com meus horários atípicos de sono e minha produtividade na madrugada. A Edson, Leo, Gabi, Aldrey, Murilo e Mairla por muitas vezes terem me ajudado a ficar mais calma quando um experimento ou quase tudo parecia dar problema, pela companhia constante, pelos incontáveis momentos de gordices e de mazela coletiva e também pelas comemorações compartilhadas ao longo desses anos. Agradeço enfim a todos que de alguma forma participaram da construção direta ou indireta deste trabalho. Muito obrigada!.

(9) SUMÁRIO. LISTA DE ABREVIATURAS .......................................................................................... x LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... xi LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... xii 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1 1.1. Papilomavírus Humano (HPV) ..................................................................................... 1 1.2. Epidemiologia da infecção por HPV oral ..................................................................... 3 1.3. Fisiopatologia do HPV ................................................................................................. 8 1.4. Diagnóstico do HPV .................................................................................................... 11 1.5. Lesões orais e HPV...................................................................................................... 15 2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 19 2.1. Geral ............................................................................................................................ 19 2.2. Específicos ................................................................................................................... 19 3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 20 3.1. Delineamento do estudo ............................................................................................. 20 3.2. Coleta .......................................................................................................................... 20 3.3. Pesquisa de HPV ........................................................................................................ 21 3.3.1. Extração de DNA .................................................................................................... 21 3.3.2. Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) ................................................................. 21 3.3.3. Visualização dos produtos amplificados ................................................................. 23 3.3.4. Genotipagem ............................................................................................................ 23 3.4. Análise estatística ........................................................................................................ 24 4. ARTIGO 1. ELEVADA OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM LESÕES DE MUCOSA ORAL EM HOSPITAL UNIVERSITÁRIO NO ESTADO DE SERGIPE, BRASIL ................................................................................ 25 Introdução .......................................................................................................................... 27 Material e métodos ............................................................................................................. 29 Resultados .......................................................................................................................... 32 Discussão ............................................................................................................................ 32 Referências ......................................................................................................................... 35 5. ARTIGO 2. OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM MUCOSA ORAL SAUDÁVEL DE USUÁRIOS E NÃO USUÁRIOS DE DROGAS ILÍCITAS NO ESTADO DE SERGIPE, BRASIL ...................................................... 40.

(10) Introdução........................................................................................................................... 43 Material e métodos ............................................................................................................. 44 Resultados .......................................................................................................................... 47 Discussão ............................................................................................................................ 49 Referências ......................................................................................................................... 53 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 61 ANEXOS ........................................................................................................................... 68 Anexo A. Termo De Consentimento Livre Esclarecido – Usuários de drogas .................. 69 Anexo B. Termo De Consentimento Livre Esclarecido – Não usuários de drogas ........... 70 Anexo C. Formulário De Coleta De Dados ........................................................................ 71 Anexo D. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFS .............................................. 72 Anexo E. Normas para Publicação no Periódico Journal of Oral Pathology & Medicine . 73 Anexo F. Normas para Publicação no Periódico PLOS ONE ............................................ 77.

(11) x. LISTA DE ABREVIATURAS. CBL – Citologia em Base Líquida CCE – Carcinoma de Células Escamosas CCE-CP – Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço CCEO – Carcinoma de Células Escamosas Oral DEIA – DNA Enzyme Immunoassay DNA – Ácido Desoxirribonucléico EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetracético HPV – Papilomavírus Humano HU-UFS – Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe INCA – Instituto Nacional do Câncer LEPAT – Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical LCR – Região Longa de Controle NaCl – Cloreto de Sódio ORF – Fase Aberta de Leitura pb – Pares de Base PCR – Reação em Cadeia de Polimerase pRB – Proteína do Retinoblastoma RT-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real SDS – Dodecil Sulfato de Sódio TBE – Tris Boro EDTA TE-PCR - Reação em Cadeia de Polimerase Tipo Específica Tris-HCl – Tris Ácido Clorídrico.

(12) xi. LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em lesões orais diversas ................ 5 Tabela 2 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em mucosa oral saudável fora do Brasil .................................................................................................................................... 6 Tabela 3–Epidemiologia do Papilomavírus Humano em mucosa oral saudável no Brasil.. 7 Tabela 4 - Principais tipos de HPV relacionados a manifestações clínicas orais.............. 16 Tabela 5 – Sequências de bases dos primers RS42/KM29, GP5+/GP6+, MY09/MY11 e primers HPV-6, HPV-16 e HPV -18 específicos................................................................ 22 Tabela 1 (Artigo 1) – Prevalências do HPV e seus tipos classificadas de acordo com dados histopatológicos em pacientes com lesões em mucosa oral no estado de Sergipe, Brasil.. 39 Tabela 2 (Artigo 1) – Prevalências do HPV e seus tipos em pacientes com lesões em mucosa oral no estado de Sergipe, Brasil, classificadas de acordo com dados clínicos..... 39 Tabela 1 (Artigo 2) – Prevalências do HPV e seus tipos em pacientes com mucosa oral saudável classificadas de acordo com dados clínicos......................................................... 60.

(13) xii. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Mapa genômico do HPV16 (7904 pb) apresentando os promotores precoces (p97) e tardio (p670) identificados por setas......................................................................... 2 Figura 2 – Fluxograma da patogênese do carcinoma de células escamosas associado a HPV de alto risco ............................................................................................................... 10 Figura 3 – Gel de agarose a 2% mostrando bandas positivas para HPV usando os primers GP5+/GP6+ ........................................................................................................................ 13 Figura 4 – Gel de agarose a 2% mostrando amostras positivas para HPV-6 usando multiplex com primers específicos para os tipos HPV-6, HPV-16 e HPV-18................... 14 Figura 5 – Exemplo do teste de genotipagem Linear Array HPV (Roche Diagnostics)... 15.

(14) 1. 1. INTRODUÇÃO. 1.1. Papilomavirus Humano (HPV). A infecção pelo Papilomavirus Humano (HPV) é uma das doenças sexualmente transmissíveis virais mais incidentes no mundo (BHARTI et al., 2013, TRISTÂO et al., 2012; CARVALHO et al., 2010). Nos Estados Unidos, estima-se que diariamente 12 mil jovens entre 15 e 24 anos são infectados pelo HPV (BHARTI et al., 2013). No Brasil, a incidência estimada é de 500 mil a 1 milhão de novos casos por ano (TRISTÂO et al., 2012). O HPV é um pequeno DNA vírus, não-envelopado, icosaédrico, epiteliotrópico, que infecta pele e mucosas em diversas regiões do corpo (ZONTA et al., 2012; ESQUENAZI et al., 2010; XAVIER et al., 2007). Classificado atualmente na família Papillomaviridae (TRISTÃO et al., 2012), mede aproximadamente 55nm de diâmetro e possui genoma de dupla fita circular com aproximadamente 8 mil pares de bases que pode ser dividido em 3 regiões: a região longa de controle (LCR - Long Control Region), a precoce (E - Early) e a tardia (L - Late) (Figura 1) (ESQUENAZI et al., 2010; ROCHA et al., 2007; SIMONATO, MIYAHARA, 2007; DOORBAR, 2005) . Através da análise de seu DNA, aproximadamente 200 tipos de HPV foram identificados de acordo com a homologia de seu genoma e classificados em alto ou baixo risco oncogênico (XAVIER et al., 2007; SOUZA JÚNIOR, 2006; SCHWARTZ et al., 1998). Uma característica dos HPVs é que todas as fases abertas de leitura (ORFs - Open Reading Frame) localizam-se na mesma fita de DNA, indicando que uma única fita serve como molde para a transcrição (DOORBAR, 2005; OLIVEIRA et al., 2003). A região E codifica proteínas regulatórias, incluindo aquelas envolvidas nos processos de replicação viral e transformação celular (E1 a E7) (SIMONATO, MIYAHARA, 2007; FEHRMANN, LAIMINS, 2003). A região L é responsável por codificar as proteínas do capsídeo (L1 e L2) (SIMONATO, MIYAHARA, 2007; FEHRMANN, LAIMINS, 2003; OLIVEIRA et al., 2003). A L1 é a principal proteína do capsídeo e representa aproximadamente 80% do total de proteínas virais. A proteína L2 é importante no processo de empacotamento seletivo do DNA viral e aumenta a infectividade do vírion (FEHRMANN, LAIMINS, 2003)..

(15) 2. A LCR não apresenta ORFs e contêm a origem da replicação do DNA e elementos de controle da transcrição (FEHRMANN, LAIMINS, 2003; OLIVEIRA et al., 2003).. Figura 1- Mapa genômico do HPV16 (7904 pb) apresentando os promotores precoces (p97) e tardio (p670) identificados por setas. As oito ORFs (open reading frame) estão indicadas na figura (DOORBAR, 2006).. O vírus infecta a camada basal do epitélio, necessitando de lesões ou microlesões no tecido epitelial para que ocorra a infecção (RAMSHANKAR, KRISHNAMURTHY, 2013; OLIVEIRA et al., 2003). O HPV foi um dos primeiros vírus a ser relacionado a neoplasias em seres humanos (VIDAL et al., 2004). Seu mecanismo de integração ao genoma hospedeiro permanece desconhecido, porém as proteínas E6 e E7 associadas aos HPVs de alto risco oncogênico tem sido relacionadas à capacidade de transformação e degradação celular através de ligação e inativação dos genes supressores de tumor p53 e pRB em indivíduos infectados (TRISTÃO et al., 2012; GHITTONI et al, 2010). A via sexual é o meio de transmissão mais comum do HPV; porém, acredita-se que na infecção oral o contágio ocorra principalmente por auto inoculação a partir de lesões cutâneas ou genitais já existentes, havendo também a possibilidade de transmissão vertical.

(16) 3. materno-fetal (SIMONATO, MIYAHARA, 2007; XAVIER et al., 2007; SOUZA JÚNIOR, 2006). Embora não se conheça por quanto tempo o vírus resiste fora do hospedeiro, considera-se que a infecção por objetos contaminados possa ser viável por um curto período de tempo e que mulheres e crianças sem atividade sexual também são alvos para o desenvolvimento da infecção (GROSS, BARRASSO, 1999).. 1.2. Epidemiologia da infecção por HPV oral. As taxas de detecção do HPV em lesões na cavidade oral reportadas na literatura variam acentuadamente em todo o mundo, indo de 0% a 100%. Enquanto estudo desenvolvido no Senegal detectou a presença do HPV em apenas 3,4% dos tumores analisados, em revisão sistemática de 60 estudos que utilizaram a PCR para detecção do HPV em cânceres de cabeça e pescoço, observou-se a presença do vírus em 25,9% dos tumores avaliados, sendo 35,6% nos casos de acometimento da orofaringe e 23,5% nos de cavidade oral (NDIAYE et al., 2013; QUINTERO et al., 2013). Essa variação acentuada nas taxas de detecção de HPV em lesões orais é comum a vários estudos e se deve a diferenças nos métodos utilizados, variações etnogeográficas entre as populações estudadas ou até mesmo pequeno número de amostras analisadas, o que dificulta uma melhor comparação entre os resultados apresentados (Tabela 1) (FELLER et al., 2010; VENTURI et al., 2004). Uma predominância do HPV-16 nos tumores associados ao vírus também foi consenso nos estudos realizados, com uma prevalência de 68,2% dos casos localizados na cavidade oral, seguido pelo HPV-18 com prevalência de 34,1% em tumores nesta localidade. Em pesquisa realizada na Colômbia, o HPV foi encontrado em 18,9% dos casos de Carcinomas de Células Escamosas (CCE) de cabeça e pescoço diagnosticados entre 1999 e 2008, sendo identificado em 23,9% dos tumores localizados na cavidade oral. Nesse estudo, o HPV-16 foi o mais freqüente, sendo encontrado em 82% dos casos HPV positivos (QUINTERO et al., 2013). Trabalhos realizados na Europa encontraram taxas que vão de 25,3% a 87,5% de casos HPV positivos em lesões cancerígenas e pré-cancerígenas. Na Inglaterra, Elamin et al. (1998) detectaram material genético do HPV em 45% das amostras avaliadas em seu estudo, sendo as prevalências relativas de 50% nos casos de CCEO e 33% em lesões précancerígenas. Pesquisa realizada na Itália por Termine et al. (2012) encontrou prevalência.

(17) 4. de 25,3% em pacientes com CCEO, enquanto Morbini et al. (2012), neste mesmo país, obtiveram 87,5% de positividade em amostras de CCE e displasias. Nos Estados Unidos, taxas que variaram entre 26% e 78,3% de positividade para HPV foram encontradas. Em 1998, Schwartz et al. encontraram 25,8% de positividade em casos de CCEO com 67,2% das amostras HPV positivas possuindo DNA de HPVs de alto risco. Black et al. (2010) obtiveram 56% de casos positivos em CCE de cabeça e pescoço, com o HPV-16 como o tipo mais prevalente. Smith et al. (2012) encontraram prevalência de HPV de 26% em tumores de cabeça e pescoço, com 35,9% de positividade em casos na cavidade oral e de 64,2% na região orofaríngea. Em estudo realizado por Jordan et al. (2012), detectou-se a presença de HPV em 78,3% de 233 amostras de CCEO e o HPV-16 em 90,8% dos casos HPV-positivos. No Brasil, taxas que variam entre 0% e 80% tem sido relatadas no estado de São Paulo. Rivero e Nunes (2006), utilizando somente os primers GP5+/GP6+, encontraram todas as amostras negativas entre 40 casos de CCEO analisados. Já Acay et al. (2008) obtiveram 24% de positividade utilizando a técnica de hibridização in situ em 50 casos de lesões orais envolvendo leucoplasias, displasias e CCEO. Outro estudo, realizado neste mesmo estado por Miyahara et al. (2011) detectou 33,7% de amostras positvas entre 83 casos de CCEO com material parafinado. Assim como em casos de lesões orais, taxas variáveis da infecção pelo HPV tem sido reportadas em trabalhos realizados em mucosa oral saudável (Tabela 2) sugerindo o funcionamento. desta. como. reservatório. do. vírus. (GILLISON. et. al.,. 2012;. KRISTOFFERSEN et al., 2012; DURZYHSKA et al., 2011; TURNER et al., 2011). Em estudo populacional conduzido nos Estados Unidos entre 2009 e 2010, a prevalência de HPV foi de 6,9%, com 3,7% das infecções assintomáticas por HPV de alto risco e 3,1% por HPV de baixo risco oncogênico (GILLISON et al., 2012). Nesse mesmo país, Turner et al. (2011) obtiveram 2,6% de positividade, todos para o HPV tipo 16, em amostras de saliva. Por sua vez, Mbulawa et al. (2014) encontraram prevalência de 8,4% ao pesquisar fatores de risco para o HPV oral em casais africanos. Trabalho realizado por Durzunska et al. (2011) encontrou DNA de HPV em mucosas sadias de 1,08% de crianças e adolescentes poloneses, enquanto em estudo conduzido no Paquistão 24,5% dos indivíduos analisados foram HPV positivos (GICHKI et al., 2012)..

(18) 5 Tabela 1 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em lesões orais diversas AUTOR/ANO. País. Tipos de lesão. Material avaliado. Técnica detecção. de Nº total. Prevalência. Tipos de HPV. Rivero e Nunes, 2006. Brasil. CC EO. Tecido parafinado Tecido fresco. GP-PCR. 23. 0%. -. Ndiaye et al, 2013 Mravak-Stipetic et al., 2013. Senegal Croácia. Tecido parafinado Raspado. Quintero et al., 2013. Colômbia. CCE-CP Lesões variadas em mucosa oral CCE-CP. Acay et al., 2008. Brasil. Tecido parafinado. Termine et al., 2012. Itália. Leucoplasias e CCEO CCEO. PCR + DEIA MY-PCR + TEPCR GP-PCR + hibridização Hibridização in situ Linear Array. 17 117 254. 0% 3,4% 17,7%. 175. 18,9%. 16, 35, 45 6/11, 16, 31, 33, 52, 58, não tipado 16, 18. 50. 24%. 6/11, 16/18, 31/33, não tipado. 83. 25,3%. 284. 25,8%. Tecido parafinado. MY-PCR + TEPCR MY/GP-PCR. 6, 16, 18, 23, 33, 35, 39, 66, não tipado 6/11, 16, 18, 31/33. Schwartz et al., 1998. Estados Unidos. CCEO. Raspado. Kristoffersen et al., 2012. Noruega. Elamin et al., 1998. Inglaterra. Sugiyama et al., 2003. Japão. Black et al., 2010 Jordan et al., 2012 Morbini et al., 2012. Estados Unidos Estados Unidos Itália. Leucoplasias e CCEO Displasias e CCEO Displasias e CCEO CCE-CP CCEO Displasias e CCE-CP. 100. 40%. 6, 11,não tipado. Tecido fresco. MY/GP-PCR. 40. 45%. 6, 16. Tecido parafinado. TE-PCR. 137. 51,82%. 16, 18. Tecido parafinado Tecido parafinado Raspado. Linear Array Linear Array Linear Array. 16 233 56. 56% 78,96% 87,5%. 6, 16, 69 6/11, 16, 18, 33, 35, 51, 58 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 59, 66, 69/71, 74. Tecido parafinado. Raspado. CCEO - Carcinoma de Células Escamosas da Cavidade Oral; CCE-CP - Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço; PCR - Reação em Cadeia da Polimerase; DEIA - DNA Enzyme Immunoassay; TE-PCR - Reação em Cadeia de Polimerase Tipo Específica..

(19) 6 Tabela 2 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em mucosa oral saudável fora do Brasil AUTOR/ANO Durzynska et al., 2011. País Polônia. Método de coleta Enxaguatório bucal. Técnica de detecção MY-PCR. Nº total 4.150. Prevalência 1,08%. Tipos de HPV 6, 11, 12, 57. Turner et al., 2011. Estados Unidos. Saliva. TE-PCR. 151. 2,6%. 16, 18. Mravak-Stipetic et al., 2013. Croácia. Esfoliação. MY-PCR. 73. 6,8%. Não tipado. 5.501. 6,9%. 6, 16, 18, 31, 33, 35, 39,. + TE-PCR Gillison et al., 2012. Estados Unidos. Enxaguatório bucal. Linear Array. 42, 45, 51, 52, 53, 55, 56, 59, 61, 62, 66, 68, 72, 81, 84, 89 Mbulawa et al., 2014. África do Sul. Esfoliação. Linear Array. 442. 8,4%. 11, 16, 31, 33, 35, 42, 51, 52, 53, 58, 59, 55, 61, 62, 69, 71, 72, 81, 84, 89. Kero et al., 2012. Finlândia. Esfoliação. MY/GP- PCR. 131 - 106. 18,6% - 31,1%. 6, 11, 16, 18, 33, 43, 66, 70, 82. Gichki et al., 2012. Tailândia. Esfoliação. RT-PCR. 192. 24,5%. 16, 18. Sugiyama et al., 2003. Japão. Tecido parafinado. TE-PCR. 44. 36%. 16. Kristoffersen et al., 2012. Noruega. Esfoliação. MY/GP-PCR. 50. 56%. 6, 11, 16, não tipado. RT-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real; TE-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase Tipo Específica..

(20) 7. Tabela 3 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em mucosa oral saudável no Brasil AUTOR/ANO. Estado. Método de coleta. Técnica de detecção. Nº total. Prevalência. Tipos de HPV. Esquenazi et al., 2010. Rio de Janeiro. Esfoliação. MY/GP - PCR. 100. 0%. -. Machado et al., 2014. Mato Grosso do Sul. Esfoliação. PGMY-PCR + RFLP 514. 1,3%. 6, 11, 52, 53, 89. + TE-PCR Cavenaghi et al., 2013. São Paulo. Bochecho. Linear Array. 145. 2,4%. 55, 58. Marques et al., 2013. Distrito Federal*. Esfoliação. GP-PCR. 64. 3,12%. Genotipagem não realizada. Tristão et al., 2012. São Paulo. Esfoliação. MY-PCR. 125. 23,2%. Genotipagem não realizada. Araújo et al., 2014. Pará. Esfoliação. MY-PCR + RT-PCR. 166. 24,1%. 6, 18, 58. Brasil et al., 2013. Pernambuco. Esfoliação. MY-PCR. 62. 54%. Genotipagem não realizada. Zonta et al., 2012. São Paulo. Esfoliação. MY-PCR + RFLP. 27. 81,48%. 16, 18, 39, 58, 59, não identificado. RT-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real; TE-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase Tipo Específica..

(21) 8. No Brasil (Tabela 3), pesquisa realizada com jovens universitários no Rio de Janeiro não detectou infecção por HPV em nenhuma das amostras de raspado de mucosa oral sadia (ESQUENAZI et al., 2010). Entretanto, estudo de Tristão et al. (2012) no estado de São Paulo obteve prevalência de 23,2% em mucosas saudáveis. Araújo et al. (2014), no estado do Pará, encontraram 24,1% de positividade em suas amostras utilizando apenas os primers MY09/MY11. Ao mesmo tempo, em estudo realizado em uma casa prisional de São Paulo com a associação da técnica de PCR e enzimas de restrição, Zonta et al. (2012) detectaram o HPV em 85,18% de amostras de mucosa oral saudável em mulheres presas que possuíam lesões cervicais e, dessas, 81,48% apresentam-se infectadas por HPV de alto risco oncogênico. Brasil et al. (2013) detectaram prevalência do vírus de 54% em mucosa oral sadia de mulheres cujos parceiros possuíam lesões de pênis relacionadas ao HPV. Pesquisas comparativas da presença do HPV em mucosas orais, com lesão e sadias tem sido realizadas em todo o mundo. Sugiyama et al. (2003), avaliando apenas a presença dos tipos virais 16 e 18, obtiveram 36%, 61% e 35% de casos positivos em amostras de mucosa sadia, displásica e casos de CCEO, respectivamente, no Japão. Estudo realizado na Noruega detectou prevalências de 64% em leucoplasias e de 16% e 56% em amostras de CCEO e de mucosa saudável, respectivamente (KRISTOFFERSEN et al., 2012).. 1.3. Fisiopatologia do HPV. As infecções pelo HPV podem variar do estabelecimento de formas assintomáticas à indução de cânceres de células escamosas (ARIRACHAKARAN et al., 2013; UPILE et al., 2012). Em sua maioria, os indivíduos infectados apresentam infecções subclínicas e livram-se naturalmente do vírus sem saber sequer que já foram expostos a ele (BHARTI et al., 2013; UPILE et al., 2012). Porém, uma pequena parcela de indivíduos desenvolve desde lesões benignas até certos cânceres relacionados ao vírus (UPILE et al., 2012; BEUTNER, TYRING, 1997). Não se sabe ao certo qual a base molecular das infecções subclínicas, contudo acredita-se a resposta imune do hospedeiro e a quantidade de proteínas virais produzidas são fatores limitantes da infecção e contribuem significativamente para seu estado de latência (ARIRACHAKARAN et al., 2013; BEUTNER, TYRING, 1997)..

(22) 9. As replicações e transcrições virais estão diretamente relacionadas ao grau de diferenciação da célula infectada (BEUTNER, TYRING, 1997). Inicialmente, uma partícula viral penetra em células da camada basal e também em células indiferenciadas em divisão do epitélio, nas quais apenas genes precoces são transcritos. Nas camadas mais superficiais do epitélio ocorre a expressão de genes tardios do vírus, com replicação do DNA e a produção de novas unidades virais (OLIVEIRA et al., 2003; BEUTNER, TYRING, 1997). A replicação do DNA viral ocorre exclusivamente no núcleo da célula hospedeira para todos os tipos de HPV. Demonstrou-se que em lesões malignas associadas aos tipos virais 16 e 18 de alto risco oncogênico, o DNA viral normalmente encontra-se integrado ao genoma hospedeiro, enquanto em lesões benignas o DNA viral se apresenta e se replica na forma episomal (FELLER et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2003; BEUTNER, TYRING, 1997). Alguns fatores são essenciais ao início do desenvolvimento de tumores, como alterações em genes que controlam a progressão do ciclo celular e genes que trabalham no reparo do DNA (FELLER et al., 2010). Vários vírus são conhecidos por serem associados ao desenvolvimento de tumores. Essa capacidade de transformação de alguns vírus está relacionada à interferência de proteínas virais no controle de mecanismos de replicação celular (UPILE et al., 2012). Carcinomas de células escamosas associados aos HPVs de alto risco expressam em suas células as proteínas virais E6 e E7 (FELLER, LEMMER, 2012; UPILE et al., 2012; FELLER et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2003). As ações dessas oncoproteínas se complementam e, quando associadas, promovem a instabilidade genômica que predispõe à malignidade das células do hospedeiro através da inativação de mecanismos de controle do ciclo celular e da apoptose (Figura 2) (FELLER et al., 2010)..

(23) 10. Figura 2 – Fluxograma da patogênese do carcinoma de células escamosas associado a HPV de alto risco (adaptado de FELLER et al., 2010).. A principal atividade da proteína E6 de HPVs de alto risco é a degradação do gene supressor de tumor p53, o qual está diretamente relacionado à retenção da progressão do.

(24) 11. ciclo celular da fase G1 para a fase S. Interferências no gene p53 levam ao acúmulo de DNA danificado, elevação da proliferação celular e sobrevivência celular prolongada (RAMSHANKAR, KRISHNAMURTHY, 2013; FELLER et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2003). A oncoproteína E7, por sua vez, se liga ao gene do Retinoblastoma (Rb), supressor de tumor e apoptose, inativando-o e induzindo a transição do ciclo celular para a fase S. Isso causa ativação de mecanismos de síntese de DNA e replicação celular que se encontram inativos em células epiteliais maduras saudáveis, gerando crescimento celular patológico (FELLER et al., 2010; SIMONATO, MIYAHARA, 2007; OLIVEIRA et al., 2003). Na ausência da proteína E6 de HPVs de alto risco, a proteína E7 causa índices aumentados de p53, levando a respostas apoptóticas, sendo necessárias as atividades de indução da sobrevivência celular da oncoproteína E6 para que os efeitos patológicos da proteína E7 sejam mantidos (FELLER et al., 2010; MUNGER, HOWLEY, 2002).. 1.4. Diagnóstico do HPV. O diagnóstico da infecção pelo HPV pode ser realizado através de métodos não moleculares e moleculares. Os métodos não moleculares incluem a inspeção visual por histopatologia, detectando alterações cito e histopatológicas resultantes da infecção pelo vírus, sendo assim considerados métodos indiretos. Os métodos moleculares, denominados métodos diretos, detectam a presença do genoma do HPV ou seus transcritos na amostra clínica (IARC, 2007). A citologia convencional foi introduzida na década de 1940 no screening do câncer cervical, com 68% de sensibilidade na detecção de qualquer alteração citológica. No fim do século passado, a Citologia em Base Líquida (CBL) começou a ser utilizada, possuindo vantagens sobre a citologia convencional como diminuição do número de amostras insatisfatórias e aumento na taxa de detecção de anormalidades citológicas (SANGKARAT et al., 2014). Apesar de inicialmente utilizada apenas na ginecologia, a CBL tem sido usada na avaliação patológica de diversos outros órgãos, assim como para outros métodos não citológicos como testes de biologia molecular e genotipagem de HPV (IMURA et al., 2014). Atualmente não há normas estabelecidas internacionalmente de detecção do HPV em cânceres de cabeça e pescoço para uso em diagnóstico e ensaios clínicos.

(25) 12. (RAMSHANKAR, KRISHNAMURTHY, 2013; JORDAN et al., 2012). A avaliação de casos destes cânceres inclui desde a avaliação histológica clássica até testes moleculares para a detecção do vírus (WIERZBICKA et al., 2013). Diversos métodos de biologia molecular, como Southern blotting, Hibridização in situ, Captura Híbrida e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido utilizados na detecção do HPV. O método da PCR é o mais sensível para detecção do vírus em amostras biológicas (QUINTERO et al., 2013; VIDAL et al., 2012; CARVALHO et al., 2010; RIVERO, NUNES, 2006; HUBBARD et al., 2003). Por possuir melhor sensibilidade e baixos valores preditivos negativos, a PCR é considerada o padrão ouro para identificação desse vírus (ACAY et al., 2008). Para a amplificação de segmentos-alvo são necessários iniciadores, denominados primers, que podem ser gerais ou específicos (CASTRO et al., 2009; RIVERO, NUNES, 2006). Os primers consensus GP5+/GP6+ e MY09/MY11 são os iniciadores gerais mais utilizados (VIDAL et al., 2012; CASTRO et al., 2009; WINDER et al., 2009; HUBBARD et al., 2003; IFTNER, VILLA, 2003). Esses iniciadores amplificam sequências-alvo do segmento L1 do genoma do HPV, sendo capazes de identificar diversos tipos do vírus (VIDAL et al., 2012; IFTNER, VILLA, 2003; QU et al., 1997). O capsídeo do HPV é composto por proteínas codificadas pelos genes L1 e L2 da região tardia. O L1 é o mais conservado e parece ser o mais polimórfico no DNA do HPV. Devido a isso, esse segmento é um dos mais analisados para sua detecção e genotipagem (CARVALHO et al., 2010; ESQUENAZI et al., 2010; HUBBARD et al., 2003). A detecção do DNA viral pode ser feita utilizando-se os primers gerais MY09/MY11 ou GP5+/GP6+ em uma reação de PCR convencional, na qual apenas um par de primers é utilizado (VIDAL et al., 2012; CASTRO et al., 2009; WINDER et al., 2009; IFTNER, VILLA, 2003). Porém reações de nested PCR, caracterizadas pelo uso de pares de primers diferentes em reações consecutivas, tornam a técnica ainda mais sensível (CARVALHO et al., 2010; WINER et al., 2009; BRITTO et al., 2005). Nessa técnica, o amplicon gerado na primeira reação é reamplificado com outro par de primers, específico para uma sequência interna presente neste produto (BRITTO et al., 2005). Para a detecção do HPV, comumente é utilizado o par MY09/MY11 na primeira reação e GP5+/GP6+ na etapa nested (VIDAL et al., 2012) (Figura 3)..

(26) 13. Figura 3 – Gel de agarose a 2% mostrando bandas positivas para HPV usando os primers GP5+/GP6+; P.M. – Peso Molecular; + - Controle Positivo; NEG- Controle Negativo.. A PCR em tempo real (RT-PCR) é uma variação da PCR tradicional que é também empregada para a detecção do HPV. A RT-PCR fornece resultados quantitativos dos produtos de amplificação através da captação de fluorescência emitida à medida que os ciclos da reação ocorrem e diretamente proporcional ao número de fragmentos amplificados (BRITTO et al., 2005). Devido à grande diversidade de tipos virais existentes e sua relação com diferentes manifestações clínicas, fez-se necessário o desenvolvimento de técnicas para a identificação de tipos de HPV presentes em amostras biológicas (Figura 4). Com este fim, PCR primer-específicos baseada em polimorfismos das proteínas E6 e E7 tem seu uso fortemente relatado na literatura e vão desde reações para tipagem de apenas um tipo de HPV até reações de multiplex, nas quais um pool de primers permite a identificação concomitante de dois ou mais tipos virais (CARVALHO et al., 2010)..

(27) 14. Figura 4 – Gel de agarose a 2% mostrando amostras positivas para HPV-6 usando multiplex com primers específicos para os tipos HPV-6, HPV-16 e HPV-18. P.M.- Peso Molecular; 6+ - Controle Positivo para o HPV-6; 16+ - Controle Positivo para o HPV-16; 18+ - Controle Positivo para o HPV-18.. Métodos de identificação simultânea de diversos tipos de HPV em uma única reação tem sido desenvolvidos para uso em amostras clínicas. A técnica do Linear Array é qualitativa e se baseia na amplificação do DNA viral por PCR e posterior hibridização dos amplicons com detecção colorimétrica da ligação destes a sondas oligonucleotídicas (ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, 2012; BLACK et al., 2010). Alguns kits baseados nesse método encontram-se disponíveis no mercado, como o teste de genotipagem Linear Array HPV (Roche Diagnostics) que é capaz de detectar trinta e sete tipos de HPV anogenitais (Figura 5) (ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, 2012; BLACK et al., 2010)..

(28) 15. Figura 5 – Exemplo do teste de genotipagem Linear Array HPV (Roche Diagnostics). Controles internos e sinal de hibridização para HPV 16 são mostrados (BLACK et al., 2010).. 1.5. Lesões orais e HPV. Considerado o fator mais importante no desenvolvimento do câncer de colo uterino, estudos tem investigado o papel do HPV na carcinogênese oral e encontrado evidências de seu envolvimento no processo, chegando o Instituto Nacional do Câncer (INCA), órgão do Ministério da Saúde responsável pelo combate ao câncer, a apontá-lo como um dos principais fatores de risco para o câncer oral (INCA, 2011). Mudanças no comportamento sexual de homens e mulheres podem estar associadas ao aumento dos casos da infecção por HPV na cavidade oral (RAGIN et al., 2011). Entretanto, a detecção do HPV em epitélio de mucosa oral normal ainda não permite inferências mais precisas quanto ao seu papel na carcinogênese, ou seja, se o vírus é o principal agente etiológico, se é um coadjuvante ou se apenas está presente no epitélio oral, atuando como um comensal que pode vir a se tornar patogênico (ESQUENAZI et al, 2010)..

(29) 16. Alguns tipos de HPV podem infectar o trato aerodigestivo superior e causar lesões benignas, como papilomas de células escamosas, condiloma acuminado, hiperplasia epitelial focal e verruga vulgar (ESQUENAZI et al., 2010; CASTRO et al., 2009; SCHWARTZ et al., 1998). Como pode ser observado na Tabela 4, essas lesões estão associadas principalmente aos tipos 2, 4, 6, 7, 11, 13 e 32, considerados de baixo risco oncogênico. Outros tipos, como os de alto risco oncogênico 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 66, são associados a lesões malignas da cavidade oral, principalmente ao carcinoma de células escamosas (ESQUENAZI et al, 2010; CASTRO et al., 2009; ACAY et al., 2008).. Tabela 4. Principais tipos de HPV relacionados a manifestações clínicas orais. Manifestação clínica. Principais tipos relacionados. Hiperplasia epitelial focal. 13, 32. Papiloma escamoso oral. 6, 11. Condiloma acuminado oral. 6, 11. Verruga vulgar. 1, 2, 4, 6, 7, 11, 16. Líquen plano. 11, 16. Carcinoma verrucoso oral. 6, 11, 16, 18. Leucoplasia oral. 6, 11, 16. Carcinoma de células escamosas oral. 16. Papilomatose oral recorrente. 6, 11. Fonte: (BHARTI et al., 2013; CASTRO et al., 2004). Fatores químicos, físicos e biológicos estão relacionados ao desenvolvimento de lesões orais. O consumo de álcool e de tabaco é considerado o fator mais importante na carcinogênese oral, sendo associado à maioria dos casos desse tipo de câncer. Porém, discute-se a necessidade de coexistência entre esses e outros fatores como alimentação pobre em nutrientes, higiene bucal precária, exposição à radiação ultravioleta e presença de agentes infecciosos, além da existência de predisposição genética, para que o câncer oral se desenvolva. Entre os agentes infecciosos associados ao câncer oral, tem-se discutido a correlação da infecção por HPV em mucosa oral e o desenvolvimento e/ou agravamento.

(30) 17. das lesões (ACAY et al., 2008, CAMPOS et al., 2007; ROCHA et al., 2007; SIMONATO, MIYAHARA, 2007; SOUZA JÚNIOR, 2006; VIDAL et al., 2004). Dados recentes mostram que consumo de álcool/tabaco e a presença do HPV são fatores de risco independentes, não estando associados às mesmas lesões. Tem sido sugerida uma divisão desses cânceres em dois grupos distintos e demonstrado que pacientes que apresentam lesões HPV-positivas possuem melhor prognóstico e maiores taxas de sobrevivência (SMITH et al., 2012; TURNER et al., 2011). O câncer oral é um dos tipos de câncer mais comuns no mundo, apresentando elevadas taxas de incidência no centro-sul asiático, Europa oriental e central, África e América Central (INCA, 2011; CAMPOS et al., 2007; VIDAL et al., 2004). Estima-se a ocorrência mundial, em 2012, de 264 mil novos casos e 128 mil óbitos em decorrência da doença (INCA, 2011). No Brasil, o câncer oral encontra-se entre os dez tipos mais incidentes e é considerado um grave problema de saúde pública (HONORATO et al., 2009; SIMONATO, MIYAHARA, 2007; VIDAL et al., 2004). Segundo estimativas do INCA para o ano de 2012, excluindo-se o câncer de pele não-melanoma, no nordeste o câncer oral foi o quarto mais frequente em homens e o oitavo em mulheres, com 14.170 novos casos. No estado de Sergipe foi o quinto mais frequente, com incidência estimada de 130 casos (INCA, 2011). Pacientes com câncer oral apresentam baixas taxas de sobrevida, o que se acredita ser devido a sua detecção comumente tardia (HONORATO et al., 2009; SOUZA JÚNIOR, 2006). Isso causa também altos índices de deformações maxilofacial e bucal nos pacientes em tratamento de quadros mais evoluídos, o que leva a marcantes impactos psicológicos nos mesmos (VIDAL et al., 2011; CAMPOS et al., 2007; SOUZA JÚNIOR, 2006). Atualmente, estima-se a presença do HPV em 60% dos casos de câncer de cabeça e pescoço nos Estados Unidos (UPILE et al., 2012). Hoje essa relação está bem estabelecida e evidências crescentes reforçam seu papel em um subtipo desse câncer, o Carcinoma de Células Escamosas Oral (CCEO) (NDIAYE et al., 2013; QUINTERO et al., 2013; SMITH et al., 2012; UPILE et al., 2012; ROCHA et al., 2007; VENTURI et al., 2004). Pesquisas tem sido realizadas visando avaliar a capacidade de proliferação celular entre CCEO HPV-positivos e HPV-negativos e aumento progressivo e significativo dessa capacidade tem sido encontrado quando comparados com mucosa oral normal, indicando participação viral no estabelecimento dessa doença (ROCHA et al., 2007)..

(31) 18. O CCEO é o tipo de tumor maligno que mais afeta a cavidade oral, representando cerca de 90% de todos os casos e é mais comum em pacientes do sexo masculino, com idade mais baixa e que apresentam comportamento sexual de risco (QUINTERO et al., 2013; VENTURI et al., 2004). Estudos tem associado o HPV principalmente a cânceres de cabeça e pescoço que se desenvolvem na base da língua e nas tonsilas palatinas, mas apontam também para a sua presença em casos de cavidade oral e de laringe (QUINTERO et al., 2013; UPILE et al., 2012). O achado da presença do HPV em mucosas orais normais e de prevalências variáveis do mesmo em estudos que avaliaram lesões orais tornam sua relação com o processo de carcinogênese oral ainda mais controversa (HONORATO et al., 2009; MOSELE et al., 2009; ACAY et al., 2008; CAMPOS et al., 2007; ROCHA et al., 2007; SIMONATO, MIYAHARA, 2007). Novos estudos que busquem uma melhor compreensão da relação entre o desenvolvimento dessas lesões e a infecção por HPV são necessários..

(32) 19. 2. OBJETIVOS. 2.1. Geral  Detectar e genotipar o Papilomavirus Humano (HPV) em mucosas orais de pacientes do estado de Sergipe.. 2.2. Específicos  Detectar e genotipar o HPV presente em amostras colhidas por esfoliação de lesões orais através da técnica de PCR;  Detectar e genotipar o HPV presente em amostras colhidas por esfoliação de mucosas orais saudáveis através da técnica de PCR;  Avaliar na população estudada os tipos de HPV encontrados em relação às diferentes lesões orais identificadas;  Comparar a ocorrência do HPV encontrada através de PCR com os índices de detecção das atipias celulares obtidos pela histopatologia.  Comparar a ocorrência do HPV e seus tipos em mucosa oral saudável de pacientes usuários e não usuários de múltiplas drogas..

(33) 20. 3. MATERIAL E MÉTODOS. 3.1. Delineamento do estudo. Foi realizado estudo transversal no período de janeiro de 2013 a março de 2014. A população do estudo caracterizou-se por todos os pacientes atendidos no ambulatório de Odontologia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe (HU-UFS) que apresentavam lesões em mucosa oral clinicamente detectáveis; por pacientes selecionados randomicamente que possuíam mucosa oral saudável atendidos neste ambulatório e por todos os usuários de múltiplas drogas internos nas clínicas e instituições de recuperação de usuários de álcool e drogas do estado de Sergipe localizadas nas cidades de Aracaju e São Cristóvão que foram avaliadas. Foram excluídos da pesquisa apenas pacientes que não tiveram seu Termo de Consentimento Livre Esclarecido assinado pelo próprio paciente ou responsável (Anexos 1 e 2). Dados clínicos associados a fatores de risco para o desenvolvimento do câncer oral e dados socioeconômicos foram coletados do prontuário do paciente e um questionário para avaliação mais detalhada foi aplicado (Anexo 3).. 3.2. Coleta. Para análise histopatológica, pequenos fragmentos do tecido lesionado foram retirados manualmente com bisturi. O material coletado foi fixado em formalina e embebido em parafina e cortes posteriores foram realizados em micrótomo, corados com hematoxilina/eosina e analisados através de microscopia ótica por profissional patologista no Departamento de Odontologia do HU-UFS. Para os estudos moleculares, as amostras foram coletadas por esfoliação da mucosa oral utilizando escovas citológicas estéreis nas regiões dos palatos mole e duro, assoalho oral, mucosa jugal bilateralmente e superfícies dorsal e ventral da língua (ESQUENAZI et al., 2010; CASTRO et al., 2009; XAVIER et al., 2007; RIVERO, NUNES, 2006; SCHWARTZ et al., 1998). O material coletado dos pacientes através de esfoliação de mucosa foi armazenado em tubos contendo etanol 70% e as amostras encaminhadas ao Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical (LEPAT) da Universidade Federal de Sergipe, onde seu DNA foi.

(34) 21. extraído, amplificado para detecção do gene da beta-globina e armazenado até realização da PCR para HPV. O material coletado foi armazenado a 4ºC até a extração do DNA e, após extração, o DNA purificado foi mantido em freezer a -20ºC até a realização da PCR (MELO et al., 2010). As reações de nested PCR e genotipagem do HPV foram realizadas no LEPAT e no Laboratório de Imunopatologia da Relação Materno-Fetal, do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina-UNESP em Botucatu/São Paulo.. 3.3. Pesquisa de HPV. 3.3.1. Extração de DNA. As amostras coletadas em álcool 70% foram armazenadas em tubos Falcon a 4ºC por no máximo 15 dias até o seu processamento. Os tubos foram centrifugados por 5min a 3500rpm e o sobrenadante desprezado. Diluiu-se o pellet em 500µL de solução de lise (NaCl 5M; Tris-HCl 0,5M pH7,6; EDTA 0,5M pH8,0; SDS 10%; Proteinase K 0,5mg/mL) e transferiu-se para tubos Eppendorf® que foram incubados em banho-maria a 60ºC por 5h. Adicionou-se 67µL de NaCl em cada amostra e estas foram levadas ao vórtex por 30s e então centrifugadas por 20min a 14000rpm a 4oC. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e adicionado 400µL de isopropanol gelado e as amostras foram armazenadas overnight a -20ºC. Após esse período, foram retiradas do freezer e centrifugadas por 20min a 14000rpm a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e adicionaram-se 400µL de etanol 70%, homogeneizando então no vórtex. As amostras foram centrifugadas por 10min a 14000rpm a 4oC e o sobrenadante descartado. Então, 30µL de TE foram adicionados, homogeneizando com a pipeta, e o DNA extraído permaneceu armazenado a -20ºC.. 3.3.2. Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). Inicialmente, em sala de pré-PCR, em capela de fluxo laminar previamente esterilizada por luz ultravioleta durante 15 minutos, foram preparados todos os mixes em volume de 18L compostos por 10L PCR Buffer Go Taq Green (Promega); 0,6L de cada primer na concentração de 10M; 6,8L de água Milli-Q autoclavada (Milli Q Plus,.

(35) 22. Milipore). Após preparo dos mixes, em bancada previamente higienizada, adicionou-se 2L da amostra pesquisada, obtendo-se volume final de reação de 20L. Como controle de qualidade da extração de DNA das amostras foi utilizado o par de primers RS42/KM29 (Tabela 5) para amplificação do gene da β-globina, constitutivo do DNA humano, gerando uma banda de aproximadamente 550 pares de base. As amplificações foram realizadas em termociclador Veriti® Thermal Cycler (Applied Biosystems), seguindo as condições de reação: 95ºC durante 5 minutos para a desnaturação inicial; 94ºC por 1 minuto, 60ºC por 1 minuto para anelamento dos primers e 72ºC durante 1 minuto para a amplificação, seguido por outros 35 ciclos idênticos ao descrito acima, finalizando com extensão de 10 minutos a 72ºC e manutenção das amostras a 4ºC. Um controle negativo foi utilizado em todas as reações, no qual o ácido nucléico foi substituído por 2L de água Milli-Q. Para todas as análises foram consideradas apenas as amostras que foram positivas para β-globina. Tabela 5 – Sequências de bases dos primers RS42/KM29, GP5+/GP6+, MY09/MY11 e primers HPV-6, HPV-16 e HPV -18 específicos. PRIMERS. SEQUÊNCIA DE BASES. RS42. 5’-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3’. KM29. 5’-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3’. GP5+. 5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’. GP6+. 5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’. MY09. 5’-CGTCCMAARGGAWACTGATC-3’. MY11. 5’-GCMCAGAWCATAAYAATGG-3’. 6F. 5’-GCTAAAGGTCCTGTTTCGAGGCGGCTA-3’. 6R. 5’-GGCAGCGACCCTTCCACGTACAAT-3’. 16L F. 5’-CGCACAAAACGTGCATCGGCTACC-3’. 16L R. 5’-TGGGAGGCCTTGTTCCCAATGGA-3’. 16U F. 5’-TCCTGCAGGTACCAATGGGGAAGAGG-3’. 16U R. 5’-TGCCATACCCGCTGTCTTCGCTTT-3’. 18 F. 5’-AACAGTCCATTAGGGGAGCGGCTGGA-3’. 18 R. 5’-TGCCGCCATGTTCGCCATTTG-3’. M = A/C; R = A/G; W = A/T; Y = C/T.. AMPLICON (pb) 550. 190. 450. 263. 217. 397. 187.

(36) 23. Para a amplificação do genoma do HPV foi utilizada a técnica de nested PCR utilizando os primers gerais GP5+/GP6+ e MY09/MY11 que amplificam sequências de pares de base da região L1 do DNA do HPV (SMITH et al., 2012; RIVERO, NUNES, 2006; SCHWARTZ et al., 1998). Os primers MY09/MY11 amplificam uma sequência aproximada de 450pb e o par GP5+/GP6+ amplifica uma sequência de aproximadamente 150pb (QU et al., 1997). Inicialmente 2L de cada amostra foram amplificados com os primers MY09/MY11 (GILLISON et al., 2012), com as condições de reação seguintes: 95ºC durante 5 minutos para a desnaturação inicial; 94ºC por 1 minuto, 50ºC por 1 minuto para anelamento dos primers e 72ºC durante 1 minuto para a amplificação, seguido por outros 35 ciclos idênticos ao descrito acima, finalizando com extensão de 10 minutos a 72ºC e manutenção das amostras a 4ºC. A segunda PCR consistiu na amplificação de 2L do produto da primeira PCR utilizando-se os primers GP5+/6+ (DURZYHSKA et al., 2011). A ciclagem para amplificação (GP5+/GP6+) seguiu os seguintes parâmetros: 95ºC durante 45 segundos para a desnaturação, 47,7ºC por 45 segundos para anelamento dos primers e 72ºC durante 1 minuto para a amplificação, seguido por outros 44 ciclos idênticos ao descrito acima, finalizando com extensão de 7 minutos a 72ºC e armazenamento das amostras a 4ºC. Um controle negativo foi utilizado em todas as reações, no qual o ácido nucléico foi substituído por 2L de água Milli-Q. Como controle positivo utilizou-se em todas as reações DNA-HPV extraído de células HeLa, que são células de adenocarcinoma cervical.. 3.3.3. Visualização dos produtos amplificados. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2% (Invitrogen) preparada em tampão Tris-Ácido Bórico-EDTA (TBE) 1X e corada Gel RedTM (BioLabs). O tamanho dos produtos amplificados foi comparado com o padrão de 100pb (GE Healthcare) e visualizados sob transiluminação ultra-violeta e as amostras positivas posteriormente encaminhadas para genotipagem.. 3.3.4. Genotipagem.

(37) 24. Para a genotipagem dos HPVs presentes nas amostras que foram positivas para DNA-HPV nas nested PCR foi utilizada a técnica de PCR multiplex por primers tipo específico. Os tipos virais 6, 16 e 18 foram detectados através da amplificação com primers específicos (Tabela 5) conforme descrito anteriormente por Marcolino et al. (2008). As reações foram realizadas em termociclador Eppendorf Mastercycle Personal com volume final de 20L compostos por 10L PCR Buffer Go Taq Green (Promega); 0,6L de cada primer na concentração de 10M; 5,2L de água Milli-Q autoclavada (Milli Q Plus, Milipore) e 2L da amostra pesquisada. As condições de reação utilizadas foram: desnaturação inicial a 94ºC durante 1 minuto; 37 ciclos de 94ºC por 1 minuto, anelamento a 53,5ºC por 30 segundos e amplificação a 72ºC durante 1 minuto; finalizando com extensão por 7 minutos a 72ºC e manutenção das amostras a 4ºC.. 3.4. Análise estatística. A análise descritiva foi realizada sob a forma de tabelas e os dados observados expressos pela frequência absoluta (n) e relativa (%). Para verificar a força de associação entre variáveis dependentes e independentes foram utilizados os recursos dos estudos analíticos empregando-se as técnicas de análises de correlação e de regressão. Estas permitiram, em uma segunda fase do processo de avaliação dos dados que compuseram o estudo descritivo, inferir sobre a associação entre exposição a fatores de risco para a infecção pelo vírus HPV e o achado de DNA viral nas amostras dos pacientes..

(38) 25. 4. ARTIGO 1. Título: Elevada ocorrência do Papilomavírus Humano (HPV) em lesões de mucosa oral em Hospital Universitário no estado de Sergipe, Brasil.. Revista: Journal of Oral Pathology & Medicine (Anexo 5). Situação: Em preparação.

(39) 26. ELEVADA OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM LESÕES DE MUCOSA ORAL DE PACIENTES ATENDIDOS EM AMBULATÓRIO ESPECIALIZADO EM SERGIPE, BRASIL. Título curto: Alta ocorrência do HPV em lesões orais no Brasil. Palavras-chave: Papilomavírus humano; lesões orais; PCR; Brasil. Autor para correspondência: Endereço: Email: Fax:.

(40) 27. ELEVADA OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM LESÕES DE MUCOSA ORAL DE PACIENTES ATENDIDOS EM AMBULATÓRIO ESPECIALIZADO EM SERGIPE, BRASIL. RESUMO. INTRODUÇÃO: As taxas de detecção de HPV na cavidade oral relatadas na literatura variam consideravelmente em todo o mundo e fazem da relação entre o HPV e a carcinogênese oral algo ainda controverso. OBJETIVO: Avaliar a ocorrência da infecção pelo HPV e de seus genótipos em pacientes com lesões orais atendidos no Ambulatório de Diagnóstico Oral do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe (HU-UFS). MÉTODOS: Foram avaliados 21 pacientes com idade entre 2 e 83 anos, com lesões clinicamente detectáveis na mucosa oral. As amostras foram coletadas por esfoliação da mucosa oral e a pesquisa de DNA-HPV foi realizada utilizando os primers MY09/MY11 e GP5+/GP6+. A genotipagem foi realizada através de multiplex-PCR com primers específicos. RESULTADOS: Foram diagnosticadas histopatologicamente lesões benignas, pré-malignas e malignas da cavidade oral. . A ocorrência do DNA-HPV foi de 80.95%. O HPV-6 esteve presente em 47.62% das amostras positivas, seguido por HPV-18 em 19.05% e do HPV-16 em 4.76%. A detecção relativa de HPV de acordo com o tipo de lesão foi de 66,67% nos casos de papiloma; 83,33% em carcinomas; 100% em hiperplasia e 81.82% nos casos que apresentavam displasia. CONCLUSÕES: A elevada ocorrência de HPV em lesões orais encontrada em nosso estudo difere das encontradas em outros realizados no Brasil. A presença do HPV em todos os tipos de lesões avaliadas torna necessário estudos adicionais relativos à distribuição do HPV em lesões orais para auxiliar no entendimento da história natural da doença.. INTRODUÇÃO. O câncer oral é um dos tipos de câncer mais comuns no mundo (1-3). Em 2012, estimou-se a ocorrência mundial de 264 mil novos casos e 128 mil óbitos em decorrência da doença (1). No Brasil, o câncer oral encontra-se entre os dez tipos mais incidentes e é.