UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos
ANA CARLA DE MATOS
AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL ESTROGÊNICO DE PLANTAS DA MEDICINA POPULAR NO BRASIL
ANA CARLA DE MATOS
AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL ESTROGÊNICO DE PLANTAS DA MEDICINA POPULAR NO BRASIL
Orientadora: Profa. Dra. Juliana Alves Macedo
Campinas-SP, 2018
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Alimentos e Nutrição, na área de: Consumo e Qualidade de Alimentos.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA: ANA CARLA DE MATOS E ORIENTADA PELA PROFESSORA DRA. JULIANA ALVES MACEDO
BANCA EXAMINADORA
______________________________ Prof. Dr. Jorge Herman Behrens
Presidente
Universidade Estadual de Campinas
_____________________________ Prof. Dr. Marcelo Bispo de Jesus
Membro Titular
Universidade Estadual de Campinas
_____________________________ Prof. Dr. Ruann Janser Soares de Castro
Membro Titular
Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedicatória
Dedico este trabalho à minha família que sempre foi meu apoio e incentivo, e a todos os professores que me inspiram em seguir a carreira acadêmica.
Agradecimentos
Aos meus pais, José e Luzia, por transformarem os meus sonhos em seus, por serem sempre minha fortaleza, por me ajudar a superar meus medos e estarem sempre prontos a me ouvir.
À minha irmã Mônica e meu irmão Ederson, meus primeiros professores: obrigada por acreditarem em mim e por me fazerem acreditar também!
Ao Fernando Afonso, por estar presente nos piores momentos e por me ajudar a superá-los. Pelo apoio, amor e paciência: muito, muito obrigada!
À Fabiana Liste, pelas horas de conversa, incontáveis cafezinhos e pelo carinho. À minha querida orientadora, Profa. Juliana, por todos os ensinamentos, paciência (muita paciência) e carinho. Por me conduzir de maneira tão exemplar e cuidadosa.
Aos prezados professores membros da banca de mestrado por aceitarem o meu convite, pela atenção e contribuição com o meu trabalho.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram com a realização deste trabalho.
RESUMO
Mulheres, a partir da pré-menopausa, experimentam diversos sintomas relacionados com a baixa produção hormonal, tais como calores, insônia, depressão, riscos de fraturas, aumento do colesterol, entre outros. Os fitoestrogênios têm sido usados como alternativa natural à terapia de reposição hormonal por mulheres em todo o mundo, e são muitas as fontes vegetais citadas quando buscamos informações a respeito. Entretanto a maior parte delas carece de confirmação e de estudos a respeito dos riscos e eficácia. No Brasil, o consumo de ervas e raízes como medicamento é passado de geração para geração e hoje, com a facilidade de acesso que a internet proporciona é possível encontrar indicações de uso de milhares de ervas para o combate de todos os tipos de enfermidades, sendo necessária então cautela a respeito do uso desregulado desses produtos. O objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade antioxidante e o potencial estrogênico/antiestrogênico de extratos aquosos e hidroalcoólicos de sete espécies de plantas consumidas no Brasil, com indicações para o combate dos sintomas relacionados à menopausa: Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare, Echinacea purpurea, Colocasia sculenta, Zingibre officinalis e Pffafia glomerata. Os extratos foram produzidos conforme indicações populares de consumo (extratos aquosos, como chás, e extratos hidroalcoólicos, como as populares garrafadas). O potencial antioxidante foi avaliado inicialmente como forma de seleção indicativa da presença de flavonoides nas amostras e, portanto, potencialmente de compostos com atividade estrogênica. Todas as amostras foram testadas quanto ao potencial estrogênico pelo ensaio E-screen, que avalia a proliferação celular de células MCF-7 BUS (câncer de mama), devido à falta de discriminação dos extratos nos ensaios de atividade antioxidante. Nenhuma das amostras testadas induziram ou inibiram a proliferação celular nas células MCF-7 BUS, o que indica ausência de atividade estrogênica/antiestrogênica nos extratos como foram produzidos. Não houve diferença entre os métodos de extração.
Palavras-chave: menopausa, potencial estrogênico, fitoestrogenos, modelo in
ABSTRACT
Premenopausal women experience various symptoms related to low hormone production, such as hot flashes, insomnia, depression, fracture risk, and increased cholesterol, among others. Phytoestrogens have been used as a natural alternative to hormone replacement therapy by women around the world, and there are many plant sources cited when we seek information about them. However, most of them lack confirmation and studies of risk and efficacy. In Brazil, the consumption of herbs and roots as medicine is passed from generation to generation and today, with the ease of access that the Internet provides, it is possible to find indications of the use of thousands of herbs to combat all types of diseases, being cautious about the unregulated use of these products. The objective of this study was to evaluate the antioxidant capacity and the estrogenic/antiestrogenic potential of aqueous and hydroalcoholic extracts from seven species of plants consumed in Brazil, with indications to combat the symptoms related to menopause: Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare, Echinacea purpurea, Colocasia sculenta, Zingibre officinalis and Pffafia glomerata. The extracts were produced according to popular indications of consumption (aqueous extracts, such as teas, and hydroalcoholic extracts, such as the popular bottles). The antioxidant potential was evaluated initially as a form of selection indicative of the presence of flavonoids in the samples and, therefore, potentially of compounds with estrogenic activity. All samples were tested for estrogenic potential by the E-screen assay, which evaluates the cell proliferation of MCF-7 BUS cells (breast cancer), due to lack of discrimination of the extracts in the antioxidant activity assays. None of the samples tested induced or inhibited cell proliferation in MCF-7 BUS cells, indicating absence of estrogenic/antiestrogenic activity in the extracts as produced. There was no difference between extraction methods.
Key words: menopause, estrogenic potential, phytoestrogens, in vitro model, herbal extract, cell culture.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Estrutura química da estrona, estradiol e estriol. ... 18
Figura 2. Respostas aos compostos com interação com os ERs. ... 26
Figura 3. Folha da amoreira (Morus alba L.) ... 28
Figura 4. Folha de vítex ... 29
Figura 5. Folha de funcho... 30
Figura 6. Folha de Equinácea ... 31
Figura 7. Inhame ... 32
Figura 8. Esquema da produção de extratos aquosos e hidroalcoólicos. ... 40
Figura 9. Esquema de tratamento do ensaio E-screen. ... 45
Figura 10. Capacidade antioxidante pelo método de sequestro do radical DPPH. ... 55
Figura 11. Viabilidade celular em células MCF-7 BUS após 144 horas de tratamento com cinco concentrações de extrato aquoso e hidroalcoólico de Morus alba... 57
Figura 12. Viabilidade celular em células MCF7-BUS após 144h de tratamento com cinco concentrações de extrato aquoso e hidroalcoólico de Vitex agnus-castus. ... 57
Figura 13. Viabilidade celular em células MCF7-BUS após 144h de tratamento com cinco concentrações de extrato aquoso e hidroalcoólico de Foeniculum vulgare. ... 58
Figura 14. Viabilidade celular em células MCF-7 BUS após 144 horas de tratamento com cinco concentrações de extrato aquoso e hidroalcoólico de Echinacea purpurea (folha). ... 58
Figura 15. Viabilidade celular em células MCF-7 BUS após 144 horas de tratamento com cinco concentrações de extrato aquoso e hidroalcoólico de Colocasia sculenta. ... 58
Figura 16. Viabilidade celular em células MCF-7 BUS após 144 horas de tratamento com cinco concentrações de extrato aquoso e hidroalcoólico de Echinacea purpurea (raiz). ... 59
Figura 17. Viabilidade celular em células MCF-7 BUS após 144 horas de tratamento com cinco concentrações de extrato aquoso e hidroalcoólico de Zingibre officinalis. ... 59 Figura 18. Viabilidade celular em células MCF-7 BUS após 144 horas de tratamento com cinco concentrações de extrato aquoso e hidroalcoólico de Pfaffia glomerata. ... 59
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição dos receptores de estrogênio (ER) nos tecidos de mamíferos. ... 19 Tabela 2. Famílias dos fitoestrogênios, sua semelhança com o estrogênio endógeno, suas fontes e sua interação com o receptor de estrogênio (ER). Adaptado de Macdonald et al. (2003) ... 23 Tabela 3. Sumário das ervas medicinais selecionadas, nome científico, suas indicações de uso na medicina popular e sua origem. ... 34 Tabela 4. Rendimento dos extratos em porcentagem. ... 47 Tabela 5. Conteúdo de fenólicos totais dos extratos de folhas, expressos em mg de ácido gálico equivalente/Kg de amostra (mg AGE /kg). ... 48 Tabela 6. Capacidade antioxidante dos extratos, pelo método ORAC, expressos em concentração equivalente de Trolox (µmol/g)... 50 Tabela 7. Capacidade antioxidante dos extratos, pelo método FRAP, expressos em concentração equivalente de Trolox (µmol/g)... 53 Tabela 8. Viabilidade celular dos extratos aquosos e hidroalcoólicos das amostras testadas (concentração 1mg/mL). ... 60 Tabela 9. Atividade estrogênica expressa pela média de EP, seu DP e EPR de extratos aquosos e hidroalcoólicos de Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare e Echinacea pupurea avaliadas pelo ensaio E-screen. .... 63 Tabela 10. Atividade estrogênica expressa pela média de EP, seu DP e EPR de extratos aquosos e hidroalcoólicos de Colocasia suculenta, Echinacea pupurea, Zingibre officinalis e Pfaffia glomerata avaliadas pelo ensaio E-screen. ... 64 Tabela 11. Atividade antiestrogênica expressa pela média de EP, seu DP e EPR de extratos aquosos e hidroalcoólicos de Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare e Echinacea pupurea avaliadas pelo ensaio E-screen, em co-tratamento com E2. ... 65 Tabela 12. Atividade antiestrogênica expressa pela média de EP, seu DP e EPR de extratos aquosos e hidroalcoólicos de Colocasia suculenta, Echinacea pupurea, Zingibre officinalis e Pfaffia glomerata avaliadas pelo ensaio E-screen, em co-tratamento com E2. ... 66
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS E1 – Estrona E2 – Estradiol E3 – Estriol ER – Receptor de estrogênio TPM – Tensão pré-menstrual
ORAC – Capacidade de absorção dos radicais oxigenados TRAP – Potencial antioxidante reativo total
FRAP – Poder de redução do íon ferro
CUPRAC - Capacidade antioxidante reduzindo íons cúpricos ABTS – (ácido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) DPPH – 1,10-difenil-2-picrilhidrazil
TBARS – Substânicas Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico LDL – lipoproteína de baixa densidade
AGE – Ácido Gálico equivalente
AAPH – dicloreto de 2,2'-azobis(2-amidinopropano) RPMI – Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute DMSO – dimetilsulfóxido
TPTZ – Tripiridiltriazina FL – Fluoresceína
MCF7 BUS – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de mama (superexpressa ER)
ANOVA – Analysis of Variance
CPQBA – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas T0 – Média das absorbâncias das células controle no tempo 0
T1 – Média das absorbâncias das células controle
TA – Média das absorbâncias das células tratadas com amostra PBS – Tampão fosfato salina
SFB – Soro fetal bovino EP – Efeito proliferativo
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 15 2. OBJETIVOS ... 17 2.1. Objetivo Geral ... 17 2.2. Objetivos Específicos ... 17 3. REVISÃO DE LITERATURA ... 18
3.1. Estrogênio e receptores de estrogênio (ER) ... 18
3.2. Função do estrogênio e fitoestrogênios no organismo ... 20
3.3. Fitoestrogênios ... 22
3.4. Plantas da medicina popular brasileira com provável efeito estrogênico 26 3.4.1. Amora (Morus alba L.) ... 27
3.4.2. Vítex (Vítex agnus castus L) ... 28
3.4.3. Funcho (Foeniculum vulgare) ... 30
3.4.4. Equinácea (Echinacea pupurea L)... 31
3.4.5. Inhame (Colocasia esculenta L.) ... 32
3.4.6. Gengibre (Zingibre officinalis L.) ... 32
3.4.7. Ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata) ... 33
3.5. Compostos fenólicos e atividade antioxidante ... 35
3.6. Modelo celular para avaliação de atividade estrogênica ... 37
4. METODOLOGIA ... 39
4.1. Coleta das amostras ... 39
4.2. Produção dos extratos ... 39
4.3. Caracterização de compostos bioativos das amostras ... 41
4.3.1. Fenólicos totais ... 41
4.3.2. Atividade antioxidante ... 41
4.4.1. Cultura celular ... 43
4.4.2. Ensaio de citotoxicidade para E-screen (Sulforrodamina B) ... 43
4.4.3. E-screen ... 44 4.5. Análise estatística ... 46 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 47 5.2. Fenólicos totais ... 47 5.3. Atividade antioxidante ... 49 5.3.1. ORAC ... 49 5.3.2. FRAP ... 52 5.3.3. DPPH ... 54
5.3.4. Ensaio de citotoxicidade das amostras para E-screen ... 57
5.3.5. Avaliação do E-screen ... 61
6. CONCLUSÃO ... 70
1. INTRODUÇÃO
Na busca por tratamentos “mais naturais”, alternativos às drogas sintéticas, milhares de mulheres têm procurado na medicina popular alternativas para combater os males que advém da menopausa, seguindo indicações que, na maior parte das vezes, carecem de um embasamento científico. Por outro lado, mesmo as fontes que apresentam efeito comprovado em ensaios laboratoriais são ineficazes em uma parcela dos indivíduos, ou apresentam porcentagens tão baixas dos compostos bioativos que apresentam efeitos mínimos (GÜLTEKEIN E YILDIZ, 2006).
Reconhece-se que os fitoestrogênios, por sua semelhança estrutural com o hormônio 17β-estradiol, interagem com os receptores de estrogênio, apresentando atividade estrogênica ou antiestrogênica. Alguns dos fitoestrogênios já estudados têm sua atividade limitada por diversos fatores, como a fraca interação com os receptores de estrogênio (ERα e ERβ), a fonte vegetal (devido a interação dos fitoestrogênios com os demais componentes presentes nas plantas) e também a concentração – que é responsável pela ação bifásica desses compostos no organismo. Além de apresentar benefícios não relacionados com a interação com o receptor hormonal, como alta atividade antioxidante, comum na classe dos flavonoides, por exemplo, eles podem atuar na prevenção e tratamento de diversas doenças, inclusive de câncer hormônio dependente (câncer de mama e de próstata) (SEO et al., 2006; WEBB, 2007). Entretanto, o consumo diário dos fitoestrogênios pode trazer riscos para indivíduos considerados com alto risco de desenvolver a doença (ROBERTS, 2010).
Os fitoestrogênios, assim como o estrogênio endógeno, atuam em diversos tecidos: cérebro, ovários, ossos, próstata, testículos, rins e pulmões, atuando em vias de síntese e de transcrição gênica (KATZENELLENBOGEN et al., 2000). A proporção com que os receptores de estrogênio estão distribuídos nesses tecidos é um dos fatores que influencia as respostas obtidas com o uso de extratos com atividade estrogênica. Esses receptores atuam de forma distinta entre si, porém essas diferenças também carecem de mais estudos (MORITO et al., 2001; SEO et al., 2006).
Dessa forma, sabendo que o uso de plantas e extratos para fins terapêuticos tem profundos efeitos biológicos, é importante conhecer as fontes presentes na dieta e avaliar o seu potencial estrogênico e sua interação com os receptores – seja ela agonista ou antagonista, e também sua possível interação com outros medicamentos (AGRADI et al., 2002).
Neste estudo, buscamos caracterizar oito amostras popularmente consumidas no Brasil para o combate de sintomas relacionados com a menopausa ou outros efeitos estrogênicos, quanto a sua atividade antioxidante e sua atividade estrogênica através de estudo in vitro com células de câncer de mama estrogênio responsivas MCF-7 BUS.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Avaliação do potencial estrogênico de extratos de plantas com indicações da medicina popular brasileira, através de modelos in vitro de células tumorais de tecido mamário.
2.2. Objetivos Específicos
Selecionar plantas consumidas no Brasil com alguma referência em textos científicos ou com base em referencias populares encontradas em sites da internet, com possível ação estrogênica.
Preparar extratos hidrossolúveis e hidroalcoólicos das folhas e raízes das plantas selecionadas (para mimetizar chás e garrafadas, as formas mais populares de consumo dessas amostras).
Caracterizar os extratos em relação aos fenólicos totais e capacidade antioxidante in vitro das amostras, pelos métodos de ORAC, FRAP e DPPH; como indicação de alto teor de flavonoides e outros compostos com possível potencial estrogênico.
Avaliar o potencial estrogênico das amostras pelo ensaio E-screen com a linhagem tumoral de câncer de mama estrogênio responsiva (MCF-7 BUS).
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Estrogênio e receptores de estrogênio (ER)
Os estrogênios são esteroides de 18 carbonos derivados do colesterol, contendo um anel aromático insaturado A, com um grupo hidroxi-fenólico no carbono 3 e um grupo metil no carbono 13. É encontrado no organismo em três formas principais: estrona (E1) – um estrogênio mais fraco que o estradiol, produzido nos ovários e no tecido adiposo; estradiol – o estrogênio de maior atividade em circulação, também descrito como 17β-estradiol, ou E2; e estriol (E3) – a forma mais fraca de estrogênio endógeno, produzido no corpo a partir de outros estrogênios (Figura 1). São moléculas lipossolúveis e de baixo peso molecular e que servem como mensageiros celulares (KARAHALIL, 2006).
Figura 1. Estrutura química da estrona, estradiol e estriol.
A forma mais abundante e mais potente de estrogênio em circulação é o 17 β-estradiol (E2), produzido principalmente pelas células ovarianas em mulheres em idade fértil (WILLIAMS; STANGEL, 1996). Entretanto, durante a menopausa, a principal fonte de estrogênio passa a ser o tecido adiposo, que o produz em quantidade significativamente menor (KARAHALIL, 2006).
A literatura afirma que os estrogênios sinalizam para as células alvo através de dois mecanismos: i) mecanismo de ação "genômico", um mecanismo lento que envolve a difusão do hormônio através da membrana da célula neural, ligando-se a um dos receptores intracelulares, ERα ou ERβ, e ativando a regulação da transcrição de genes alvo, que, finalmente, resulta na síntese de
proteínas; ii) o mecanismo "não genômico" envolve as propriedades elétricas dos neurônios, e é um mecanismo de ação rápida, implicando que possam surgir a partir de uma interação direta do estradiol sobre receptores de membrana ou outros componentes celulares (LIEBERHERR et al., 1993; MIGLIACCIO et al., 1996; IMPROTA-BREARS et al., 1999).
Os dois receptores de estrogênio – ERα e ERβ, são proteínas solúveis de alta afinidade com o estradiol e que diferem entre si na estrutura do domínio AF-1 (N-terminal) (MORITO et al., 2001). Estudos indicam que essa diferença, assim como os ligantes e a presença de proteínas correguladoras, influenciam a função exercida pelo receptor e a sua resposta biológica quando ativado (KATZENELLENBOGEN et al., 2000; BARDIN et al., 2004). A distribuição dos ERs pelos tecidos também é outro fator que influencia a ação dos compostos com ação estrogênica; eles estão distribuídos em diversos tecidos do corpo dos mamíferos, variando os níveis e as proporções de cada um nas células alvo (Tabela 1) (KATZENELLENBOGEN et al., 2000).
Tabela 1. Distribuição dos receptores de estrogênio (ER) nos tecidos de mamíferos. S istem a Ne u ro end ó cr
ino Vesícula seminal
S istem a r eprod u tivo Tecido mamário Ó rg ãos V isc er a is Pulmão O u tr o s Osso
Pituitária Útero Fígado
Hipotálamo Vagina Rim
Cérebro Placenta
Testículo Ovário
Epidídimo Próstata
Enquanto alguns tecidos apresentam uma proporção semelhante de ERα e ERβ – cérebro e epitélio mamário; outros têm predominantemente o receptor β – estroma mamário, células granulosas do ovário, medula óssea e cólon; e alguns apresentam principalmente o receptor α – ossos, estroma da próstata, ovário e útero (KUIPER et al., 1996).
As respostas do organismo à presença de estrogênio endógeno ou proveniente da dieta são variáveis. Os estrogênios naturais, com destaque para o E2, têm grande afinidade com seus receptores e assim são sensivelmente mais potentes e facilmente metabolizados no fígado, não se acumulando nos tecidos. Os estrogênios ingeridos na dieta – majoritariamente fitoestrogênios, por outro lado, tendem a se acumular nos tecidos e nas gorduras, e por apresentarem menor afinidade com os ERs possuem atividade estrogênica muito menor (MOSQUETTE et al., 2005).
3.2. Função do estrogênio e fitoestrogênios no organismo
O estrogênio desempenha importantes papéis no organismo, como no metabolismo de carboidratos e minerais, no crescimento ósseo, no desenvolvimento dos orgãos sexuais femininos e no controle da ovulação e período menstrual. Durante o desenvolvimento do cérebro, os estrogênios têm um papel fundamental na diferenciação de áreas, e além da alta atuação no controle das funções endócrinas e comportamento reprodutivo, afeta as funções cognitivas e afetivas, modulando neurotransmissores que incluem a serotonina, dopamina, GABA e acetilcolina. A presença deste hormônio sexual pode atuar na proteção contra o aparecimento de doenças como esquizofrenia e depressão e doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer e Parkinson (MCEWEN; ALVES, 1999; CYR et al., 2000).
A menopausa é caracterizada pela drástica queda na produção de estrogênio, levando então a um desbalanceamento hormonal que é a causa de sintomas como o calor excessivo, suor noturno, depressão e insônia (WEBB, 2007). Ela também traz um risco aumentado de doença arterial coronariana, causado por mudanças no metabolismo de lipoproteínas, pela perda de secreção endógena de estrogênios. Ocorre ainda um aumento das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e diminuição de lipoproteínas de alta densidade (HDL) (DEWELL et al., 2002).
Apesar de não estarem completamente elucidados os mecanismos, sabe-se que os estrogênios atuam no crescimento e na diferenciação de muitos tecidos. No tecido ósseo a principal forma de atuação está relacionada com a reabsorção óssea. Estudos afirmam que além da presença de receptores de
estrogênio nas células osteoblásticas (ERIKSEN et al., 1988), o 17β-estradiol é capaz de induzir a apoptose em osteoclastos reduzindo assim a perda óssea excessiva pré e pós menopausa (HUGHES et al., 1996). As semelhanças estruturais entre os fitoestrogênios e o 17β-estradiol sugerem que estes poderiam reduzir a incidência de osteoporose em mulheres na menopausa, que são 4 a 5 vezes mais suscetíveis a fraturas que homens (mesmo considerando que os homens também estão sujeitos ao aumento de risco de osteoporose devido a menor produção hormonal em idade avançada) (WEBB, 2007).
Por essas razões, milhares de mulheres atualmente fazem uso de reposição hormonal tradicional na tentativa de combater a maior parte desses sintomas. Entretanto, devido aos indivíduos que não desejam ou não podem alçar mão deste recurso, os fitoestrogênios têm sido estudados como uma alternativa à terapia de reposição hormonal. Diversos estudos epidemiológicos e experimentais sugerem que o consumo de fitoestrogênios, além do potencial antioxidante comum a classe dos flavonóis, tem como efeito a redução de condições com relação direta com o estrogênio, tais como: os sintomas da menopausa, a perda de minerais nos ossos e doenças como o câncer de mama e neurodegenerativas (KUTUK; BASAGA, 2006).
Dependendo da concentração, os fitoestrogênios podem competir com o estradiol pela ligação ao receptor e também podem inibir enzimas, como a proteína quinase e tirosina quinase, contribuindo para os efeitos clínicos, entre eles, o efeito antiproliferativo (ALBERTAZZI; PURDIE, 2008). A atuação em outros aspectos da proliferação celular de tumores pode justificar a maior segurança atribuída ao uso de fitoestrogênios como uma alternativa à reposição hormonal tradicional.
Além da influência relacionada com sua interação com os ERs, os fitoestrogênios – assim como o estrogênio endógeno, parecem atuar em vias onde a ligação com o receptor de estrogênio ou a presença de um elemento estrogênio responsivo não é necessária. Estudos realizados com células ER(+) e ER(-) sugerem que, em baixas concentrações, os fitoestrogênios atuam através de um mecanismo mediado por ER, enquanto que em concentrações mais elevadas, é exercido um mecanismo de ação ainda não elucidada nas
células, uma vez que o crescimento tanto de células ER(+) quanto de ER(-) é inibido (RISHI, 2006).
3.3. Fitoestrogênios
Fitoestrogênios são definidos como “...qualquer substância vegetal ou metabólito que induz respostas biológicas em vertebrados e pode imitar ou modular as ações de estrogênios endógenos, geralmente, por ligação a receptores de estrogênio” (BRANCA, 2003). Ou seja, são compostos que, devido a sua similaridade estrutural com estradiol (17β-estradiol), apresentam atividade estrogênica ou antiestrogênica.
A maior parte dos fitoestrogênios pertence ao grupo dos flavonoides, como é o caso das isoflavonas, das flavononas e dos flavonóis. Outro grupo, porém, composto pelos fitoestrogênios não-flavonoides apresenta grande relevância e compostos importantes como as lignanas (GÜLTEKEIN; YILDIZ, 2006).
A atividade estrogênica desses compostos é difícil de se determinar, pois varia significativamente entre os métodos analíticos escolhidos, porém está relacionada com a afinidade que os fitoestrogênios têm com os ERs (MACDONALD et al., 2003). Assim, de forma geral, os fitoestrogênios são agonistas parciais, devido à fraca interação com o ER quando comparado com o estrogênio endógeno (WEBB, 2007) (Tabela 2).
Tabela 2. Famílias dos fitoestrogênios, sua semelhança com o estrogênio endógeno, suas fontes e sua interação com o receptor de estrogênio (ER). Adaptado de Macdonald et al. (2003)
Família Fórmula geral Fitoestrogênios Fontes na dieta Afinidade com ER
Estrogênio
Endógeno - - -
Flavonas
Apigenina Salsa, aipo e azeitonas pretas Baixa Luteolina Salsa, aipo e azeitonas pretas Baixa
Flavononas
Naringenina Frutas cítricas, ameixas Baixa
Hespéridina Frutas cítricas, ameixas Baixa
Flavonóis
Campferol Chá verde, brócolis Baixa
Quercetina Maça, Chá verde, cebola Muito baixa Miricetina Funcho, cebola, brócolis Baixa
Isoflavonas
Genisteína Soja, ervilha e lentilha Alta Daidzeina Soja, ervilha e lentilha Moderada Biochanina A Soja, ervilha e lentilha Moderada
Cumarinas Cumestrol Feijão frito, feijão broto Alta
Lignanas
Matairesinol Grãos integrais, frutas Moderada Secoisolariciresinol Grãos integrais, frutas Moderada
Lariciresinol Grãos integrais, frutas Baixa Isolariciresinol Grãos integrais, frutas Baixa
Curcuminóides Curcumina Açafrão da terra Moderada
Estilbenos Resveratrol Uvas, vinho tinto Muito baixa
Catequinas Epigalocatequina
galato Chá verde Baixa
Antocianidinas
Pelargonidina Cerejas e uvas Baixa
Malvidina Cerejas e uvas Baixa
Um dos fitoestrogênios de maior atividade é o cumestrol, entretanto é necessária uma quantidade muito maior que do estradiol para que este atinja sua máxima atividade, que é aproximadamente a metade da atividade do estrogênio endógeno. Outro ponto importante é que seu consumo na dieta é mínimo, uma vez que a principal fonte, a alfafa, não é consumida por humanos. Dessa forma, os fitoestrogênios de maior interesse e mais estudados são as isoflavonas encontradas principalmente em compostos a base de grãos de soja (GÜLTEKEIN; YILDIZ, 2006). Elas ocorrem na forma de glicosídeos – conjugadas com uma molécula de glicose, entretanto, devido ao menor peso molecular e ao fato de ser mais hidrofóbica, a forma aglicona é melhor absorvida pelo corpo humano (no intestino delgado e grosso). As formas glicosiladas são hidrolisadas pela microflora do intestino antes de serem absorvidas. Além disso, estudos indicam que metabolitos da daidzeína – equol e O-desmetilangolensina (O-DMA), produzidos por biotransformação na microbiota de alguns indivíduos, são compostos de maior potencial estrogênico do que a própria daidzeína; entretanto o metabolismo da microflora intestinal varia de pessoas para pessoa, sendo que alguns indivíduos são incapazes de efetuar essas transformações (FRANKENFELD et al., 2005).
Alguns estudos sugerem ainda que as isoflavonas também podem sofrer hidrolise ácida no estomago (KELLY et al., 1993) ou serem hidrolisadas por enzimas presentes na saliva (ALLRED et al., 2001). Assim, devido a diversa gama de fatores capazes de alterar a biodisponibilidade das isoflavonas e mesmo impossibilitar a absorção das mesmas, o seu uso como fitoestrogênio pode ser ineficaz em partes da população (GÜLTEKEIN; YILDIZ, 2006).
Outro fator importante a ser considerado é a variabilidade no conteúdo de fitoestrogênios nas diferentes espécies vegetais. Entretanto, ainda que muito variável de acordo com a fonte, localização geográfica e época do ano, a concentração dos fitoestrogênios encontrada nos alimentos é alta o bastante para que se observe respostas biológicas significativas (ZHANG et al., 2014). Sabe-se, por exemplo, que interferentes com ação estrogênica causam um aumento na incidência de câncer de mama e testículos em humanos (SAFE, 2005).
O efeito da ligação dos fitoestrogênios com o receptor alfa ou beta não está claramente elucidado, entretanto, a concentração do composto pode
modificar a ação no organismo, podendo exercer efeitos estrogênicos ou antiestrogênicos ao se aderirem aos receptores hormonais (Figura 2) (ROBERTS, 2010). Um exemplo é o efeito bifásico da concentração de genisteína na proliferação de células de câncer de mama – estimulando o crescimento em baixas concentrações e inibindo em altas concentrações (DAMPIER et al., 2001).
3.4. Plantas da medicina popular brasileira com provável efeito estrogênico
O uso de extratos de plantas como medicamentos é tão antigo quanto a humanidade. Os registros mais antigos do uso de fitoterápico datam do período 2838-2698 a.C. quando o imperador chinês Shen Nung catalogou 365 ervas medicinais e venenos que eram usados sob inspiração taoísta de Pan Ku, considerado deus da criação. Com o passar dos anos a ciência foi capaz de comprovar ou negar os efeitos de muitos dos compostos que já eram utilizados para fins medicinais, permitindo a concentração e um aumento da efetividade desses extratos; facilitando também seu acesso, agora independente da sazonalidade das plantas. Esses fatores permitiram um aumento da expectativa de vida do ser humano, além de uma melhora na qualidade de vida (FRANÇA et al., 2008). Efeito RESPOSTA Estrogênio Efeito EFEITO AGONISTA Composto com ação estrogênica Efeito EFEITO ANTAGONISTA Célula ER
Composto com ação
antiestrogênica
Célula Célula
ER ER
Apesar dos inúmeros avanços na área farmacológica, o uso de medicamentos e terapias alternativas nunca foi abandonado e, de fato, tem ganhado espaço nas últimas décadas. A inclusão de alimentos na dieta, com o intuito de minimizar riscos de doenças também despontou como um fator importantíssimo na busca por qualidade de vida. As propriedades relacionadas à saúde dos alimentos podem ser provenientes de constituintes normais desses alimentos como no caso das fibras e dos antioxidantes (vitamina E, C, betacaroteno) presentes em frutas, verduras, legumes e cereais integrais; ou através da adição de ingredientes que modifiquem suas propriedades originais exemplificada por vários produtos industrializados, tais como: leite fermentado, biscoitos vitaminados, cereais matinais ricos em fibras, leites enriquecidos com minerais ou ácido graxo Ômega 3. As áreas de maior interesse relacionando dieta e saúde, estão ligadas a saúde do trato gastrointestinal e imunidade, prevenção de doenças cardiovasculares, prevenção ao câncer, regulação de peso, saúde dos ossos e prevenção da osteoporose, performance mental e física (SIRÓ et al., 2008).
Do ponto de vista científico, faltam dados sobre muitos desses alimentos e especiarias, e apesar da riqueza da flora brasileira, é um campo pouco estudado e difundido no país; além disso, apesar dos benefícios associados, algumas plantas podem não produzir o efeito desejado, ou ainda se mostrarem tóxicas ou venenosas. Assim, foram selecionadas amostras com suposto efeito estrogênico, com base na medicina popular brasileira e algumas com embasamento científico, a fim de avaliar o potencial efeito dos seus extratos sobre um modelo celular in vitro.
3.4.1. Amora (Morus alba L.)
A amora (Morus alba L.), pertencente ao gênero Morus (Moraceae), é uma planta nativa da Índia, China e Japão, porém é cultivada em todo o mundo, onde quer que os bichos-da-seda sejam criados, uma vez que as folhas da amoreira são a principal fonte de alimento para os bichos-da-seda.
Assim como as demais plantas desse gênero, a Morus alba L. é conhecida por apresentar propriedades terapêuticas. Estudos com diversas partes da planta comprovam o potencial da amoreira como agente antiestresse (NADE et
al., 2009), antimicrobiano (RAO SJ et al., 2012), anticancerígeno (CHON et al., 2009), antioxidante (IQBAL et al., 2012), ansiolítico e imunomodulador (VENKATACHALAM; KANNAN; GANESH, 2017; ESWARA RAO BHARANI et al., 2010).
Na medicina popular, a folha da amoreira (Figura 3) é indicada para o tratamento de dores de cabeça frequentes, insônia, alterações de libido, depressão, inflamações cutâneas, enfermidades nos rins e no fígado, dores das cólicas menstruais e o desconforto da TPM. A forma de consumo mais popular é na forma de chá (GREEN ME, 2017)
3.4.2. Vítex (Vítex agnus castus L)
O nome vítex é derivado do latim vitilium, que significa trançado, entrelaçado. Este arbusto pertencente à família Verbenaceae, ordem Lamiales e o gênero Vítex possui aproximadamente 20 espécies. O nome da espécie, agnus-castus, é originário do latim castitas, que significa castidade; o termo agnus é comparado ao termo grego agnos, que significa cordeiro. Antigamente havia a crença que ela poderia suprimir o desejo sexual e a igreja católica, na
Europa, colocava ramos da planta nas roupas dos monges noviços para, supostamente, suprimir o desejo sexual (KUSTRAK, 1992.).
Enquanto por um lado o agnus-castus atuava na inibição do impulso sexual, os antigos também utilizavam o vítex para promover a restauração dos órgãos reprodutores à condição funcional saudável e promover a livre circulação de leite em novas mães. Segundo Staden (2000), nesse período, o desejo sexual que o agnus castus supostamente poderia suprimir, era potencialmente tão perigoso à ordem social quanto um útero com problemas ou um órgão masculino doente. O agnus castus então, está ligado a ambos: a restauração e sustentação da regularidade biológica e social.
Ainda que não listado em livros de medicina oficiais, demonstrando ser mais utilizada pela medicina popular, o vítex (Figura 4) foi reverenciado e largamente utilizado pela medicina grega, romana, persa, durante a Idade Média, através da Europa. E, atualmente, está recebendo interesse em práticas clínicas baseadas em ervas para uma variedade de transtornos femininos, e os produtos que contêm vítex estão amplamente disponíveis em lojas de alimentos naturais e lojas de ervas em vários países (RECEITA NATURAL, 2017).
As formas mais comuns de uso são extratos alcoólicos ou capsulas comercializadas em lojas de produtos naturais.
3.4.3. Funcho (Foeniculum vulgare)
Também conhecido como erva-doce, o Foeniculum vulgare é uma planta perene da família Umbelliferae. As folhas são longas (até 40 cm) e delgadas, finamente dissecadas, terminando em segmentos filiformes a aciculares (com cerca de 0,5 mm de diâmetro), muito flexíveis (Figura 5). O seu aroma lembra o anis, e é utilizada como condimento no preparo de carnes, peixes, molhos e recheios.
Figura 5. Folha de funcho
Na medicina popular, tanto as sementes como as folhas e o caule são utilizados nos mais diversos tratamentos, variando de tratamentos simples como sintomas da gripe e cortes, até tratamentos mais complexos como doenças renais e câncer. O chá de funcho é usado também para combater os gases intestinais e cólicas em crianças, tratar mulheres na fase da amamentação com o intuito de aumentar a produção de leite, aliviar dores no fígado, tratamento de ulceras na boca e no estomago, entre outros (BADGUJAR; PATEL; BANDIVDEKAR, 2014).
3.4.4. Equinácea (Echinacea pupurea L)
Echinacea é um gênero de flores silvestres de pradaria perenes nativas das terras centrais da América do Norte (BARRETT, 2003). Os indígenas norte-americanos a chamam de “raiz de alce”, pois é ingerida por estes animais quando estão feridos ou doentes e, desta maneira, dizem eles, os humanos aprenderam a usar esta planta. Três espécies de equinacea são usadas na medicina nativa e na fitoterapia - Echinacea angustifolia, Echinacea pallida, Echinacea purpurea - e a maioria dos produtos à venda vêm com estas ervas misturadas, em diferentes proporções, portanto, têm efeitos diferenciados. Também é certo que, nas raízes e rizomas a composição é diferente daquela nos caules, folhas e flores, ou seja, essas partes da planta servem para tratamentos diferentes (SCHOOP et al., 2006).
O extrato de E. purpura (Figura 6) é amplamente utilizado na medicina popular principalmente devido a sua ação imunomoduladora e seu potencial antioxidante, anti-inflamatório e antiviral (YILDIZ; KARABULUT; YESIL-CELIKTAS, 2014).
Figura 6. Folha de Equinácea
O seu consumo é ainda indicado como para prevenir o câncer, inclusive os hormônios responsivos. As formas mais comuns de consumo da equinácea
são na forma de capsulas (encontradas em lojas de produtos naturais) e na forma de chá (preparados a partir das flores, folhas e/ou raízes) (PLANTAS QUE CURAM, 2015).
3.4.5. Inhame (Colocasia esculenta L.)
O inhame (Colocasia esculenta L.) (Figura 7) é um tubérculo rico em carboidratos de baixo índice glicêmico, muito cultivado no Brasil, na África, na Ásia e na Oceania e desempenha importante papel na alimentação humana nessas regiões.
Na medicina popular o inhame (na forma de um elixir a base de álcool) é utilizado como uma solução fitoterápica para eliminar toxinas do organismo, aliviar dores provocadas por cólicas ou reumatismo, e facilitar a digestão, por exemplo. O consumo é ainda indicado para aumentar a fertilidade feminina – não havendo, entretanto, estudos científicos que comprovem sua eficácia (COELHO, 2011).
Figura 7. Inhame
3.4.6. Gengibre (Zingibre officinalis L.)
O gengibre (Zingibre officinalis L.), uma das mais antigas e populares plantas medicinais do mundo, é uma planta herbácea de sabor picante e pode ser utilizado na culinária tanto em pratos salgados quanto nos doces.
Na medicina popular são muitos os males para os quais é indicado o consumo de gengibre, como por exemplo: programas de desintoxicação do organismo, além de ser considerado um poderoso anti-inflamatório, anticoagulante, antioxidante e bactericida; para congestão do peito, cólera, gripe, diarreia, dor de estômago, reumatismo e doenças nervosas, sendo o chá a forma de consumo mais popular. É indicado ainda, para mulheres grávidas, para combater dores de cabeça e náuseas nos primeiros meses de gestação. E também como afrodisíaco feminino (GREEN ME, 2016).
3.4.7. Ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata)
Nas florestas e nos campos do Brasil, são encontradas 21 espécies de ginseng do gênero Pfaffia (SIQUEIRA, 1988). Dentre essas espécies podemos destacar a Pfaffia paniculata, Pfaffia jubata e a Pfaffia glomerata, conhecida como ginseng-do-pantanal ou ginseng brasileiro, que são muito usadas na medicina popular brasileira, e tem algumas de suas propriedades medicinais confirmadas com o isolamento de princípio ativo de suas raízes (NAKAI et al., 1984; NISHIMOTO et al., 1988; SHIOBARA et al., 1993).
A Pfaffia glomerata, é uma espécie nativa do Pantanal, e está adaptada aos ciclos de cheia e seca da região. Na medicina popular, as fáfias, em geral, são usadas em garrafadas, como tônico, aperiente e estimulante. Também são muito indicadas em casos de dores de cabeça de origem hepática, tratamento de reumatismo e diabetes, e afrodisíaco (DE OLIVEIRA, 1986; FREITAS et al., 2004; MARQUES et al., 2004; NETO et al., 2005). Podendo ser preparadas em casa ou compradas em lojas de produtos naturais.
Na tabela 3 é apresentado um resumo das ervas medicinais escolhidas, bem como os tratamentos para os quais são indicadas e suas origens.
Tabela 3. Sumário das ervas medicinais selecionadas, nome científico, suas indicações de uso na medicina popular e sua origem.
Amostra Nome
científico Indicações populares Origem
Folhas
Amora Morus alba L.
Dores de cabeça frequentes, insônia, alterações de libido, depressão, enfermidades nos rins e no fígado, dores das cólicas menstruais e o desconforto da tensão pré-menstrual.
China
Vítex Vítex agnus-castus
Alivio da tensão pré-menstrual, ansiedade, tensão nervosa e insônia, redução dos sintomas da menopausa
Regiões tropicais e subtropicais
Funcho Foeniculum vulgare
Alivio das dores menstruais, anticarcinogênico, expectorante, ajuda contra o mal hálito
Região do Mediterrâneo e da Ásia Menor Equinácea Echinacea pupurea L.
Tratamento de alergias, gripes e resfriados, algumas infecções e melhorar o sistema imunológico
EUA
Raízes
Inhame Colocasia
sculenta L. Fertilidade feminina Austrália
Gengibre Zingibre officinalis L.
Anti-inflamatório e analgésico natural, digestivo, náuseas e vômitos, infecções na garganta, aumenta a libido, previne enjoos em viagem, acelera o metabolismo e auxilia a circulação sanguínea Ásia Ginseng brasileiro Pfaffia glomerata
Energético físico e mental, depressão, fraqueza, estimulante sexual, mal de Parkinson, estresse, envelhecimento precoce e menopausa.
Brasil
Equinácea Echinacea pupurea L.
Tratamento de alergias, gripes e resfriados, algumas infecções e melhorar o sistema imunológico
3.5. Compostos fenólicos e atividade antioxidante
Os compostos fenólicos são definidos como substâncias que possuem um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais. Englobam desde moléculas simples até outras com alto grau de polimerização (BRAVO, 1998). Estão presentes nos vegetais na forma livre ou ligados a açúcares (glicosídios) e proteínas (CROFT, 1998) (SOARES et al.,2008).
Os compostos fenólicos presentes nas plantas estão relacionados, principalmente, com a proteção, conferindo alta resistência a micro-organismos e pragas. Nos alimentos, estes compostos podem influenciar o valor nutricional e a qualidade sensorial, conferindo atributos como cor, textura, amargor e adstringência. Na maioria dos vegetais, os compostos fenólicos constituem os antioxidantes mais abundantes (EVERETTE et al., 2010).
Antioxidantes são compostos que podem retardar ou inibir a oxidação de lipídios ou outras moléculas, evitando o início ou propagação das reações em cadeia de oxidação. A atividade antioxidante de compostos fenólicos é principalmente devido às suas propriedades de óxido-redução, as quais podem desempenhar um importante papel na absorção e neutralização de radicais livres, quelando o oxigênio triplete e singlete ou decompondo peróxidos. Em função dessa atividade, os fenólicos desempenham um papel importante nos processos de inibição do risco das doenças cardiovasculares e podem atuar sobre o estresse oxidativo, relacionado com diversas patologias crônico-degenerativas, como o diabetes, o câncer e processos inflamatórios (ANTUNES; CANHOS, 1984; BRENNA; PAGLIARINI, 2001; ZHENG; WANG, 2001; FENNEMA, 1993; SIMÃO, 1985).
Como já citado, a maior parte dos fitoestrogênios pertence ao grupo dos flavonoides, uma classe de compostos naturais com estrutura fenólica variável, com elevado potencial antioxidante (GÜLTEKEIN; YILDIZ, 2006; FERREIRA, 2002). Dessa forma, o teor de fenólicos e a atividade antioxidante pode ser um indicativo para seleção de amostras com potencial presença de fitoestrogênios.
Existem diversos métodos para avaliar a atividade antioxidante in vitro de substâncias biologicamente ativas. Estes métodos podem ser baseados na
captura do radical peroxila (ORAC, TRAP), poder de redução do metal (FRAP; CUPRAC), captura do radical hidroxila (método de desoxirribose), captura do radical orgânico (ABTS, DPPH), e quantificação de produtos formados durante a peroxidação de lipídios (TBARS, oxidação do LDL, co-oxidação do β-caroteno) (FRANKEL; MEYER, 2000; SÁNCHEZ-MORENO,2002; ARUOMA, 2003), etc. Devido aos diferentes tipos de radicais livres e às suas diferentes formas de atuação nos organismos vivos, dificilmente existirá um método simples e universal pelo qual a atividade antioxidante possa ser medida precisa e quantitativamente. Dentre estes métodos, ORAC, FRAP e DPPH são alguns dos mais usados atualmente (PÉREZ-JIMÉNEZ; SAURACALIXTO, 2006).
Capacidade de absorção de radicais de oxigênio (Oxygen radical absorbance capacity) - ORAC é um método que se baseia na propriedade fluorescente da fluoresceína. Neste ensaio o radical peroxil, gerado pelar reação do AAPH [dicloreto de 2,2'-azobis (2-amidinopropano)] com oxigênio atmosférico, reage com o indicador fluorescente para formar um produto não fluorescente, que pode ser medido por espectrofotometria com máxima emissão de fluorescência em 485 nm. Este ensaio avalia a atividade antioxidante através da inibição da oxidação, induzida pelo radical peroxil, por transferência de átomos de hidrogênio (FRANKEL; MEYER, 2000).
O ensaio antioxidante de determinação do poder de redução do íon ferro, FRAP (do inglês Ferric Reducing Antioxidant Power), está baseado na produção do íon Fe2+ (forma ferrosa) a partir da redução do íon Fe3+ (forma férrica) presente no complexo 2,4,6- tripiridil-s-triazina (TPTZ). Quando a redução ocorre, há uma alteração na tonalidade da mistura de reação, passando de roxo claro a um roxo intenso, cuja absorbância pode ser medida no comprimento de onda de 595 nm (BENZIE; STRAIN, 1999; ANTOLOVICH et al., 2002).
O DPPH é um ensaio que se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma determinada substância em sequestrar o radical DPPH (radical livre estável em virtude da deslocalização do elétron desemparelhado por toda a molécula), reduzindo-o a hidrazina. Quando a substância doa átomos de hidrogênio à solução de DPPH, a hidrazina é obtida com mudança simultânea na coloração de violeta a amarelo pálido. Este ensaio é largamente utilizado, tanto pela simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade, porém os
resultados devem ser cuidadosamente interpretados. As substâncias analisadas podem interferir nos resultados caso seus espectros se sobreponham ao do DPPH ao redor de 515 nm como, por exemplo, os carotenoides. Sendo a acessibilidade estérica o fator determinante da reação, moléculas pequenas que têm melhor acesso ao sítio do radical podem apresentar uma maior atividade aparente quando comparada às moléculas maiores (BRAND-WILLIAMS et al., 1995).
3.6. Modelo celular para avaliação de atividade estrogênica
É possível encontrar na literatura uma gama de ensaios para avaliação do potencial estrogênico, bem como as diversas etapas do mecanismo de ação proposto para esses hormônios, eles se dividem basicamente em três classes: i) ensaios que avaliam a afinidade com que o composto se liga ao receptor de estrogênio; ii) ensaios que avaliam se a transcrição e tradução gênica são dependentes da interação do receptor de estrogênio com seu ligante; iii) e ensaios de proliferação celular, que avaliam o aumento do número de células alvo, durante a fase exponencial de proliferação (FANG et al., 2000). O ensaio e-screen se enquadra na terceira categoria, e consiste de um teste quantitativo, que compara o crescimento celular entre células de MCF-7 na ausência de estrogênios (controle negativo), amostras com ação estrogênica comprovada (controle positivo) e diversas concentrações da amostra suspeita a ter atividade estrogênica (SOTO et al., 1995)
As células MCF-7 BUS (adenocarcinoma mamário que superexpressa ER) são células de câncer de mama humano ERα positivas, dependentes de estrogênio. A presença desse receptor permitiu o desenvolvimento de inúmeros estudos sobre os efeitos de compostos com atividade estrogênica e antiestrogênica in vitro.
Em estudo da atividade estrogênica com a erva chinesa Danggui Buxue Tang (DBT), os pesquisadores relatam a existência de dois grandes problemas de pesquisa e uso clínico de medicamentos à base de plantas: i) como padronizar extrato de ervas de modo que se pode repetir o mesmo extrato cada vez; e ii) como revelar o mecanismo de ação de uma mistura de ervas. A aplicação do composto bioativo da DBT – calycosin, diretamente nas células de
MCF-7 provou que este composto isolado é incapaz de apresentar efeitos estrogênico, dessa forma as funções estrogênicas DBT devem ser desencadeadas por multicomponentes dentro da mistura herbal, e calycosin é apenas um dos principais fitoquímicos (GONG et al., 2016).
Amato et al. (2002), estudando o possível efeito estrogênico de quatro extratos consumidos para combater os sintomas da menopausa - dong quai, ginseng, cohosh preto e raiz de alcaçuz; utilizou células MCF-7 BUS e um sistema de ensaio de expressão de genes transitórios utilizando células HeLa co-transfectadas com um plasmídeo dependente de estrogênio na presença de receptor de estrogénio humano ERα ou ERβ, para estudo in vitro. Foi observado que os extratos de dong quai e ginseng induziram o crescimento das células MCF-7 de forma significativa – variando quanto a dosagem aplicada. Entretanto na indução da transcrição nas células HeLa, apenas a raiz de alcaçuz demonstrou ser eficiente, porém não de forma significativa. Ainda no mesmo estudo, teste com ratos ovariectomizado não apresentaram respostas ao tratamento com nenhuma das ervas.
Hu et al. (2009), realizando estudo com raiz de alcaçuz chinês (Glycyrrhiza uralensis) utilizou dimetilsulfóxido (DMSO) para extrair uma gama de compostos com diferentes polaridades. Em teste celular com a linhagem MCF-7 o crescimento celular foi bifásico, em concentração elevada o extrato de DMSO estimulou o crescimento das células, enquanto que em baixas concentrações o crescimento foi inibido. Quando aplicado um agente antiestrogênico (4-hydroxytamoxifen) o estimulo do crescimento foi inibido, confirmando a sua interação com o receptor de estrogênio é responsável pelas alterações no ciclo de crescimento das células.
Observando o efeito bifásico que os compostos com atividade estrogênica apresentam quando testados nas células MCF-7, foram testadas diversas concentrações para avaliar os possíveis efeitos desses extratos.
4. METODOLOGIA
4.1. Coleta das amostras
As amostras de folhas: vítex (Vítex agnus-castus), amora (Foeniculum vulgare), funcho (Echinacea pupurea L.) e equinácea (Echinacea pupurea L.); e raízes: inhame (Colocasia sculenta L.), gengibre (Zingibre officinalis L.), ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata) e equinácea (Echinacea pupurea L.) foram gentilmente cedidas pelo Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas ‒ CPQBA ‒ da UNICAMP, colhidas em agosto de 2016.
4.2. Produção dos extratos
As folhas frescas de vítex (Vítex agnus-castus), amora (Foeniculum vulgare), funcho (Echinacea pupurea L.) e equinácea (Echinacea pupurea L.) foram higienizadas com água e secas a temperatura ambiente para eliminação da agua da lavagem. Para o preparo dos extratos as folhas foram cortadas com o auxílio de uma faca e pesadas.
As raízes frescas de inhame (Colocasia sculenta L.), gengibre (Zingibre officinalis L.), ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata) e equinácea (Echinacea pupurea L.) foram higienizadas com água e secas a temperatura ambiente. Para o preparo dos extratos as amostras foram trituradas com o auxílio de um processador de alimentos (sem adição de solvente) e em seguidas pesadas.
Cada amostra passou por dois processos de extração (Figura 8): 1) uma porção de 50g da amostra foi adicionada em um frasco Erlenmeyer de 1000mL no qual foi adicionado 500mL de água destilada a 90°C, sendo a mistura mantida em banho-maria a 90°C por 30 minutos (sob agitação); 2) 50g da amostra foi adicionada em um frasco Erlenmeyer de 1000mL no qual foi adicionado 500mL de solvente Etanol 70% a temperatura ambiente, essa mistura foi mantida sob agitação por 30 minutos em shaker. Após a extração, os resíduos das amostras foram filtrados em papel filtro com o auxílio de uma bomba a vácuo, com consequente eliminação do solvente em rotaevaporador a 40 ºC. Os extratos foram então congelados em placa de petri e liofilizados. Calculou-se o rendimento total dos extratos, de acordo com a fórmula:
Re = (Pext /Pfolhas-raizes) x 100.
Onde: Re = Rendimento total do extrato (%); Pext = Peso do extrato seco (g); Pfolhas-raizes = Peso das folhas e raízes frescas (g).
Infusão Higienização Trituração manual Pesagem 500mL de solvente (água 90°C) Banho-maria (90°C/30min) Filtração (papel filtro) Congelamento (placas de petri) Liofilização Pesagem do extrato Extrato Hidroalcoólico Higienização Trituração mecânica Pesagem 500mL de solvente (etanol 70%) Shaker (30min) Filtração (papel filtro) Eliminação do solvente (rotaevaporador 40°C) Congelamento (placas de petri) Liofilização Pesagem do extrato
4.3. Caracterização de compostos bioativos das amostras
4.3.1. Fenólicos totais
A determinação de fenólicos totais foi realizada com base no método de Folin-Ciocaulteau (HRNCIRIK; FRITSCHE, 2004), que baseia-se na redução do ácido fosfomolibdíco e fosfotungstico pelas hidroxilas dos fenóis produzindo uma coloração azul. Primeiramente, 1mg de extrato foi dissolvido em 1mL de água destilada e agitado por 2 minutos. A partir dessa solução a amostra foi diluída nas concentrações de 0,01mg/mL e 0,001mg/mL . Em microtubo de 2mL, foram adicionados 50 µL de: i) amostra nas concentrações desejadas; ii) branco; iii) soluções da curva. Em seguida ocorreu a adição de 800µL de água e 50 µL de reagente Folin-Ciocaulteau. Após agitação em vórtex a solução permaneceu em repouso por 3 minutos em ausência de luz. Foi adicionado 100 µL de solução de Carbonato de Sódio (Na2CO3), a solução foi homogeneizada e mantida em ausência de luz por 2 horas. Após esse período, foi adicionado 200µL da mistura reacional em compartimentos de microplaca de 96 poços e medida a absorbância a 725nm. O branco foi composto por todos os constituintes da reação, substituindo-se a solução fenólica por agua destilada. A curva de calibração foi realizada utilizando uma solução padrão de ácido gálico, nas concentrações de 0,025 – 0,25 µg/mL e os resultados determinados em triplicata, e expressos em mg de ácido gálico equivalente por quilograma de amostra (mg AGE/Kg).
4.3.2. Atividade antioxidante 4.3.2.1. ORAC
O método ORAC utilizado, com fluoresceína (FL) como “probe de fluorescência”, seguiu a metodologia de Dávalos et al. (2004). A amostra foi preparada em cinco concentrações diferentes diluídas em tampão fosfato 75 mmol.L-1 pH 7,4. Trolox® (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico, AcrosOrganics, Belgica) foi preparado como padrão de referência em concentrações entre 1,5 e 1500 μmol.L-1 em tampão fosfato 75 mmol.L-1 pH 7,4. Alíquotas de 20 µL da amostra, solução de Trolox® ou tampão (branco) foram distribuídas em placa com 96 poços (cor preta e opaca) seguidas da adição de
120 µL de solução de sal sódico de fluoresceína 0,38 μg.mL-1 diluída em tampão fosfato 75 mmol.L-1 pH 7,4.
A reação se deu pela adição de 60 µL de solução do radical AAPH (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) em concentração 108 mg.mL-1 dissolvido em tampão fosfato 75 mmol.L-1 pH 7,4. A fluorescência foi monitorada a cada 70 segundos durante 75 min, em Fluorímetro Fluostar Optimo (BMG LABTECH, Alemanha) a 37 °C e com filtro de excitação de 485 nm e de emissão de 520 nm. As medições foram realizadas em triplicata. Os resultados expressos como μmol equivalente em Trolox.g-1 de extrato.
4.3.2.2. DPPH
A análise de DPPH (2,2- difenil-1-picrilhidrazila) foi realizada adaptando o método descrito por Macedo et al. (2011).
As amostras foram diluídas em etanol 100% para concentração final de 10mg/mL. O meio reacional constituiu em 50 µL de amostra diluída disposta em placas transparentes de 96 poços e 150 µL da solução de DPPH (0,2 mmol/L em etanol). O branco de referência foi preparado com 50 µL de água e 150 µL da solução de DPPH. A absorbância foi medida a 520nm por 36 min em leitor de placa.
4.3.2.3. FRAP
A determinação da capacidade antioxidante pelo método FRAP foi realizada em triplicata, segundo Benzie e Strain (1996) , com modificações. O método baseia-se na medida direta da habilidade dos antioxidantes presentes na amostra em reduzirem, em meio ácido, o complexo Fe3+/tripiridiltriazina (TPTZ), para formar Fe2+. Em ambiente escuro, alíquotas de 30 µL de amostra, padrão ou branco foram adicionadas a 90 µL de água destilada e 900 µL do reagente FRAP (2,25 mL de tampão acetato 0,3 M pH 3,6; 225 μL de solução de TPTZ 10 mM em HCl 40 mM e 225 μL de solução de cloreto férrico 20 mM). A leitura da absorbância foi realizada em fluorímetro (FLUOstar OPTIMA – BMG Labtech, Alemanha) a 595 nm, durante 10 minutos de reação. Será realizada uma curva de calibração com Trolox® (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido
carboxílico, Acros Organics, Bélgica), nas concentrações entre 15-1500 µmol.mL-1, e os resultados serão expressos em µmol de equivalente de Trolox por mL de amostra.
4.4. Avaliação do potencial estrogênico in vitro 4.4.1. Cultura celular
A MCF-7 BUS, uma linhagem de células tumorais de mama humana estrogênica responsiva, cedida pela Divisão de Farmacologia e Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas ‒ CPQBA ‒ da UNICAMP, foi mantida em meio de cultura RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute), suplementado com 5% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina, e incubada a 37°C, em atmosfera contendo 5% de CO2.
4.4.2. Ensaio de citotoxicidade para E-screen (Sulforrodamina B)
Transferiu-se 100 μL de suspensão de células tripsinizadas e previamente contadas em câmara hemocitométrica de Newbauer (Boeco, Germany) em placas de 96 poços, totalizando, 6x104 células por poço. Após 24 horas de incubação o meio de cultura foi removido e lavou-se com 100 μL PBS. No ensaio de citotoxicidade as células tratadas foram incubadas por 144 horas (6 dias), o mesmo período de tempo de exposição do ensaio E-screen. Utilizou-se meio RPMI 1640 suplementado com 5% de SBF e cinco concentrações de cada amostra: 1mg/poço, 0,1 mg/poço, 0,01 mg/poço, 0,001 mg/poço e 0,0001 mg/poço. Os ensaios foram realizados em triplicatas para cada controle e cada concentração, além de terem sido realizados três ensaios independentes.
Após o tempo de incubação, fixaram-se as células na placa com 200 μL ácido tricloroacético 50% (para placas de 96 orifícios, ou 500 μL quando em placas de 24 orifícios) e incubou-se a 4°C por 1 hora. As placas foram lavadas por imersão com água destilada e deixadas para secar overnight. Após, as células foram tratadas com 200 μL de solução de sulforrodamina B 0,4% em ácido acético 1% (para placas de 96 orifícios, ou 500 μL quando em placas de 24 orifícios). Incubou-se por 20 minutos na ausência de luz. Lavou-se com ácido
acético 1% até retirar o excesso de corante e esperou-se a secagem das placas. O corante ligado às células foi solubilizado com 200 μL de Trizma Base 10 mM (pH =10,5) por agitação durante 20 minutos (para placas de 96 orifícios, ou 1 mL quando em placas de 24 orifícios). Ao final, realizou-se a leitura de absorbância da microploca em leitor de microplacas em 547 nm. As médias das absorbâncias foram calculadas descontando o valor de seus respectivos brancos e, através das fórmulas a seguir, foi determinado o crescimento (%) da linhagem testada frente às diferentes amostras.
Se TA > T1, a amostra estimulou o crescimento.
Se T1 ≥ TA > T0, a amostra foi citostática e a fórmula utilizada foi: 100x [(TA- T0)/(T1- T0)].
Se TA < T0, a amostra foi citocida e a fórmula utilizada foi: 100x [(TA- T0)/( T0)].
Sendo TA a média da absorbância da célula tratada, T1 o controle de célula e T0 o controle das células no dia da adição das amostras. Os dados de absorbância foram analisados e compilados na elaboração de gráficos relacionando a porcentagem de crescimento celular com a concentração da amostra.
4.4.3. E-screen
O potencial estrogênico foi avaliado através do teste E-screen, de acordo com Soto et al., (1995) e Rasmussen e Nielsen (2002), utilizando-se a linhagem celular MCF-7 BUS. Em microplacas transparentes de 24 poços, foram semeados 1000 µL da suspensão celular, com densidade de 1 x 104 células/mL. Após 24 horas, o meio de manutenção foi substituído pelo meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol, suplementado com 5% de soro fetal bovino tratado com carvão ativo e dextran e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL, NY, USA), e as placas foram incubadas novamente a 37°C, por 72 horas. Em seguida, o meio foi descartado e as células lavadas com solução tampão fosfato (PBS) e, então, tratadas com 1000 µL das amostras e controle, em diferentes concentrações. Em poços distintos, foram adicionados 1000 µL do meio de
cultura sem estradiol (E2) e 1000 µL do meio de cultura acrescido de E2 a 10-9 M (Figura 9). Após incubação das microplacas por 144 horas, as células foram reveladas pelo método com sulforrodamina B, conforme descrito no item acima, e a absorbância lida a 547 nm em espectrofotômetro com leitor de microplacas.
Figura 9. Esquema de tratamento do ensaio E-screen.
Os resultados da atividade estrogênica foram expressos em média e desvio padrão do efeito proliferativo (EP), que estabelece a taxa máxima de proliferação induzida pela substância em células MCF7-BUS. Esse parâmetro é obtido pela razão entre a taxa de proliferação apresentada pela substância avaliada e aquela apresentada pelo controle de células:
EP = absorbância do composto ⁄absorbância do controle de células
Outro parâmetro analisado foi o efeito proliferativo relativo (EPR), utilizado para comparar a proliferação induzida pelo composto teste com aquela induzida pelo 17-β-estradiol, que foi calculado de acordo com a seguinte fórmula:
EPR = (EP-1) (composto-teste) ⁄ (EP-1) (17-β-estradiol) x 100
EPR foram maiores que 80% em pelo menos uma das concentrações testadas, agonistas parciais entre 25 e 80% e não estrogênicos quando os valores de EPR foram inferiores a 25% (KUCH et al., 2010). Quando EPR foi menor que zero, o valor foi desconsiderado.
4.5. Análise estatística
Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente por meio da análise de variancia (ANOVA) seguida pelo pós-teste de Dunnet, para comparação com o grupo controle. Os softwares estatísticos Excel (Microsoft, NY, U.S.A.) e GraphPad Prism 7 (Graph-Pad Software Inc., San Diego, CA, USA) foram utilizados nas análises.
Os valores finais foram expressos como média aritmética ± desvio padrão e consideradas estatisticamente diferentes quando os valores de p foram inferiores a 0,05.
