E-screen

O potencial estrogênico foi avaliado através do teste E-screen, de acordo com Soto et al., (1995) e Rasmussen e Nielsen (2002), utilizando-se a linhagem celular MCF-7 BUS. Em microplacas transparentes de 24 poços, foram semeados 1000 µL da suspensão celular, com densidade de 1 x 104 _células/mL. Após 24 horas, o meio de manutenção foi substituído pelo meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol, suplementado com 5% de soro fetal bovino tratado com carvão ativo e dextran e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL, NY, USA), e as placas foram incubadas novamente a 37°C, por 72 horas. Em seguida, o meio foi descartado e as células lavadas com solução tampão fosfato (PBS) e, então, tratadas com 1000 µL das amostras e controle, em diferentes concentrações. Em poços distintos, foram adicionados 1000 µL do meio de

cultura sem estradiol (E2) e 1000 µL do meio de cultura acrescido de E2 a 10-9 _M (Figura 9). Após incubação das microplacas por 144 horas, as células foram reveladas pelo método com sulforrodamina B, conforme descrito no item acima, e a absorbância lida a 547 nm em espectrofotômetro com leitor de microplacas.

Figura 9. Esquema de tratamento do ensaio E-screen.

Os resultados da atividade estrogênica foram expressos em média e desvio padrão do efeito proliferativo (EP), que estabelece a taxa máxima de proliferação induzida pela substância em células MCF7-BUS. Esse parâmetro é obtido pela razão entre a taxa de proliferação apresentada pela substância avaliada e aquela apresentada pelo controle de células:

EP = absorbância do composto ⁄absorbância do controle de células

Outro parâmetro analisado foi o efeito proliferativo relativo (EPR), utilizado para comparar a proliferação induzida pelo composto teste com aquela induzida pelo 17-β-estradiol, que foi calculado de acordo com a seguinte fórmula:

EPR = (EP-1) (composto-teste) ⁄ (EP-1) (17-β-estradiol) x 100

EPR foram maiores que 80% em pelo menos uma das concentrações testadas, agonistas parciais entre 25 e 80% e não estrogênicos quando os valores de EPR foram inferiores a 25% (KUCH et al., 2010). Quando EPR foi menor que zero, o valor foi desconsiderado.

4.5. Análise estatística

Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente por meio da análise de variancia (ANOVA) seguida pelo pós-teste de Dunnet, para comparação com o grupo controle. Os softwares estatísticos Excel (Microsoft, NY, U.S.A.) e GraphPad Prism 7 (Graph-Pad Software Inc., San Diego, CA, USA) foram utilizados nas análises.

Os valores finais foram expressos como média aritmética ± desvio padrão e consideradas estatisticamente diferentes quando os valores de p foram inferiores a 0,05.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Rendimento dos extratos

Os rendimentos para cada amostra podem ser observados na tabela 4. Os valores expressos indicam a porcentagem de massa liofilizada/massa folha- raiz fresca.

Tabela 4. Rendimento dos extratos em porcentagem.

Extrato aquoso (%) Extrato hidroalcoólico (%) Folha s Morus alba 4,58 1,00 Vítex agnus-castus 12,80 2,87 Foeniculum vulgare 3,12 0,51

Echinacea purpurea (folha) 2,17 1,63

Raí

ze

s

Colocasia sculenta 8,25 2,78

Echinacea purpurea (raiz) 4,58 3,73

Zingibre officinalis 3,27 2,16

Pffafia glomerata 4,95 9,95

Observou-se que os extratos obtidos por meio de extrato aquoso apresentaram um rendimento superior ao rendimento dos extratos hidroalcoólicos em todas as amostras, exceto a raiz de ginseng brasileiro.

No entanto, apesar da eficiente extração, o uso de água pura como solvente resulta em extratos com alta impureza (ricos em ácidos orgânicos, açúcares e proteínas solúveis), podendo interferir na qualificação e quantificação de compostos de interesse (CHIRINOS et al., 2007). Ou seja, apesar do alto rendimento de extração em massa, há baixíssima seletividade de extração.

5.2. Fenólicos totais

A determinação de fenólicos totais pelo método de Folin-Ciocalteu é utilizada para auxiliar na caracterização das propriedades antioxidantes de

diferentes amostras. Os resultados experimentais para as amostras testadas apresentam-se na tabela 5.

Tabela 5. Conteúdo de fenólicos totais dos extratos de folhas, expressos em mg de ácido gálico equivalente/Kg de amostra (mg AGE /kg).

Fenólicos Totais Extrato aquoso (mg AGE /kg) Extrato hidroalcoólico (mg AGE /kg) Amostra s Morus alba 49,26±2,04 a _49,53±2,11a Vítex agnus-castus _119,17±3,30b _100,16±1,90d Foeniculum vulgare _71,33±2,45c _23,23±2,44e Echinacea purpurea (folha) _103,70±2,55d _77,98±2,86c Colocasia sculenta _68,28±2,37c _41,41±2,94af Echinacea purpurea (raiz) _48,77±1,35a _75,92±2,78c

Zingibre officinalis _45,14±3,88a _34,84±2,17f Pffafia glomerata _23,86±3,40e _17,20±1,11e Valor = média ± o desvio padrão (n = 3). Letras diferentes indicam médias estatisticamente diferentes ao nível de 5% (Teste de Tukey p<0,05).

O teor de fenólicos variou de acordo com o método de extração utilizado. As exceções foram os extratos de amora, vítex e ginseng brasileiro, que não diferiram estatisticamente quanto ao solvente utilizado na extração (p<0,05). Observou-se que os extratos (tanto aquoso quanto hidroalcoólico) de vítex e o extrato aquoso de equinácea apresentaram maior teor de fenólicos quando comparados com as demais amostras.

Alguns autores sugerem que solventes com alta polaridade, como a água, e solventes com polaridade muito baixas, ou apolares, como hexano ou diclorometano, não são bons extratores (LIU et al., 2000); outros indicam queo rendimento de extração de compostos fenólicos aumenta com o aumento da polaridade do solvente (AMENSOUR et al., 2010). Segundo Park et al., (2013), o uso de solvente orgânico é capaz de extrair de 2 a 3 vezes mais compostos fenólicos quando comparados a solventes aquosos. Por outro lado, diversas metodologias, consideram importante o período de maceração, no qual a

amostra fica em contato com a solução extratora, melhorando a eficiência da extração (SOARES, 2008).

Não foi possível encontrar na literatura estudos que avaliaram o teor de compostos fenólicos totais das amostras nas mesmas condições de extração empregadas, para efeito de comparação. No estudo realizado por Faudale et al., (2008) com amostras de Foeniculum vulgare de diferentes origens geográficas, utilizando etanol 80% como solvente, os valores encontrados variaram de 34,9 a 111,0 (AGE/mg de extrato); e Radojkovic et al. (2016), utilizando extração com CO2 supercrítico, encontrou valores entre 47,0 e 69,0 (AGE/mg de extrato) para folhas de Morus alba, em estudo realizado com folhas de plantas da família Moraceae. Kaur e Kapoor (2002), avaliando os compostos fenólicos totais do extrato etanólico (etanol 80%) de Zingibre officinalis, encontraram 221,3 mg de catequina por 100g de extrato; já Rababah et al (2004), utilizando metanol como solvente, encontraram 39,9 mg de equivalentes em ácido clorogênico por g de extrato. Vale ressaltar que a curva-padrão utilizada neste trabalho, para a determinação dos compostos fenólicos totais, foi determinada com concentrações de ácido gálico.

As diferenças nos valores de teores dos compostos fenólicos, segundo Soares (2008), podem ser influenciadas por diversos fatores inerentes a amostra, tais como maturação, espécie, práticas de cultivo, origem geográfica, estágio de crescimento, condições de colheita e processo de armazenamento das amostras; e também inerentes aos métodos de estudo, como peculiaridade metodológica relacionada ao solvente extrator e aos fenólicos usados como padrão.

5.3. Atividade antioxidante 5.3.1. ORAC

Este ensaio permite simular, de modo mais próximo possível, a reação antioxidante em um organismo humano em condições ideais de pH e temperatura (POWER et al., 2013). Os resultados expressam o potencial antioxidante das amostras em equivalentes de Trolox, o qual corresponde à quantidade de Trolox em micromols que tem a mesma atividade antioxidante da solução testada (Tabela 6).

Tabela 6. Capacidade antioxidante dos extratos, pelo método ORAC, expressos em concentração equivalente de Trolox (µmol/g).

Amostra Equivalente de trolox (µmol/g) Faixa de concentração da amostra (mg/mL) Coeficiente angular Coeficiente linear R 2 E x trato a quoso Morus alba 2249,782±474a _{0,2 – 1,0 47,52 6,33 0,99} Vítex agnus-castus 2670,523±802ª 0,2 – 1,0 47,43 11,95 0,99 Foeniculum vulgare 2880,907±930ª 0,2 – 1,0 61,91 9,25 0,99

Echinacea purpurea (folha) 3090,937±672a _{0,1 – 0,7 76,50 3,17 0,99}

Colocasia sculenta 469,047±241b _{0,2 – 1,0 4,29 0,09 0,96}

Echinacea purpurea (raiz) 1851,821±551c _{0,2 – 1,0 31,86 5,47 0,99}

Zingibre officinalis 1385,699±755c _{0,1 – 1,0 16,21 2,24 0,99} Pffafia glomerata 1022,418±380c _{0,2 – 1,0 15,18 2,23 0,99} E x trato hidroa lc oólic o Morus alba 2546,792±492ª 0,2 – 1,0 51,77 4,97 0,99 Vítex agnus-castus 3211,889±835a _{0,2 – 1,0 69,72 5,72 0,98} Foeniculum vulgare 1396,650±711c _{0,1 – 1,0 17,54 1,45 0,99}

Echinacea purpurea (folha) 2403,580±718ª 0,1 – 1,0 43,04 5,67 0,99

Colocasia sculenta 489,753±230b _{0,2 – 1,0 4,93 0,08 0,98}

Echinacea purpurea (raiz) 2112,602±754a _{0,1 – 1,0 34,39 3,53 0,99}

Zingibre officinalis 1411,873±737c _{0,1 – 1,0 16,52 2,65 0,99}

Pffafia glomerata 1303,692±728c _{0,1 – 1,0 13,75 2,59 0,96}

Observa-se que não houve diferença estatística significativa entre as amostras, quando comparados os dois tipos de extratos, aquoso e hidroalcoólico. As exceções sendo: Foeniculum vulgare, que apresentou maior potencial oxidante no extrato aquoso; e Echinacea purpurea (raiz), cujo extrato hidroalcoólico foi potencialmente mais antioxidante.

Os extratos obtidos de Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare e Echinacea purpurea (folha) apresentaram potencial antioxidante significativamente maior que os extratos obtidos de Colocasia sculenta, Echinacea purpurea (raiz), Zingibre officinalis e Pffafia glomerata – as exceções sendo o extrato hidroalcoólico de Foeniculum vulgare, que apresentou valores menores que as demais amostras folhares, e o extrato aquoso de Echinacea purpurea (raiz), que apresentou valores estatisticamente iguais que as amostras folhares.

Apesar de não haver diferença estatística significativa entre os extratos aquosos e hidroalcoólicos de Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare e Echinacea purpurea (folha) quanto ao potencial antioxidante pelo método ORAC – exceto o extrato hidroalcoólico de Foeniculum vulgare; o teor de fenólicos desses extratos apresentou grande variação (entre as amostras e os métodos de extração).

O extrato aquoso de Vítex agnus-castus, por exemplo, apresentou maior teor de fenólicos entre todos os extratos, entretanto seu potencial antioxidante foi estatisticamente igual aos extratos de Morus alba, cujo teor de fenólicos foi significativamente menor. Esses resultados sugerem a presença de outros compostos com atividade antioxidante além de compostos fenólicos.

Os extratos de Colocasia sculenta, Echinacea purpurea (raiz), Zingibre officinalis e Pffafia glomerata – exceto o extrato hidroalcoólico de Echinacea purpurea (raiz); apresentaram potencial significativamente menor que os demais extratos. Sendo os extratos de Colocasia sculenta os que apresentaram menor potencial entre eles. Entretanto, o extrato aquoso de Colocasia sculenta apresentou teor de fenólicos significativamente maior que os extratos de Morus alba, e estatisticamente iguais ao extrato aquoso de Foeniculum vulgare e o extrato hidroalcoólico de Echinacea purpurea (folha).

A correlação entre o teor de compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante ainda é bastante controversa. Neste estudo, por exemplo, não houve uma relação direta entre o conteúdo de fenólicos totais e a capacidade antioxidante dos extratos analisados pelo método ORAC. Isso pode ser explicado pela presença de vários outros fitoquímicos, como as antocianinas ou vitaminas que podem influenciar na atividade antioxidante. Sabe-se que diferentes compostos fenólicos têm respostas diferentes no método Folin- Ciocalteu. Da mesma forma, a resposta antioxidante molecular dos compostos fenólicos varia notavelmente, dependendo da sua estrutura química (SATUE- GRACIA et al., 1997). É óbvio que o conteúdo fenólico total medido pelo presente método não fornece uma imagem completa da qualidade ou quantidade dos constituintes fenólicos nos extratos (KATSUBE et al., 2004; WU et al., 2004). Assim, a atividade antioxidante de um extrato pode não estar diretamente relacionada ao seu conteúdo fenólico total, tal qual demonstram os presentes resultados.

Não foi possível encontrar na literatura estudos que utilizaram o método ORAC para avaliar a capacidade antioxidante das mesmas frações das amostras nas condições de extração empregadas, para efeito de comparação. Um estudo relatou um valor ORAC de 148 μmol Equivalente de trolox (TE) por grama para gengibre fresco (Zingiber officinale) (Ninfali et al., 2005). Dado que a raiz de gengibre tipicamente tem um teor de água próximo de 90% (dados não apresentados), isso é equivalente a um valor ORAC de aproximadamente 1500μmol TE por grama de extrato seco equivalente, valor próximo aos encontrados no presente estudo (1385,699 - 1411,873 μmol TE), porém significativamente maior que valor obtido no estudo realizado por Wohlmuth (2008)(262 μmol TE por grama para gengibre seco a 40 ° C). A diferença pode refletir que a composição fitoquímica no material vegetal e as diferenças na metodologia experimental também poderiam ser fatores consideráveis.

5.3.2. FRAP

A atividade antioxidante dos extratos das amostras resultante da extração com água e extração com etanol 70%, foi medida utilizando o método FRAP. Os resultados experimentais para as amostras testadas apresentam-se na tabela 7.

Tabela 7. Capacidade antioxidante dos extratos, pelo método FRAP, expressos em concentração equivalente de Trolox (µmol/g).

Equivalente de Trolox Extrato aquoso (µmol/g amostra) Extrato hidroalcoólico (µmol/g amostra) Amostra s Morus alba 319,63±3,15ª 296,17±1,50e Vítex agnus-castus 687,83±2,75b _462,96±7,07f Foeniculum vulgare 677,33±7,52b _82,04±6,76gi Echinacea purpurea (folha) 660,50±2,09c _{335,00±11,32}a

Colocasia sculenta 60,25±3,99d _129,88±2,41j Echinacea purpurea (raiz) 168,13±6,14h _326,29±7,83a Zingibre officinalis 182,71±6,74h _377,30±5,47o Pffafia glomerata 89,75±5,09i _75,38±1,57gdi Valor = média ± o desvio padrão (n = 3). Letras diferentes indicam médias estatisticamente diferentes ao nível de 5% (Teste de Tukey p<0,05).

As amostras apresentaram diferenças estatísticas significativas quanto aos métodos de extração, exceto os extratos de Pffafia glomerata que não apresentaram diferenças significativas entre si.

Os extratos aquosos de Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare e Echinacea purpurea (folha) apresentaram maior potencial antioxidante quando comparados com os extratos hidroalcoólicos. Por outro lado, nas amostras Colocasia sculenta, Echinacea purpurea (raiz) e Zingibre officinalis, os extratos hidroalcoólicos apresentaram potencial antioxidante significativamente maior que os extratos aquosos. Destaca-se que os extratos aquosos de Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare e Echinacea purpurea (folha) apresentaram potencial antioxidante significativamente maior que os demais.

Os extratos Pffafia glomerata e o extrato hidroalcoólico de Foeniculum vulgare apresentaram menor potencial antioxidante que os demais extratos, e também os menores teores de fenólicos, sugerindo uma relação direta entre o teor de fenólicos e a capacidade antioxidante desses extratos.

A capacidade antioxidante total variou, consideravelmente, de um tipo de amostra para a outra.

Um antioxidante biológico é definido como "qualquer substância que, quando presente em baixas concentrações em comparação com o de um substrato oxidável, atrasa significativamente ou previne a oxidação desse substrato" (HALLIWELL, 1995). Esta definição é clara. No entanto, a menos que um antioxidante evite a geração de ROS, por exemplo, por quelação de metal ou remoção catalisada por enzima de um potencial oxidante, ainda ocorre uma reação de redox. A diferença é que a espécie oxidante reage com o antioxidante em vez do "substrato", isto é, o antioxidante reduz o oxidante. Em termos simples, os antioxidantes não-enzimáticos, como o ácido ascórbico, podem ser utilizados para evitar a geração de ROS, descritos como redutores e a inativação de redutores de oxidantes pode ser descrita como reações de redox em que uma espécie reativa é reduzida à custa da oxidação de outro (GUTTERIDGE, 1994). Neste contexto, amostras com alto teor antioxidante frente ao método FRAP podem ser consideradas boas para evitar a geração de ROS.

5.3.3. DPPH

Em termos de avaliação da capacidade antioxidante pelo método de sequestro do radical DPPH, não existe consenso na literatura sobre a melhor maneira de expressar os resultados. A opção escolhida, foi expressar os resultados obtidos em µmol eq Trolox (Figura 11).

Considerando que este ensaio se baseia na capacidade de determinada substância em sequestrar o radical DPPH, reduzindo-o a hidrazina com mudança simultânea de cor – de violeta para amarelo pálido, quanto maior a absorbância da leitura menor a atividade antioxidante.

Não houve diferença estatística significativa entre os métodos de extração, para nenhuma das amostras. Os extratos de Colocasia sculenta, Echinacea purpurea (raiz), Zingibre officinalis e Pffafia glomerata apresentaram potencial antioxidante significativamente menor do que os extratos de Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare e Echinacea purpurea (folha).

Estudiosos explicam que a taxa de reação de fenólicos antioxidantes com o DPPH depende da composição do solvente, podendo diferir em duas ordens de grandeza para o mesmo composto fenólico conforme o caráter químico do meio reacional. E que as reações em meio alcoólico são mais rápidas do que aquelas em acetato de etila – este último é amplamente usado em análises de potencial antioxidante de amostras apolares como óleos brutos (PREVC et al.; 2013).

Os resultados encontrados para amostras de Foeniculum vulgare estão dentro do intervalo relatado por outros autores para extratos obtidos por diversos métodos, mas particularmente para o método DPPH (Pellati et al., 2003;

Figura 10. Capacidade antioxidante pelo método de sequestro do radical DPPH.

Nas análises de atividade antioxidante, assim como na quantificação de fenólicos totais, diversos fatores podem causar diferenças nos resultados, tais como o método escolhido para a determinação (sequestro de radicais livres ou oxidação lipídica, tempo de reação e solvente utilizado), concentração da amostra, qualidade dos reagentes, presença ou ausência de luz durante a análise, entre outras. A variação de um ou mais desses fatores causa dificuldades na comparação de resultados (SAKANAKA; TACHIBANA; OKADA, 2005).

Neste estudo, observou-se grande diferença entre as atividades antioxidantes determinadas nos extratos nos diferentes ensaios – DPPH, FRAP e ORAC, e o teor de fenólicos. As variações podem ser justificadas pelos diferentes princípios de cada método, bem como os tipos de solventes, as proporções de extrato e solvente, e afinidades químicas entre radicais e antioxidantes.

Wu et al. (2004) demonstraram que a presença de compostos fenólicos em extratos de folhas e raízes, incluindo ácido clorogênico e ácido cafeico, exibiu influência sobre a atividade antioxidante dos extratos, assim como a presença de antocianinas e outros flavonoides. Nenhum ensaio de atividade antioxidante único não foi suficiente para avaliar o potencial antioxidante dos extratos, porque os compostos apresentaram atividade diferente e específica em diferentes ensaios, cada um baseado em princípios diferentes.