Avaliação do E-screen

O ensaio E-Screen explora o princípio de que células humanas de câncer de mama MCF-7 proliferam na presença de substâncias químicas que ativam receptores estrogênicos direta ou indiretamente (SOTO et al., 1995; SPINK et al., 2006).

Os resultados do ensaio E-screen, apresentados nas tabelas 7 e 9, foram expressos pela média de efeito proliferativo (EP) de pelo menos três ensaios independentes, seu desvio padrão (DP) e pelo efeito proliferativo relativo (EPR). Os valores de EPR indicam a capacidade de proliferação celular quando comparado com o controle positivo (17-β-estradiol).

Os extratos hidroalcoólicos de Morus alba, Vítex agnus-castus e Echinacea pupurea (folha) apresentaram EPR negativos na concentração 0,2 mg/mL, sendo classificados como não estrogênicos.

O extrato aquoso de Morus alba apresentou EPR significativamente maior na concentração 0,1mg/mL quando comparado com a concentração 0,2mg/mL. E o extrato aquoso de Colocasia sculenta na concentração 0,2mg/mL apresentou EPR de 20,44%, valor significativamente maior quando comparado com a concentração 0,1mg/mL que apresentou EPR de 12,85%. Entretanto os valores estão abaixo de 25% e, portanto, são classificados como não estrogênicos

O extrato aquoso (concentração de 0,1mg/mL) e hidroalcoólico (concentrações de 0,1mg/mL e 0,2mg/mL) de raiz de equinácea (Echinacea pupurea), apresentaram EPR significativamente maiores quando comparados com o EPR dos extratos de folha de equinácea (Echinacea pupurea) nas mesmas concentrações.

Todos os extratos foram classificados como não estrogênicos, uma vez que os valores analisados de EPR estavam abaixo de 25%. Nenhuma das amostras se mostrou toxica nas concentrações utilizadas. O controle positivo do

ensaio apresentou EP com significância p<0,01 quando comparado com o controle de meio.

Como resultados da avaliação da atividade antiestrogênica dos extratos pelo modelo E-screen, foi observado que embora alguns extratos tenham bloqueado parcialmente o efeito proliferativo induzido pelo estradiol quando avaliado em co-tratamento com E2, nenhum dos extratos apresentou valores abaixo de 80%, portanto não foram considerados antagonistas (Tabelas 11 e 12).

Tabela 9. Atividade estrogênica expressa pela média de EP, seu DP e EPR de extratos aquosos e hidroalcoólicos de Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare e Echinacea pupurea avaliadas pelo ensaio E-screen.

a_{Controle Positivo = 1x10}-9 _{M de 17-β-estradiol.} b_{Controle de solvente (meio RPMI 5% SFB). ** p<0,01 ANOVA.}

Amora (Morus alba) Vítex (Vítex agnus-castus)

Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Extrato Aquoso Extrato hidroalcoólico Concentração

(mg/poço) EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR

C+a _{1,33±0,02** 100 1,33±0,02** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100}

0,1 1,02±0,01 7,27 1,02±0,01 4,98 1,03±0,01 8,70 1,02±0,01 4,98

0,2 1,01±0,01 4,33 0,98±0,02 - 1,03±0,01 8,48 0,99±0,01 -

Csb _{1,00±0,00 0 1,00±0,00 0 1,00±0,00 0 1,00±0,00 0}

Funcho (Foeniculum vulgare) Folha de Equinácea (Echinacea pupurea) Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Extrato Aquoso Extrato hidroalcoólico

EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR

C+a _{1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100}

0,1 1,03±0,01 8,79 1,01±0,01 2,73 1,02±0,01 4,80 1,00±0,01 3,20

0,2 1,02±0,01 6,62 1,01±0,01 1,82 1,01±0,01 3,90 1,01±0,01 -

Tabela 10. Atividade estrogênica expressa pela média de EP, seu DP e EPR de extratos aquosos e hidroalcoólicos de Colocasia suculenta, Echinacea pupurea, Zingibre officinalis e Pfaffia glomerata avaliadas pelo ensaio E-screen.

a_{Controle Positivo = 1x10}-9 _{M de 17-β-estradiol.} b_{Controle de solvente (meio RPMI 5% SFB). ** p<0,01 ANOVA.}

Inhame (Colocasia sculenta) Raiz de equinácea (Echinacea pupurea) Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Concentração

(mg/poço) EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR

C+a

1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,02** 100

0,1 1,04±0,02 12,85 1,05±0,01 13,80 1,05±0,01 15,18 1,05±0,01 15,09

0,2 1,07±0,01 20,44 1,04±0,01 12,24 1,00±0,01 0,93 1,06±0,01 18,85

Csb _{1,00±0,00 0 1,00±0,00 0 1,00±0,00 0 1,00±0,00 0}

Gengibre (Zingibre officinalis) Ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata) Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Extrato aquoso Extrato Hidroalcoólico

EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR

C+a _{1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100}

0,1 1,05±0,01 16,34 1,04±0,01 13,36 1,04±0,01 10,77 1,05±0,02 16,00

0,2 1,05±0,01 16,30 1,04±0,01 12,33 1,05±0,01 15,26 1,05±0,01 15,22

Tabela 11. Atividade antiestrogênica expressa pela média de EP, seu DP e EPR de extratos aquosos e hidroalcoólicos de Morus alba, Vítex agnus-castus, Foeniculum vulgare e Echinacea pupurea avaliadas pelo ensaio E-screen, em co-tratamento com E2.

a_{Controle Positivo = 1x10}-9 _{M de 17-β-estradiol.} b_{Controle de solvente (meio RPMI 5% SFB). ** p<0,01 ANOVA}

Amora (Morus alba) Vítex (Vítex agnus-castus)

Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Extrato Aquoso Extrato hidroalcoólico Concentração

(mg/poço) EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR

C+a _{1,33±0,02** 100 1,33±0,02** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100}

0,1 1,314±0,02 94,568 1,338±0,01 102,056 1,330±0,01 99,416 1,331±0,01 99,762

0,2 1,275±0,01 83,012 1,315±0,02 95,131 1,298±0,02 90,024 1,286±0,02 88,037

Csb _{1,00±0,00 0 1,00±0,00 0 1,00±0,00 0 1,00±0,00 0}

Funcho (Foeniculum vulgare) Folha de Equinácea (Echinacea pupurea) Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Extrato Aquoso Extrato hidroalcoólico

EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR

C+a _{1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100}

0,1 1,329±0,01 99,156 1,323±0,01 97,338 1,327±0,01 98,723 1,308±0,02 92,924

0,2 1,325±0,02 98,031 1,313±0,01 94,352 1,319±0,01 96,213 1,316±0,01 95,304

Tabela 12. Atividade antiestrogênica expressa pela média de EP, seu DP e EPR de extratos aquosos e hidroalcoólicos de Colocasia suculenta, Echinacea pupurea, Zingibre officinalis e Pfaffia glomerata avaliadas pelo ensaio E-screen, em co-tratamento com E2.

a_{Controle Positivo = 1x10}-9 _{M de 17-β-estradiol.} b_{Controle de solvente (meio RPMI 5% SFB). ** p<0,01 ANOVA.}

Inhame (Colocasia sculenta) Raiz de equinácea (Echinacea pupurea) Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Concentração

(mg/poço) EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR

C+a

1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,02** 100

0,1 1,280±0,01 84,733 1,291±0,01 84,008 1,279±0,01 86,203 1,289±0,01 81,408

0,2 1,300±0,01 91,036 1,284±0,01 81,046 1,281±0,01 86,184 1,287±0,01 84,802

Csb _{1,00±0,00 0 1,00±0,00 0 1,00±0,00 0 1,00±0,00 0}

Gengibre (Zingibre officinalis) Ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata) Extrato aquoso Extrato hidroalcoólico Extrato aquoso Extrato Hidroalcoólico

EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR EP±DP EPR

C+a _{1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100 1,33±0,01** 100}

0,1 1,288±0,01 87,323 1,282±0,01 85,596 1,286±0,01 86,676 1,287±0,01 85,804

0,2 1,277±0,01 84,085 1,286±0,01 84,414 1,296±0,01 89,655 1,287±0,01 86,892

Terapias de reposição hormonal para amenizar os sintomas da menopausa, feitas com estrogênios exógenos, têm sido relacionadas ao aumento do risco de câncer de mama (BERAL, 2003) e doenças cardiovasculares (HODIS et al., 2003), e dessa forma não são bem aceitas entre muitas mulheres.

Diversos extratos de plantas são usados como medicamentos naturais e possuem atividade endócrina, como o extrato de uma árvore indiana (Azadirachta indica), usada como contraceptivo e abortivo (FALCONER et al., 2003).

Assim, o estudo de fitoestrogenos se mostra importante devido a possibilidade do uso desses compostos, mimetizando ou modulando a ação de estrogênios endógenos, como um substituto da terapia tradicional (MICHEL et al., 2013). Porém, também é importante devido ao risco que compostos estrogênicos apresentam como contaminantes ambientais, podendo afetar a saúde pública desregulando os níveis hormonais (GARCIA-REYERO et al., 2007).

A atividade estrogênica dos extratos selecionado foi avaliada pelo ensaio E-Screen, que explora o princípio de que células humanas de câncer de mama MCF-7 BUS proliferam na presença de substâncias químicas que podem se ligar aos receptores de estrogênio e induzir a proliferação dessas células cancerígenas (KARAYIANNAKIS et al. 1996).

O ensaio foi realizado sem vermelho de fenol e com soro livre de hormônios. Segundo testes realizados por Berthois et al (1986), o vermelho de fenol possui atividade estrogênica significativa nas concentrações de 15-45 μM (concentrações encontradas nos meios de cultura), provocando estimulação estrogênica parcial aumentando o número de células para 200%. O soro, por sua vez, altera a taxa de proliferação celular de MCF-7.

Os resultados obtidos neste trabalho sugerem ausência de atividade estrogênica e antiestrogênica dos extratos aquosos e hidroalcoólicos de amora (Morus alba), vítex (Vítex agnus-castus), funcho (Foeniculum vulgare), folha e raiz de equinacea (Echinacea purpurea), inhame (Colocasia sculenta), gengibre (Zingibre officinalis) e ginseng brasileiro (Pffafia glomerata) quando avaliados por meio de ensaio de proliferação celular de célula de tumor mamário estrogênio

responsiva. Mesmos os extratos que apresentaram EPR positivo, os valores são baixos e, conforme descrito por Kuch et al., (2010), são consideradas como não estrogênicas.

Os possíveis efeitos dessas ervas e raízes, relatados na medicina popular, para o tratamento dos sintomas da menopausa preconizam o consumo na forma de chás (infusão) ou garrafada (extrato hidroalcoólico). Como já foi comentado, esses tipos de extração tendem a produzir extratos com muitas impurezas, que podem interferir na análise e mesmo na absorção de compostos de interesse (nesse caso os fitoestrogenos). Em estudo realizado com extrato aquoso de F. vulgare, Rosa et al. (2016) não detectou a presença de esteroides e triterpenoides, por exemplo.

Couto et al (2006), em estudo com extrato bruto e infusão de folhas de amora, detectou a presença de substancias similares ao estradiol ligadas a alguma outra estrutura, de forma que, somente após hidrólise se tornaria ativa e quantificável. De forma similar, diversos estudos sugerem que as isoflavonas, representadas principalmente pela genisteína, daidzeína e gliciteína, sofrem hidrolise na microflora intestinal e/ou hidrolise ácida no estomago, antes de serem absorvidas pelo organismo. Inclusive, os metabólitos da biotransformação da daidzeína – equol e O-desmetilangolensina (O-DMA), são compostos de maior potencial estrogênico que a daidzeína (FRANKENFELD et al., 2005; KELLY et al., 1993). No que concerne fitoestrogenos de outras fontes vegetais, carecem estudos a respeito do papel da microbiota na absorção dos mesmos, e das possíveis transformações a que são submetidos após a ingestão.

É possível que ocorra o uso de outros medicamentos da terapia de reposição hormonal, com efeitos clínicos comprovados, juntamente com fitoestrogenos, confundindo-se assim os efeitos do remédio como sendo das plantas (GLAZIER, 2001). Dessa forma, é possível que mesmo ervas que são tradicionalmente usadas, e inclusive vendidas para essa finalidade, não apresentem atividade endócrina nos indivíduos que utilizem esses extratos como único tratamento.

Outro ponto a ser observado são as diferenças biológicas entre os mecanismos de ação dos fitoestrogênios, dos estrogênios naturais e dos

sintéticos. Os estrogênios naturais apresentam altíssima afinidade com os receptores, são facilmente metabolizados pelo fígado e não se acumulam nos tecidos. Quanto aos fitoestrogenos, alguns estudos indicam que mesmo em altas concentrações, eles são facilmente metabolizados e excretados pela urina e pela bílis, na forma de glucoronídios e sulfatos conjugados, não havendo efeito a longo prazo (HOFFMAN et al., 2003; BIRKETT; LESTER, 2003). Outros estudos, entretanto, indicam que os fitoestrogênios tendem a se acumular na gordura e nos tecidos, podendo apresentam efeito ao longo de um tempo maior de tratamento (MOSQUETE et al., 2005). Kaari (2003), comparando o consumo de pílulas de isoflavonas com pílulas de hormônio sintético, observou que os fitoestrogenos apresentaram efeitos positivos (minimizando os sintomas da menopausa) após dois meses de tratamento.

A maioria das células de carcinoma de mama expressam receptores de estrogênio do tipo ERα (MICHALIDES et al., 2004; POPOLO et al., 2011). Estudos indicam que compostos seletivos para receptores estrogênicos do tipo β podem apresentar uma capacidade antiproliferativa mais potente do que os não seletivos, como é o caso do E2 que ativa receptores α e β. O consumo de fitoestrogenos está associado com uma baixa incidência de câncer de mama, (ADLERCREUTZ, 2002) devido ao fato de se ligarem seletivamente a ERβ e recrutarem correguladores para ERβ ativar a transcrição ou repressão, enquanto o E2 se liga igualmente a ERα e ERβ (LOFGREN et al., 2006). Paruthiyil et al. (2004) relataram que fitoestrogênios e estrogênios desenhados para ativar seletivamente ERβ não induzem a formação de câncer de mama, sendo também uma alternativa mais segura para ser utilizada em formulações de reposição hormonal.

Dessa forma, não foi detectada a presença desses compostos no ensaio E-screen, com células MCF7-BUS.