Determinação multirresíduo de agrotóxicos em milho empregando método QuEChERS modificado e LC-MS/MS

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA. JANICE DE FÁTIMA FACCO. DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE AGROTÓXICOS EM MILHO EMPREGANDO MÉTODO QuEChERS MODIFICADO E LC-MS/MS. Santa Maria - RS 2017.

(2) III. Janice de Fátima Facco. DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE AGROTÓXICOS EM MILHO EMPREGANDO MÉTODO QuEChERS MODIFICADO E LC-MS/MS. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Química, Área de Concentração em Química Analítica, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências.. Orientadora: Prof. Dr. Renato Zanella. Santa Maria, RS 2017.

(3) IV. Janice de Fátima Facco. DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE AGROTÓXICOS EM MILHO EMPREGANDO MÉTODO QuEChERS MODIFICADO E LC-MS/MS. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Química, Área de Concentração em Química Analítica, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências.. Aprovada em 22 de setembro de 2017:. Santa Maria, 2017..

(4) V.

(5) VI. AGRADECIMENTOS Dedico este trabalho a minha família, amo vocês! Agradeço ao Prof. Dr. Renato Zanella, pela orientação e pela oportunidade de fazer parte do grupo do Laboratório de Análises de Resíduos de Pesticidas (LARP), foram oito anos de aprendizado e crescimento pessoal, muito obrigada! Agradeço a Drᵃ Martha Bohrer Adaime pela co-orientação nos trabalhos e pelo aprendizado obtido, muito obrigada! À banca de defesa da tese, professores Dr. Osmar Damian Prestes, obrigada pela disponibilidade e paciência em ajudar no desenvolvimento do trabalho, ao Dr. Manoel Leonardo Martins, ao Dr. Ubiratan Flores da Silva e ao Dr. Fábio Ferreira Gonçalves, por avaliarem este trabalho e por suas contribuições. Ao Dr. Gustavo Marck Teló pelas sugestões dadas na qualificação deste trabalho. Aos meus colegas, integrantes do LARP, em especial ao meu braço direito Nathália e a Lucila, pois sem a ajuda de vocês não teria conseguido. Que Deus ilumine vocês e que tenham muito sucesso na jornada profissional. Ao Nelson e a Pimpernelli pela ajuda prestada durante o desenvolvimento do trabalho. Ao Felipe, Gabriel, Gabrieli, Magali, Tieli e aos demais pela convivência e amizade tanto nas horas boas como nas difíceis. Agradeço de forma muito especial aos meus familiares, pai, mãe e irmãos pelo apoio, paciência e palavras de incentivo. Aos meus amigos e colegas de trabalho que tornaram esta caminha mais fácil. Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Química, Valéria e Ademir, obrigada por toda ajuda prestada durante o curso. À Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) por proporcionar esta formação..

(6) VII. RESUMO. DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE AGROTÓXICOS EM MILHO EMPREGANDO MÉTODO QuEChERS MODIFICADO E LC-MS/MS AUTOR: Janice de Fátima Facco ORIENTADOR: Renato Zanella O milho é um cereal utilizado na alimentação humana e animal e, além disso, é empregado como fonte de matéria prima para outros subprodutos, adquirindo assim uma importância mundial. Por apresentar uma composição bem distinta, quando comparada a outros cereais, a determinação de resíduos de agrotóxicos torna-se bastante complexa, exigindo métodos e ferramentas mais eficientes. Este estudo tem como objetivo validar o método QuEChERS modificado, empregando como etapa de limpeza o congelamento e o sorvente EMR-Lipid com determinação por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em série (LC-MS/MS). Neste método avaliou-se diferentes classes de agrotóxicos em diferentes níveis de concentração. O método foi validado para 45 agrotóxicos com percentuais de recuperação de 69,1 a 120,4% e RSD ≤20,6%, respectivamente. Os Limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) do método foram de 3 a 30 µg kg-1 e de 10 a 100 µg kg-1, respectivamente. O método proposto foi aplicado em amostras reais, entre elas grãos de milho inteiros e quebrados, farinha de milho e uma de pipoca a fim de avaliar seu desempenho. Nas amostras analisadas, apenas uma amostra apresentou carbendazim e fipronil em concentração inferior ao LOQ do método estabelecido. O método mostrou-se eficiente para a determinação de resíduos dos agrotóxicos em amostras de milho podendo ser utilizado em análises de rotina.. Palavras chave: milho, multirresíduos, QuEChERS, freezing out, EMR-Lipid, LCMS/MS.

(7) VIII. ABSTRACT. MULTIRESIDUE DETERMINATION OF PESTICIDES IN CORN BY MODIFIED QuEChERS METHOD AND LC-MS/MS. AUTHOR: Janice de Fátima Facco ADVISOR: Renato Zanella Corn is a cereal used in human and animal food, and moreover, as a source of raw material for other by-products, acquiring global importance. By presenting a distinct centesimal composition when compared with others cereals, the residue analysis becomes more complex, requiring methods and tools more efficient to reach the objective. This study has as goal the validation of a modified QuEChERS method employing a clean-up step with freezing out and EMR-Lipid sorbent with determination by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). In this method, different classes of pesticides in different levels of concentration were evaluated. The method was validated for 45 pesticides with recovery and RSD results between 70 and 120% and ≤ 20%, respectively. The method limits of detection and quantification were 3 to 30 µg kg -1 and 10 to 100 µg kg-1, respectively. The proposed method was applied in real samples, including whole and broken corn seed, corn flour and popcorn in order to evaluate the performance. In the analyzed samples, carbendazim and fipronil were found in a unique sample in concentrations below method LOQ. The proposed method showed to be efficient for the determination of pesticide residues in corn samples.. Keywords: corn, multiresidue, QuEChERS, freezing out, EMR-Lipid, LC-MS/MS.

(8) IX. LISTA DE FIGURAS. Figura 1 - Anatomia do grão de milho e suas partes. ............................................19 Figura 2 - Processamento do grão de milho através da moagem por via seca e os produtos obtidos. ..................................................................................21 Figura 3 - Processamento do grão de milho através da moagem por via úmida. .22 Figura 4 - Produção em milhões de toneladas do grão de milho na safra 2015/2016 no Brasil..............................................................................23 Figura 5 - Resultado das análises de resíduos de agrotóxicos realizadas pelo PARA em amostras de fubá de milho...................................................26 Figura 6 - Esquema de um analisador do tipo triplo quadrupolo. ..........................41 Figura 7 - Número de compostos com recuperação entre 70 e 120% e RSD ≤ 20% obtido em cada ensaio. ........................................................................65 Figura 8 - Número de compostos obtido com recuperação e RSD aceitáveis nos testes T4 e T5. .......................................................................................66 Figura 9 - Média das áreas normalizadas obtida em diferentes tempos de resfriamento. ........................................................................................67 Figura 10 - Fluxograma do procedimento de extração para avaliação da etapa de limpeza do extrato. ...............................................................................68 Figura 11 - Número de compostos com recuperação entre 70 e 120% com valores de RSD ≤ 20% em cada ensaio de limpeza do extrato. .......................68 Figura 12 - Comparação do RSD (%) entre os ensaios com PSA + C18 e EMR/Polish.. .........................................................................................70 Figura 13 - Fluxograma do procedimento de extração validado para o grão de milho utilizando EMR e Polish. .............................................................71 Figura 14 - Cromatogramas obtidos por QuEChERS modificado e LC-MS/MS para (A) fortificação na amostra “branco” no nível de 150 µg L -1, (B) amostra “branco” de milho..................................................................................72 Figura 15 - Sobreposição do ponto na matriz (CTM) 2,5 µg L-1 com a amostra contendo fipronil em concentração menor que o LOQm. ......................79.

(9) X. LISTA DE TABELAS. Tabela 1- Oferta e demanda do milho no Brasil em valores de mil toneladas. .....24 Tabela 2 - Oferta e demanda mundial de milho. ...................................................25 Tabela 3 - Classificação toxicológica das formulações de agrotóxicos. ................26 Tabela 4 - Técnicas de preparo de amostra e determinação de agrotóxicos em milho e outros cereais. .........................................................................30 Tabela 5 - Parâmetros avaliados na validação de um método analítico. ..............45 Tabela 6 - Agrotóxicos selecionados no desenvolvimento do método. .................49 Tabela 7 - Gradiente de fase móvel utilizado para a eluição dos analitos. ............53 Tabela 8 - Ensaios de avaliação de diferentes métodos QuEChERS, quantidade de solvente extrator e amostra. ............................................................55 Tabela 9 - Testes de limpeza variando quantidades e o tipo de sorvente por mL de extrato. .................................................................................................57 Tabela 10 - Condições no sistema LC-MS/MS......................................................62 Tabela 11 - Agrotóxicos com seus respectivos tempos de retenção, íon precursor, íon produto, energia de colisão, energia do cone e modo de ionização. .............................................................................................................63 Tabela 12 - Resultados do teste t de Student para a comparação entre as massas residuais obtidas no teste gravimétrico. ...............................................65 Tabela 13 - Equação da reta e coeficientes de determinação (r2) e efeito matriz para cada agrotóxico estudado. ...........................................................73 Tabela 14 - Valores obtidos de LOQ e LOD do método para cada agrotóxico estudado. ..............................................................................................75 Tabela 15 - Resultados de recuperação, precisão na validação e na precisão intermediária. ........................................................................................77.

(10) XI. LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS. ABIMILHO ANVISA APCI. Associação Brasileira das Indústrias do Milho Agência Nacional de Vigilância Sanitária Ionização Química a Pressão Atmosférica, do inglês Atmospheric Pressure Chemical Ionization ASE Extração acelerada por solvente, do inglês Accelerated Solvent Extraction C18 Sílica modificada com hidrocarboneto linear C18, octadecilsilano CI Ionização Química, do inglês Chemical Ionization CV Coeficiente de variação DIC Dissociação induzida por colisão, do inglês collision-induced dissociation DL50 Dose letal 50% da população DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva, do inglês Dispersive LiquidLiquid Microextraction DMAE Dynamic Microwave-Assisted Extraction DMF Dimetilformamida d-SPE Extração em fase sólida dispersiva, do inglês Dispersive Solid Phase Extraction EI Ionização por elétrons, do inglês Electron Ionization EMR-Lipid Enhanced matrix removal ESI Ionização por Eletronebulização, do inglês Electrospray Ionization EU União européia, do inglês European Union EUA Estados Unidos FAO Organização das Nações Unidas para a Alimentação e Agricultura, do inglês Food and Agriculture Organization of the United Nations GC Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography GCB Carbono Grafitizado, do inglês Graphitized Carbon Black GC-ECD Cromatografia Gasosa com Detector por Captura de Elétrons, do inglês Gas Chromatography - Electron Capture Detector FID Detector por ionização em chama, do inglês Flame Ionization Detector GC-FPD Cromatografia Gasosa com Detector Fotométrico de Chama, do inglês Gas Chromatography - Flame Photometric Detector GC-MS Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas, do inglês Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry GC-MS/MS Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas em Série, do inglês Gas Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry GC-NPD Cromatografia Gasosa com Detector de Fósforo e Nitrogênio, do inglês Gas Chromatography - Nitrogen Phosphorus Detector GC-TOFMS Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas com Analisador por Tempo de Vôo, do inglês Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry “time-of-flight analiser” GPC Cromatografia de Permeação em Gel, do inglês Gel Permeation Chromatography.

(11) XII. HPLC. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, do inglês High Performance Liquid Chromatography HPLC-MS/MS Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas em Série, do inglês High Performance Liquid Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial LARP Laboratório de Análise de Resíduos de Pesticidas LC-MS/MS Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas em Série, do inglês Liquid Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry LLE Extração Líquido-Líquido, do inglês Liquid-Liquid Extraction LMR Limite Máximo de Resíduos LOD Limite de Detecção, do inglês Limit of Detection LODi Limite de Detecção do instrumento, do inglês Limit of Detection of the Instrument LODm Limite de Detecção do método, do inglês Limit of Detection of the Method LOQ Limite de Quantificação, do inglês Limit of Quantification LOQi Limite de Quantificação do Instrumento, do inglês Limit of Quantification of the Instrument LOQm Limite de Quantificação do método, do inglês Limit of Quantification of the Method M. M. Massa Molecular m/z Razão massa/carga MA-NPS-DME Medium-Assisted Non-polar Solvent Dynamic Microwave Extraction MAE Extração Assistida por Microondas, do inglês Microwave Assisted Extraction MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MeCN Acetonitrila MRM Monitoramento de Reações Múltiplas, do inglês Multiple Reaction Monitoring. MS Espectrometria de Massas, do inglês Mass Spectrometry MS/MS Espectrometria de Massas em Série, do inglês Tandem Mass Spectrometry MSPD Dispersão da Matriz em Fase Sólida, do inglês Matrix Solid-Phase Dispersion n Número de replicatas NIST Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia, do inglês National Institute of Standards and Technology OMS Organização Mundial da Saúde PBT Precipitação em baixa temperatura, do inglês Low Temperature Precipitation. PC Padrão de controle PI Padrão Interno PLE Extração com Líquido Pressurizado, do inglês Pressurized Liquid Extraction PNCRC Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes PSA Amina primária secundária, do inglês Primary Secondary Amine.

(12) XIII. PTFE PTV. Politetrafluoretileno Temperatura Programada de Vaporização, do inglês Programmed Temperature Vaporization QqQ Triplo Quadrupolo QuEChERS Rápido, fácil, econômico, robusto e seguro, do inglês Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe QuPPe Método rá pido para análise de pesticidas altamente polares na EU, do inglês quick method for analysis of highly polar pesticide in EU r2 Coeficiente de determinação rpm Rotações por minuto RSD Desvio Padrão Relativo, do inglês Relative Standard Deviation RSDpi Desvio Padrão Relativo para Precisão Intermediária RSDr Desvio Padrão Relativo para Repetitividade S/R Sinal/ruído SANTE Guia de Saúde e Proteção do Consumidor, do francês Santé et Protection des Consommateurs SBSE Extração Sortiva com Barra Magnética, do inglês Stir-Bar Sorptive Extraction SFC-MS/MS Cromatografia fluídica supercrítica / espectrometria de massa em tandem, do inglês Supercritical fluid chromatography/tandem mass spectrometry. SFE Extração por Fluido Supercrítico, do inglês Supercritical Fluid Extraction SFO Solidification of Floating Organic Drop SHLLE Extração Homogênea Liquido-Liquido com salting-out, do inglês, Salting-Out Homogeneous Liquid–Liquid Extraction SIM Monitoramento do Íon Selecionado, do inglês Selected Ion Monitoring SLE-LTP Extração Sólido-Líquido com Precipitação a Baixa Temperatura, do inglês solid-liquid extraction with low temperature purification SOX Extração por Soxhlet, do inglês Soxhlet Extraction SPE Extração em Fase Sólida, do inglês Solid Phase Extraction SPME Microextração em Fase Sólida, do inglês Solid Phase Micro Extraction SRM Monitoramento de Reação Selecionada, do inglês Selected Reaction Monitoring. SSE Extração com Solvente Supercrítico, do inglês Subcritical Solvent Extraction TPP Trifenilfosfato, do inglês triphenylphasphate TQ Triplo Quadrupolo tR Tempo de retenção UFSM Universidade Federal de Santa Maria UHPLC-MS/MS Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas em Série, do inglês Ultra High Performance Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry USDA Departamento da Agricultura dos Estados Unidos, do inglês United States Department of Agriculture v/v Volume por volume.

(13) XIV. APÊNDICE Apêndice A – Estruturas dos agrotóxicos avaliados..............................................97.

(14) XV. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 17 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................................. 19 2.1 O milho ............................................................................................................19 2.2. Processamento e derivados do milho ............................................................20 2.3. A cadeia produtiva do milho no Brasil e no mundo ........................................22 2.4 Agrotóxicos, definição, classificação e toxicidade ...........................................25 2.4.1 Controle e uso de agrotóxicos na cultura do milho e derivados........26 2.5. Técnicas de preparo de amostras empregadas na determinação de resíduos de agrotóxicos em milho .......................................................................................27 2.5.1. Preparo de amostra utilizando QuEChERS .........................................36 2.6 Métodos de determinação de agrotóxicos em cereais e derivados .................39 2.6.1. Cromatografia líquida de alta performance acoplada à espectrometria de massas em série (LC-MS∕MS) ..........................................40 2.6.2 Aplicação do método QuEChERS e LC-MS/MS na análise de agrotóxicos em milho e seus derivados ........................................................42 2.7 Validação de métodos cromatográficos...........................................................44 3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 46 3.1 Instrumentação ................................................................................................46 3.2 Materiais e reagentes utilizados ......................................................................47 3.3 Processamento da amostra.............................................................................47 3.4 Seleção do padrão interno e do padrão de controle ........................................48 3.5 Agrotóxicos selecionados ................................................................................48 3.6 Preparo das soluções analíticas ......................................................................52 3.7 Otimização do sistema LC-MS/MS para a determinação de resíduos de agrotóxicos em milho ............................................................................................52 3.7.1 Escolha da fase móvel ...........................................................................53 3.7.2 Condições utilizadas no sistema LC-MS/MS ........................................53 3.8 Desenvolvimento do método para determinação de resíduos de agrotóxicos em milho ................................................................................................................54 3.8.1 Teste gravimétrico ..................................................................................57.

(15) XVI. 3.9 Validação do método QuEChERS para a análise de resíduos de agrotóxicos em milho ................................................................................................................58 3.9.1 Seletividade ..............................................................................................58 3.9.2 Curva analítica e faixa de trabalho ...........................................................58 3.9.3 LOD e LOQ do instrumento e do método .................................................59 3.9.4 Ensaios de recuperação para avaliação da exatidão ...............................59 3.9.5 Precisão (repetitividade) e precisão intermediária ....................................60 3.9.6 Efeito matriz ..............................................................................................60 3.10 APLICAÇÃO DO MÉTODO EM AMOSTRAS REAIS ....................................61 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................................... 62 4.1. Condições do sistema LC-MSMS empregado para a determinação de agrotóxicos em milho ............................................................................................62 4. 2 Otimização do método QuEChERs para análise de agrotóxicos em milho ....64 4.3 Validação do método otimizado ......................................................................70 4.3.1 Seletividade .............................................................................................71 4.3.2 Curva analítica, faixa linear e efeito matriz ...........................................72 4.3.3 Limite de detecção (LOD), Limite de quantificação (LOQ) do método ...........................................................................................................................74 4.3.4 Exatidão (ensaios de recuperação), precisão (repetibilidade e precisão intermediária) ...................................................................................76 4.4 Aplicação do método em amostras reais ........................................................79 5 CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 80 6 SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS ................................................................ 81 7 DESTINAÇÃO DOS RESÍDUOS GERADOS NO LABORATÓRIO ..................... 82 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 83 9 ANEXOS ................................................................................................................................... 94.

(16) 17. 1 INTRODUÇÃO Os cereais são os alimentos mais produzidos e consumidos em todo mundo e são uma importante fonte de energia, fibras, ácidos graxos, minerais e vitaminas na alimentação humana e animal (GONZÁLEZ-CURBELO et al., 2012). O milho é um cereal considerado uma importante fonte de proteínas, carboidratos, que variam de 60 a 80% e ainda de lipídeos que pode variar de 3 a 5% no grão (REGITANO-dÀRCE e VIEIRA, 2015). Este cereal apresenta vantagens bem significativas quando comparado a outras culturas quando se fala em uma fonte de matéria-prima. Sob esta visão busca-se incentivar o consumo deste, visando aumentar a qualidade nutricional da alimentação, bem como o consumo de seus derivados e assim, estimular o crescimento desta cultura (STRAZZI, 2015). Em termos de produtividade de uma cultura, o que se deseja é o aumento da quantidade de grãos, porém isso não é possível sem o uso de agrotóxicos. Na cultura do milho, nos diferentes estágios da produção se faz o uso de agrotóxicos, o armazenamento dos grãos é a última etapa antes da obtenção do derivado ou produto final, e neste estágio é necessário garantir a qualidade e a longevidade do produto. Nesta etapa, piretróides, organofosforados e outras classes de agrotóxicos são utilizados a fim de prevenir o ataque de insetos e fungos. O uso de agrotóxicos pode gerar resíduo e aumentar o risco de contaminação para a saúde humana, pois durante esta etapa tendem a penetrar e acumular no grão (MORENO-GONZÁLEZ et al., 2014; GONZÁLEZ-CURBELO et al., 2017). Deste modo, é necessário assegurar que as aplicações dos agrotóxicos obedeceram às boas práticas agrícolas e, além disso, assegurar que o produto final é seguro para o consumidor. Sendo assim, o monitoramento destes resíduos é uma ferramenta importante. para. o. cumprimento. deste. objetivo. (ANAGNOSTOPOULOS;. MILIADIS, 2013). A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em série (LC-MS/MS, do inglês Liquid Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry) é uma das técnicas amplamente utilizada na determinação de resíduos de agrotóxicos em diferentes matrizes, devido a sua elevada detectabilidade e seletividade (PRESTES et al., 2009). Entretanto, análise.

(17) 18. cromatográfica de extratos provenientes de amostras complexas exigem métodos de preparo e limpeza de amostra eficientes a fim de evitar o comprometimento dos resultados (KOESUKWIWAT et al., 2010). O método QuEChERS (do inglês Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) é utilizado para uma diversidade de alimentos. A etapa de preparo de amostra torna a análise mais fácil pela diminuição de interferentes da matriz, garantindo resultados mais confiáveis, além de possibilitar a análise de um grande número de compostos (PRESTES et al., 2009). Este trabalho tem como objetivo validar um método para a determinação multirresíduos de agrotóxicos em milho, incluindo compostos autorizados e não autorizados para a cultura, utilizando o método QuEChERS modificado e posterior análise por LC-MS/MS. Além disso, como objetivos específicos otimizar o tempo ideal para a etapa de freezing out, avaliar diferentes sorventes na etapa de limpeza do extrato final e aplicação do método em amostras reais..

(18) 19. 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 O milho O milho, Zea mays L., é uma espécie originária do México. A palavra Zea vem do grego e quer dizer “semente ou grão”, e pertence à família das Poaceae (FELIPPE, 2007, EMBRAPA, 2002). Este grão é produzido e consumido desde o ano 5.000 a.C como base da alimentação dos mais diferentes povos. Com o passar dos tempos o cultivo do milho foi se expandindo por todo o mundo (ABIMILHO, 2015a). O grão de milho é formado pelo endosperma, gérmen, pericarpo (casca) e ponta, como observa-se na Figura 1. De acordo com a USDA (2016) a composição centesimal em 100 gramas é de 10,37 g de água, 9,42 g de proteína, 74,26 g de carboidrato, 7,3 g de fibra total, 0,64 g de açúcares e 4,74 g de lipídios. O gérmen contém 33,3% de gordura, além de vitaminas do complexo B e antioxidantes como a vitamina E. O óleo do gérmen contém 54,7% de ácidos graxos poli-insaturados (GWIRTZ e GARCIA-CASAL, 2014). Destes o linoleico é o mais abundante (59,6%), seguido pelo oleico (25,4%), palmítico (10,9%), esteárico (2%) e linolênico (1,2%) (REGITANO-dÀRCE e VIEIRA, 2015). Figura 1 - Anatomia do grão de milho e suas partes.. Fonte: Adaptado de Gwirtz e Garcia-Casal, 2014..

(19) 20. Este cereal apresenta em sua composição vitaminas A e do complexo B, gorduras, proteínas, carboidratos, amido e sais minerais. Além disso, é um produto bastante utilizado na fabricação de medicamentos, balas, bebidas, alimentos processados, ração animal, entre outros (ABIMILHO, 2015a). Sua utilização é destacada por Strazzi (2015) que diz que, “os derivados de milho são usados em mais de 150 diferentes produtos industriais”.. 2.2. Processamento e derivados do milho. O milho em grão é o produto final da colheita e este é destinado ao armazenamento para posteriormente ser processado a derivados e chegar ao consumidor final (REGITANO-dÀRCE; SPOTO; CASTELLUCCI, 2015). Segundo Strazzi (2015) “o consumo per capita brasileiro não atinge 20 kg/habitante/ano, quantidade pequena quando comparada à do México, que tem um consumo de 63 kg/habitante/ano”. Durante a produção deste cereal o milho “verde” também é consumido pela população sendo industrializado por empresas de enlatados ou utilizado na alimentação animal. Mas, do total da produção mundial somente 15% é destinado à alimentação humana direta (REGITANO-dÀRCE; SPOTO; CASTELLUCCI, 2015). Geralmente os grãos de milho passam por alguns processos de transformação industrial para que possam ser consumidos pelo ser humano e animais, mas isso vai depender do produto final que se deseja obter (REGITANOdÀRCE; SPOTO; CASTELLUCCI, 2015; STRAZZI, 2015). No Brasil, os derivados mais consumidos são o fubá, a farinha e a canjica que são obtidos pelo mesmo processo de transformação. Alguns produtos, como o amido, óleo, grãos, farelo e a farinha, são empregados em molhos, sopas, fermentos, xaropes, alimentos infantis, fonte de fibras e lanches etc (BORÉM e RIOS, 2011). O processamento do milho depende do produto final e pode ser realizado por via úmida e via seca (BORÉM e RIOS, 2011; REGITANO-dÀRCE; SPOTO; CASTELLUCCI, 2015; STRAZZI, 2015). Geralmente a moagem a seco tem como finalidade destinar produtos para a alimentação humana e a moagem por via úmida obter produtos de insumos (BORÉM e RIOS, 2011)..

(20) 21. No processamento por via seca, o grão é degerminado, ou seja, o gérmen é removido para a extração do óleo. O endosperma resultante do processo é destinado para a produção da canjica, ou ainda de outros produtos, como pode ser observado na Figura 2. O fubá pode ser produzido por dois modos, pela trituração do milho inteiro ou pela moagem da canjica. Já a farinha de milho ou creme de milho é formada pela fração amilácea do grão a partir do peneiramento com malhas muito finas. Para este processo utiliza-se milhos duros e semiduros, pois o rendimento obtido é maior e de melhor qualidade (BORÉM e RIOS, 2011; STRAZZI, 2015). Figura 2 - Processamento do grão de milho através da moagem por via seca e os produtos obtidos.. Fonte: Adaptado de MAPA, 2007.. Na moagem por via úmida uma etapa de maceração é realizada em tanques com água aquecida entre 50 e 54 °C, por um tempo de 36 a 48 h, com ácido sulfuroso O meio ácido tem como finalidade inibir o crescimento de microrganismos de deterioração e promover o rompimento das ligações dissulfeto. Além disso, facilita a liberação do amido durante a moagem e a.

(21) 22. purificação final o que possibilita o aumento da recuperação do gérmen. As proteínas recuperadas durante este processo são comercializadas como ração de glúten e destinadas a alimentação de animais (BORÉM e RIOS, 2011; STRAZZI, 2015). A Figura 3 apresenta o esquema do processamento por via úmida.. Figura 3 - Processamento do grão de milho através da moagem por via úmida.. Fonte: Adaptado de MAPA, 2007.. De acordo com dados da Associação Brasileira das Indústrias do Milho, no ano de 2013, o consumo industrial deste cereal em moagem à seco foi de 2,2 milhões de ton, já em moagem à úmido foi de 2,4 milhões de ton e o consumo in natura foi de aproximadamente 1,02 milhões de ton (ABIMILHO, 2015b).. 2.3. A cadeia produtiva do milho no Brasil e no mundo No Brasil, a produção nacional da safra 2015/2016, apresenta como os principais estados produtores deste cereal o Mato Grosso, Paraná, Mato Grosso do Sul, Goiás, Minas Gerais, Rio Grande do Sul e São Paulo. A Figura 4 apresenta a quantidade e o percentual de produção de milho por estado produtor na safra (MAPA, 2016)..

(22) 23. Figura 4 - Produção em milhões de toneladas do grão de milho na safra 2015/2016 no Brasil.. Fonte: Adaptado de MAPA, 2016.. Segundo a Abimilho ao avaliar a distribuição da oferta e demanda desta cultura, nos diferentes setores abastecidos no Brasil, analisando-se as safras de 2012/2013 a 2016/2017, conforme Tabela 1, pode-se observar que a maior demanda se dá para o consumo animal, seguido da exportação e posteriormente o consumo industrial e humano (ABIMILHO, 2017)..

(23) 24. Tabela 1- Oferta e demanda do milho no Brasil em valores de mil toneladas. 15/16 16/17 12/13 13/14 14/15 mar mar Oferta Estoque inicial 11,223 14,078 17,881 14,201 8,063 Produção total 83,462 82,76 87,153 73,887 97,705 Produção 1ᵃ safra 37,126 33,417 30,948 28,851 33,782 Produção 2ᵃ safra 46,336 49,343 56,205 45,037 63,923 Importação 911 791 370 2,902 600 Consumo de 2,000 2,000 2,000 1,000 1,000 substitutos Oferta total 97,597 99,628 107,4 91,99 107,37 Demanda Consumo animal 43,453 47,177 49,454 48,067 49,329 Aves de corte 21,479 23,52 24,578 24,086 24,707 Aves de postura 3,661 3,917 4,074 3,992 4,039 Suinocultura 11,648 12,556 13,247 12,584 12,973 Bovinocultura 3,684 3,979 4,158 4,075 4,181 Outros animais 2,981 3,205 3,397 3,329 3,429 Consumo industrial 5,209 5,99 6,589 6,523 6,653 Consumo humano 1,882 1,873 1,863 1,845 1,882 Outros usos 4,257 4,014 4,227 3,584 3,877 Perdas 1,669 1,655 1,743 1,582 1,954 Sementes 425 381 403 443 451 Exportação 26,625 20,655 28,924 21,883 30,000 Demanda total 85,519 81,744 93,203 83,927 94,146 Estoque final 14,077 17,884 14,201 8,063 13,222 Mar: março Fonte: Adaptado de ABIMILHO, 2017.. De acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2016), as projeções para a cultura do milho entre as safras de 2015/2016 a 2025/2026, são de que a produção terá um aumento de 24,2%, a exportação de 52,4% e o consumo de 20,8%. Dados do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) demonstram a variação da oferta e a demanda de milho no mundo, em milhões de toneladas, nos meses de março e abril de 2017, correspondentes à safra 2016/2017, conforme a Tabela 2. Observa-se que o Brasil é um país que contribui com uma grande produção deste grão no mercado mundial, pois um aumento significativo da produção pode ser observado quando comparada as produções das safras 2011/2012 a 2016/2017..

(24) 25. Tabela 2 - Oferta e demanda mundial de milho.. Produção EUA 384,78 Brasil 91,5 Argentina 37,5 1.049,24 Mundo bilhão t Fonte: MENDES, 2017.. Números Safra 2016/2017 Março Estoques Exportações Produção 58,93 56,52 384,78 7,84 31 93,5 2,56 25,5 38,5 1.053,24 220,68 bilhão t. Abril Estoques 58,93 8,57 2,86. Exportações 56,52 32 26. 222,98. 2.4 Agrotóxicos, definição, classificação e toxicidade O Codex Alimentarius define agrotóxico como toda e qualquer substância utilizada com o propósito de prevenir, destruir, atrair, repelir, ou controlar qualquer peste, incluindo espécies indesejáveis de plantas, insetos ou animais, durante as etapas de produção, armazenamento, transporte, distribuição, e processamento do alimento ou ração animal. O termo inclui substâncias utilizadas como reguladoras de crescimento das plantas, desfolhantes, dessecantes ou inibidoras de brotos, e substâncias aplicadas tanto antes como após a colheita, para proteger a mesma da deterioração durante o armazenamento e transporte dos alimentos (FAO, 2005). De acordo com Silva e Fay (2004) os agrotóxicos são classificados de acordo com o seu modo de ação: inseticidas, herbicidas, fungicidas, acaricidas, moluscicidas, rodenticidas. Por apresentarem o uso destas substâncias favorecido, deixa largo espectro de ação, com fácil aplicação e a rápida atuação. Consequentemente, são responsáveis pelos diversos efeitos prejudiciais sobre os ecossistemas, dependendo da toxicidade da substância, do tempo de exposição, da dose e da persistência no meio ambiente (SILVA e FAY, 2004). Os agrotóxicos possuem uma classificação no Brasil, expressa como toxicidade aguda em termos de valor da dose letal 50% (DL50), que é representada pela relação mássica de miligramas do produto tóxico por quilograma de massa viva. A DL50 é a dose ingerida ou administrada, pela mesma via que provoca a morte de 50% da população em estudo. São quatro classes toxicológicas, de acordo com o Ministério da Saúde, onde cada classe é representada por uma cor, como mostra a Tabela 3 (Jardim; Andrade; Queiroz (2009); Barbosa, (2004))..

(25) 26. Tabela 3 - Classificação toxicológica das formulações de agrotóxicos.. Classificação Cor da faixa. DL50. Classe I. Extremamente tóxico. ≤ 5 mg kg-1. Classe II. Altamente tóxico. 5< DL50 ≤ 50 mg kg-1. Classe III. Medianamente tóxico. 50 < DL50 ≤ 500 mg kg-1. Classe IV. Pouco tóxico. DL50 > 5000 mg kg-1. 2.4.1 Controle e uso de agrotóxicos na cultura do milho e derivados O MAPA elaborou a Instrução Normativa SDA N⁰ 42, de 31 de dezembro de 2008 que apresenta o Plano Nacional de Resíduos e Contaminantes em Produtos de Origem Vegetal (PNCRC Vegetal), que tem como objetivo inspecionar e fiscalizar a qualidade dos produtos de origem vegetal produzidos no país, quanto à ocorrência de resíduos de agrotóxicos e contaminantes químicos e biológicos, que são destinados ao mercado interno e a exportação. A investigação de produtos não conformes e a fiscalização dos ingredientes ativos de uso proibido e não registrados para determinada cultura, bem como a violação dos limites máximos são determinações do PNCRC (MAPA, 2013a). O relatório do Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA) da Anvisa apresenta a quantidade de amostras analisadas e os resultados insatisfatórios por estados e culturas na safra 2012 (Figura 5).. Figura 5 - Resultado das análises de resíduos de agrotóxicos realizadas pelo PARA em amostras de fubá de milho.. Fonte: Adaptado de Anvisa, 2014..

(26) 27. Os resultados para 208 amostras de fubá de milho foram avaliadas e seis delas tiveram resultados insatisfatórios. Nestas, foram encontradas resíduos de clorpirifós e bifentrina em concentração acima do LMR permitido e também carbaril (0,21 mg kg-1) como ingrediente ativo não permitido para a cultura (ANVISA, 2014a). Segundo a Instrução Normativa Nº 1, de 4 de janeiro de 2013 (MAPA, 2013b), que apresenta os resultados das análises feitas pelo PNCRC realizadas na ano-safra 2011/2012 em algumas culturas, os resultados para grãos de milho, mostram que os estados do Paraná e Bahia apresentaram resultados não conformes para os agrotóxicos bifentrina (0,162 mg kg-1) e cipermetrina (0,070 mg kg-1), ou seja, resultados acima do Limite Máximo de Resíduos (LMR). Em 2015, através da portaria SDA nº 44, de 12 de maio de 2015 publicouse os resultados do Programa Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes referente ao ano safra 2013/2014 para o milho e outras culturas agrícolas. Para este cereal, apenas uma amostra no estado de Goiás não estava em conformidade com o LMR permitido para o composto cipermetrina que é de 0,05 mg kg-1 e a quantidade encontrada foi de 0,0611mg kg-1 (MAPA, 2015b). No relatório de atividades de 2013 a 2015 do PARA, foi analisado 729 amostras de milho (fubá) e em uma amostra foi detectado pendimetalina com concentração acima do LMR. Outras 12 amostras foram consideradas insatisfatórias devido à presença de diclorvós que não é permitido para uso agrícola. Os agrotóxicos detectados foram clorpirifós, deltametrina, malationa, metomil e pirimifós-metílico em concentração inferior ao LMR estabelecido (ANVISA, 2016). Neste contexto, é de suma importância a criação de programas de monitoramento de resíduos de agrotóxicos na cultura de milho, bem como de seus derivados com o propósito de garantir o consumo seguro destes alimentos. 2.5. Técnicas de preparo de amostras empregadas na determinação de resíduos de agrotóxicos em milho O preparo da amostra é uma etapa crucial em um procedimento analítico, principalmente quando se trata de amostras sólidas, como de alimentos. Esta se caracteriza pela extração e enriquecimento dos analitos que geralmente se apresentam a níveis de traços e ultra-traços. Normalmente, problemas no preparo.

(27) 28. da amostra como o tempo e o consumo de reagente, perda de compostos e contaminação torna esta etapa mais sujeita a erros (WANG; DING; REN, 2016). Ela depende da eficiência do procedimento de extração, o que a torna uma etapa determinante neste processo. Um procedimento com poucos passos reduz as perdas dos analitos de interesse e fontes de contaminação, eliminando assim, erros e diminuindo o custo deste procedimento (BORGES; FIGUEIREDO; QUEIROZ, 2015). O processo de preparo da amostra é necessário, pois assim, favorece a extração destes analitos bem como a remoção dos interferentes da própria matriz (PRESTES et al., 2009; WALORCZYK; DROZDZYNSKI, 2012). Os cereais são considerados matrizes secas e que contêm grande quantidade de ácidos graxos que podem interferir na análise. Para obter bons resultados analíticos ao se trabalhar com este tipo de matriz alguns cuidados devem ser tomados. A adição de água para promover a hidratação da matriz, a proporção de solvente e amostra ideal, tempo de extração, a combinação e a quantidade de sorvente na etapa de limpeza dispersiva são algumas variáveis que afetam a eficiência do preparo de amostra (MASTOVSKA et al., 2010). Hoje, muitas técnicas de extração são utilizadas visando a extração de resíduos de agrotóxicos em matrizes como milho ou outras com amido e gordura. Dentre as diferentes técnicas, tem-se a Extração por Soxhlet (SOX), a Extração Líquido-Líquido (LLE), a Extração em Fase Sólida (SPE), a Microextração em Fase Sólida (SPME), a Dispersão da Matriz em Fase Sólida (MSPD), a Extração com Fluido Supercrítico, (SFE), a Extração Acelerada com Solvente (ASE) e a Extração Assistida por Micro-ondas (MAE), a Extração Líquida Pressurizada (PLE), Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME) e a Extração Sortiva com Barra Magnética (SBSE) (WU et al., 2011; GONZÁLEZ-CURBELO et al., 2012; CUNHA; FERNANDES, 2011). Segundo Cabrera et al., (2012) um método de preparo da amostra que demanda de extração automatizada, muitas vezes, exige um analista treinado e etapas de limpeza entre as extrações, o que torna a análise mais demorada. Sendo assim, estas técnicas apresentam desvantagens quando se trata de análises multirresíduo, pois são eficientes para um determinado escopo de analitos em determinadas condições (PRESTES; ADAIME; ZANELLA, 2011)..

(28) 29. A precipitação a baixa temperatura (PBT, do inglês low-temperature precipitation ou freezing out) foi aplicada em amostras de cereais, como o trigo por Walorczyk e Drozdzynski (2012) onde submeteu o extrato a -26 °C por 2 h em freezer, já Koesukwiwat et al. (2010) utilizou 2 h de freezer a uma temperatura de -20 °C e Wang et al. (2017) submeteu o extrato a uma temperatura de -24 °C por 20 min em freezer ou até um tempo de 12 h como foi adotado por Facco et al. (2015). Como se pode observar esta etapa tem como vantagem a fácil execução e pode ser utilizada para diferentes tipos de amostras. Em 2003, Anastassiades e colaboradores, propuseram o método de extração denominado QuEChERS (do inglês Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) que inicialmente foi proposto para extração de agrotóxicos em amostras vegetais e para frutas, e logo se expandiu para uma grande variedade de analitos e distintas matrizes (GONZÁLEZ-CURBELO et al., 2015). Segundo Borges; Figueiredo; Queiroz, (2015), esta técnica apresenta a vantagem de ser fácil, rápida, econômica, efetiva, robusta e segura e ainda explora a instrumentação analítica moderna. A Tabela 4 apresenta diferentes técnicas e métodos de preparo de amostra, que são utilizadas na etapa de extração e limpeza da matriz de cereais, principalmente o milho, para a análise em cromatografia líquida ou gasosa..

(29) 30. Tabela 4 - Técnicas de preparo de amostra e determinação de agrotóxicos em milho e outros cereais. MATRIZ. milho e feijão. milho e outros cereais. PREPARO. MÉTODO DE EXTRAÇÃO. LLE com DCM e secagem com 5 g amostra + 30 mL NaSO4 anidro acetona:metanol (1:1) e seguido de agita por 3 h a 200 rpm concentração e rotaevaporação 2 g amostra + 20 mL água + 5 mL DCM e ultrassom por 30 min seguido de centrifugação. Ultrassom. milho e outros. 10 g amostra + 5 mL água + 10 mL ACN e agita por 10 min. milho, palha e solo. 10 g amostra (solo e grão, 5 g para a palha) 1 g NaCl + 4 g + 5 mL água (10 mL MgSO4 para palha) + 10 mL ACN e agita por 5 min. 1 g NaCl + 4 g MgSO4. LIMPEZA. AGROTÓXICOS. 15 g da mistura de alumina + carvão ativado (12:1) em uma mini coluna de vidro são 37 agrotóxicos eluídos com diclorometano e concentrado até 2 mL 2 mL extrato percolados em cartucho Oasis HLB (60 mg) e o extrato eluído é diluído em água na mesma proporção (1:1) acrescido de 10 µL de uma solução tampão. glifosato. 1,5 mL de extrato + 50 mg C18 ou florisil + 150 mg de MgSO4 seguido de agitação e isofenfós-metil centrifugação 1,5 mL extrato + (30 mg C18 para solo; 30 mg PSA + 20 mg de C18 para grão; 20 mg de GCB + 50 mg Fipronil e de PSA para a palha) + 150 mg metabólitos MgSO4 seguido de agitação e centrifugação (1 min a 3600 rpm). TÉCNICA. REFERÊNCIA. GC-FPD. Akoto et al., (2013). LC–MS/MS. Botero-Coy et al., (2013). SFC-MS/MS. Chen et al., (2016). UPLCMS/MS. Cheng et al., (2014).

(30) 31. MATRIZ. milho e outros milho e outros milho. milho e cereais. milho. milho e trigo. PREPARO. 5 g amostra + 20 mL água 2,5 g amostra + 10 mL água + 10 mL ACN e agitação por 30 min. MÉTODO DE EXTRAÇÃO. QuPPe-Metódo MSPD (10 g amostra) 1 g NaCl + 4 g MgSO4. O sobrenadante é transferido para um 3 g amostra + 12 mL frasco e o resíduo ACN 90:10 v/v ACN– foi re-extraído tampão fosfato (pH = novamente e 7.5) e agita por 10 min concentrado em e seguido de evaporador a 35 °C centrifugação por 6 min e redissolvido com 2 mL de ACN 2 g amostra + 4 mL O tubo é submetido água + 8 mL ACN agita a SLE/LTP -20 °C por 1 min por 3 hs 5 g amostra + 10 mL 1 g NaCl + 4 g água + 10 mL ACN 5% MgSO4 agita por 2 áci. fórmico e agita por min e segue para 1 min ultrassom por 5 min. LIMPEZA. AGROTÓXICOS. 1 mL de extrato + 5 mg MWCNTs (5–10 nm) agita por 1 min e Cyanamide centrifuga por 1 min a 4000 rpm e após derivatização GPC e SPE com cartucho de 33 agrotóxicos florisil. TÉCNICA. LC-MS/MS. GC-MS. REFERÊNCIA. Cheng et al., (2018) Chung e Chen (2015) Cunha e Fernandes (2011). DLLME com 1 mL de extrato. 41 agrotóxicos. GC-MS. SPE com C18 e eluição com 10 mL de ACN ou 10 mL de ACN a 5% de ác. Fórmico e posteriormente evaporação e redissolução com 0,5 mL de ACN:água (20:80 v/v). 50 agrotóxicos. UPLCMS/MS. Dong et al., (2016). o extrato é filtrado em papel de filtro contendo 2 g de NaSO4. bifentrina e pirimifós metílico. GC-ECD. Freitas et al., (2014). GC-NPD. GonzálezCurbelo et al., (2017). 5 mL extrato + 31 mg C18 + 274 4 agrotóxicos mg GCB + 800 mg PSA + 750 mg organofosforaMgSO4 seguido de evaporação e dos redissolução.

(31) 32. MATRIZ. milho e cereais. milho e cereais. PREPARO. 5 g amostra + 5 mL água + 5 mL ACN e agita por 1 min 5 g amostra + 10 mL de H2O, agita e homogeneiza no tubo (30 min de interação parado) e após + 15 mL de ACN 1% ác. Acético ou 10 mL de ACN. milho e trigo. 2,5 g amostra + 10 mL água + 10 mL ACN e agitação por 1 h. milho. 1 g amostra. milho e cereais. MÉTODO DE EXTRAÇÃO. LIMPEZA. AGROTÓXICOS. TÉCNICA. REFERÊNCIA. 1 mL de extrato + 5 mg MWCNTs 3 g NaCl agita 1 min + 15 mg PSA + 15 mg C18 e centrifuga. 124 agrotóxicos GC-MS/MS. Han et al., (2016). 1 g NaCl + 4 g MgSO4 + 1 g C6H5Na3O7.2H2O + 0,5 g C6H6Na2O7.1,5H2O ou 6 g MgSO4 + 1,5 g AcNa. 6 mL extrato + 150 mg C18 + 150 mg PSA + 900 mg MgSO4 8 mL extrato + 400 mg C18 + 400 mg PSA + 1200 mg MgSO4 agita e centrifuga e após, seguido de evaporação e redissolução com 1,5 mL de acetato de etila. 200 agrotóxicos GC-MS/MS. He et al., (2015). 1 g NaCl + 4 g MgSO4. 5 mL extrato + 750 mg PSA + 250 mg C18 + 750 mg MgSO4 agita e 8 agrotóxicos centrigufa seguindo para SHLLE: H2O + NaCl. GC-FID. Jia et al., (2014). SPE. HPLC-UV. Li et al., (2017). UPLC-ESIMS/MS. Liang et al., (2016). Nanopartícula de ZnO e líquido iônico O sobrenadante é transferido para um 3 g amostra + 12 mL frasco e o resíduo ACN e agita por 11 min foi re-extraído novamente. 5 agrotóxicos. SPE com cartucho de C18 e o extrato é concentrado em Atrazina e rotaevaporador e redissolvido com metabólitos 0,5 mL de ACN:água (20:80 v/v).

(32) 33. MATRIZ. PREPARO. MÉTODO DE EXTRAÇÃO. LIMPEZA. milho e soja. 5 g amostra + 10 mL água + 10 mL ACN e agita por 1 min. 1 g NaCl + 4 g MgSO4 + 1 g C6H5Na3O7.2H2O + 0,5 g C6H6Na2O7.1,5H2O O sobrenadante foi submetido a 20 °C por 8 h. milho e outros cereais. 2,5 g amostra + 10 mL água + 10 mL ACN agita por 1 h. 1 g NaCl + 4 g MgSO4. 1 mL extrato + 50 mg C18 + 150 mg PSA + 150 mg MgSO4 3 mL sobrenadante + 150 mg de MgSO4 + 150 mg Z-Sep+ 2 mL extrato é evaporado em N2 e redissolvido em 500 µL água:metanol (80:20). AGROTÓXICOS. 6 mL extrato +C18 + PSA + MgSO4 seguido de agitação e centrifugação e após extração 10 agrotóxicos liquido-líquido: 5 mL sobrenadante + 15 mL H2O + 1,5 mL de isooctano. TÉCNICA. GC-MS. REFERÊNCIA. Marchis et al., (2012). UHPLCMastovska et 180 agrotóxicos MS/MS e al., (2010) GC-TOFMS). óleo de milho e outros. 3 g amostra + 7 mL água + 10 mL ACN e agita por 10 min. 1 g NaCl + 4 g MgSO4. milho e outros cereais. 10 g amostra + 10 g celite 545 foram extraídas com acetonitrila em estado estático por 3 min com 2 ciclos a 1500 psig a 80 °C. SPE Envi-18, Envi-Carb e SepExtração acelerada Pak NH2 em série (GC-MS/MS) GC-MS/MS e Pang et al., 405 agrotóxicos com solvente (ASE) Sep-Pak Alumina N e Envi-Carb e LC-MS/MS (2006) Sep-Pak NH2 (LC-MS/MS). 31 carbamatos. UHPLCMS/MS. MorenoGonzalez et al., (2014).

(33) 34. MATRIZ. milho. PREPARO. 5 g amostra +20 mL ACN e agita por 3 min em vórtex e agitação por mais 30 min seguindo para centrifugação a 5000 rpm/5 min. MÉTODO DE EXTRAÇÃO. O sobrenadante foi misturado com ACN:Hexano (1:1) seguido para evaporação e redissolução em 1 mL de ACN. LIMPEZA. Coluna MISPE e o eluato foi evaporado e redissolvido em fase 3 herbicidas móvel. milho e outros cereais. 10 g amostra + 5 mL 2 g NaCl + 3 g água e add 10 mL de 1, 5 mL extrato + 50 mg C18 + MgSO4 agita por 3 ACN a 1% ác. Fórmico 150 mg MgSO4 agita por 3 min e min e centrifuga por e agita por 3 min centrifuga por 5 min 5 min. milho e outros. 10 g amostra + 5 mL água + 10 mL ACN e agitação por 10 min. 1 g NaCl + 4 g MgSO4. milho e outros. 5 g amostra + 10 mL água + 15 mL ACN e agita por 5 min. Q. citrato. milho e solo. 5 g amostra + 2 mL água + 10 mL ACN agita por 2 min e ultrassom por 20 min. 1 g NaCl + 1 g MgSO4. AGROTÓXICOS. 4 herbicidas. 20 mg PSA+ 30 mg C18 + 150 mg penflufen e MgSO4 metabólito 7,5 mL extrato + 500 mg C18 + 125 mg PSA + 750 mg MgSO4 seguido de evaporação de 3 mL de sobrenadante e redissolução com 1,5 mL de tolueno 6 mL de sobrenadante é concentrado e reconstituído em 3 mL de éter de petróleo para SPE com cartucho de florisil. TÉCNICA. REFERÊNCIA. LC-MS/MS. She et al., (2010). UHPLCMS/MS. Tao et al., (2014). UHPLC– MS/MS. Tian et al., (2016). 122 agrotóxicos GC-MS/MS. Walorczyk (2007). fipronil e metabólitos. Wang, Hu e Liu (2014). GC–ECD.

(34) 35. MATRIZ. milho e outros cereais. milho e trigo. PREPARO. MÉTODO DE EXTRAÇÃO. 1 g amostra + 10 mL de ACN é agitada por 10 min seguida de centrifugação por 5 min. O sobrenadante é h-MIMs evaporado e redissolvido em 1 mL de ACN 2,5 g amostra + 5 mL água + 20 mL ACN e agita por 30 min. 1 g NaCl + 4 g MgSO4. LIMPEZA. AGROTÓXICOS. TÉCNICA. REFERÊNCIA. Uma coluna de SPEcom 125 mg de h-MIMs O extrato é diluido em 6 triazinas 6 mL de água é eluído com 1,5 mL de ACN com 5% de ác. acético. LC-MS/MS. Zhao et al., (2015). 16 mL de extrato foram evaporados e reconstituídos em 2 mL de hexano seguindo para SPE-DLLME. GC-MS. Zhu et al., (2016). 8 piretróides.

(35) 36. 2.5.1. Preparo de amostra utilizando QuEChERS O QuEChERS se caracterizou por ser um método multirresíduo fácil e rápido de ser executado, pois após a homogeneização da amostra envolve uma etapa de extração com solvente seguida de partição com sais e uma etapa de extração sólida dispersiva (d-SPE, do inglês Dispersive Solid Phase Extraction), que promove a remoção de possíveis interferentes presentes na matriz possibilitando assim a determinação de resíduos de agrotóxicos em frutas e vegetais. Como solvente extrator utilizou-se a acetonitrila, pois abrange uma faixa maior de polaridade quando comparada com acetato de etila e acetona, além de extrair menos compostos lipofílicos, gordura e pigmentos (GONZÁLEZ-CURBELO et al; 2015; BORGES; FIGUEIREDO; QUEIROZ, 2015). Outra vantagem é que o uso da acetonitrila juntamente com os sais favorece a extração permitindo a separação da fase orgânica e aquosa, tornando-a rápida, de baixo custo e permite se necessário a diluição do extrato final (PRESTES; ADAIME; ZANELLA, 2011). Originalmente este método era composto por uma etapa de extração de mesma proporção de amostra:solvente, sulfato de magnésio, que foi utilizado em todas as versões deste método, e cloreto de sódio na etapa de partição. A partir deste método outras versões foram desenvolvidas (ANASTASSIADES et al., 2003). O QuEChERS acetato desenvolvido por Lehotay et al. (2005) utilizou uma quantidade um pouco maior de amostra:solvente que o QuEChERS original, o solvente extrator foi acidificado com ácido acético e o cloreto de sódio foi substituído pelo acetato de sódio para a formação de um tampão. Anastassiades et al., (2007) com o QuEChERS citrato realizou a etapa de partição com cloreto de sódio, citrato de sódio di-hidratado e hidrogenocitrato sesqui-hidratado. Na etapa dispersiva todos utilizaram sulfato de magnésio e PSA. Atualmente, as duas últimas versões são utilizadas como métodos oficiais para a determinação multirresíduos de agrotóxicos em alimentos (BORGES; FIGUEIREDO; QUEIROZ, 2015; GONZÁLEZ-CURBELO et al., 2015, PRESTES; ADAIME; ZANELLA, 2011). O uso de sais na etapa de partição como o sulfato de magnésio se deve pela separação mais completa da fase líquida-líquida e ainda aumenta a eficiência de extração de agrotóxicos não polares devido a reação exotérmica produzida durante sua ação. Já o cloreto de sódio apresenta a vantagem de.

(36) 37. melhorar a separação das fases quando introduzido junto ao sulfato de magnésio e, além disso, reduzir a quantidade de componentes co-extraídos da matriz (GONZÁLEZ-CURBELO et al; 2015). A etapa de extração em fase sólida dispersiva, também conhecida como a etapa de limpeza, consiste em adicionar uma quantidade de extrato em contato com uma mistura de sorventes com o uso de saís secantes (ANASTASSIADES et al., 2003). A escolha do sorvente ideal é avaliada através da remoção de interferentes co-extraídos da matriz no extrato em acetonitrila. Neste sentido, a limpeza do extrato é muito importante na etapa de d-SPE (GONZÁLEZCURBELO et al., 2015). Hoje os sorventes mais conhecidos e utilizados com a finalidade de limpeza de extratos de cereais são o florisil, a alumina, GCB, C18 e PSA. Mas os mais utilizados são o C18 e o PSA devido às características que possuem (BORGES; FIGUEIREDO; QUEIROZ, 2015). A alumina ou óxido de alumínio (Al2O3), dependendo do preparo deste sorvente, pode apresentar característica alcalina, ácida ou neutra, e normalmente é empregada na separação cromatográfica de compostos lipofílicos. Já para compostos de baixa polaridade emprega-se o florisil (BORGES; FIGUEIREDO; QUEIROZ, 2015). O GCB ou carbono grafitizado (do inglês Graphitized Carbon Black) é um sorvente muito eficiente na remoção de pigmentos como a clorofila e carotenóides, porém apresenta afinidade por compostos polares o que dificulta a recuperação destes, como é o caso de alguns agrotóxicos (GONZÁLEZCURBELO et al., 2015). O GCB remove pigmentos assim como o PSA e coextrativos apolares como o C18 (BORGES; FIGUEIREDO; QUEIROZ, 2015). O PSA ou N-propiletilenodiamine é um sorvente que tem como característica não reter os agrotóxicos, mas sim remover interferentes polares como é o caso de ácidos graxos, açúcares, ácidos orgânicos e pigmentos (GONZÁLEZ-CURBELO et al; 2015). Por ter a capacidade de ligar-se a compostos que contém grupos carboxílicos ácidos torna este sorvente muito importante na remoção de ácidos graxos em extratos de cereais mesmo que possa interagir com agrotóxicos ácidos (HERRMANN; POULSEN, 2015)..

(37) 38. O octadecilsilano ou C18 é um sorvente eficiente na remoção de lipídios apolares. Porém, tanto o PSA como C18 podem reduzir a quantidade de coextrativos em matrizes de cereais (HERRMANN; POULSEN, 2015). O C18 também é utilizado para limpeza em matrizes que contêm gordura (LEHOTAY et al., 2005a). O sorvente Z-Sep é um sorvente desenvolvido recentemente pela Sigma Aldrich a partir de uma mistura de C18 e sílica revestida com dióxido de zircônio, na proporção 2/5 de ZrO2/C18. O Z-Sep é aplicado para interferentes não polares como é o caso de lipídios (REJCZAK; TUZIMSKI, 2017). Normalmente utilizado em análises de agrotóxicos em amostras com grande quantidade de óleo (LOZANO et al., 2014). Sua utilização pode é evidenciada por Moreno-González et al., (2014) que utilizou este sorvente para a determinação de carbamatos em óleos vegetais. Já Lozano et al., (2014) avaliou a eficiência deste sorvente em amostras de abacate e amêndoas. Um novo material para limpeza de extrato denominado Bond Elut EMRLipid foi recentemente desenvolvido pela Agilent. O EMR-Lipid é um produto utilizado no preparo de amostras com alto teor de gordura para a remoção de lipídios. Normalmente utilizado no tratamento de extratos obtidos pelo método QuEChERS e/ou precipitação de proteínas (ZHAO, 2016). Bond Elut EMR-Lipid consiste em 1 grama de EMR-Lipid em um tubo de polipropileno de 15 mL e o Polish que é 2 g da mistura de MgSO4/NaCl na proporção 4:1 (m/m) em outro tubo de polipropileno de 15 mL (HAN et al., 2016). Inicialmente, o material (EMRLipid) é ativado com água e sua eficiência na remoção de lipídios ocorre através das interações hidrofóbicas e exclusão por tamanho. Sendo assim, os lipídios são retidos pelas partículas devido a grande cadeia de hidrocarbonetos e os demais analitos. não. interagem. devido. ao. tamanho. da. partícula. (AGILENT. TECHNOLOGIES, 2015). Em um método multirresíduo, com amplo escopo analítico, é muito difícil obter um extrato livre de interferentes sem reduzir a recuperação de alguns compostos. Porém, a combinação de diferentes sorventes na etapa de limpeza dispersiva torna a remoção de interferentes possível sem que seja necessário reduzir o escopo analítico (LEHOTAY et al., 2010). O método QuEChERS tem como característica a extração de diferentes resíduos e contaminantes como é o.

(38) 39. caso, de agrotóxicos, micotoxinas e medicamentos veterinários (PRESTES; ADAIME; ZANELLA, 2011).. 2.6 Métodos de determinação de agrotóxicos em cereais e derivados De. acordo. com. Frenich;. Romero-Gonzalez;. Aguilera-Luiz. (2014),. atualmente busca-se controlar ou monitorar resíduos e contaminantes através de métodos multi-classes ou multirresíduo, com o uso da Cromatografia Líquida e Gasosa ambas acopladas à Espectrometria de Massas. O acoplamento das técnicas possibilita determinar e quantificar níveis de concentração muito baixos e uma grande quantidade de compostos sem equívocos. Porém, a técnica a ser utilizada deve levar em consideração as características do analito a ser analisado como estabilidade térmica, polaridade e volatilidade (MASIÁ; BLASCO; PICÓ, 2014). Boa parte dos agrotóxicos utilizados nos dias de hoje possuem características de serem termolábeis ou não serem facilmente vaporizados e ainda apresentam alta polaridade. Por ser uma técnica que abrange um número muito grande de compostos, a cromatografia líquida apresenta-se como preferida ou utilizada atualmente (MASIÁ; BLASCO; PICÓ, 2014). A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas demonstrou ser uma técnica robusta, versátil e sensível. Atualmente o grande número de publicações ressalta a sua importância na determinação de compostos não voláteis e/ou instáveis termicamente. As fontes de ionização mais utilizadas são a ionização química (APCI) empregada na análise de moléculas mais voláteis e menos polares e a ionização por eletronebulização (ESI, do inglês electrospray) que é empregada na análise de moléculas de massa molecular maiores e mais polares (LANÇAS, 2009a). Conforme a SANTE (2015) (do francês, Santé et protection des consommateurs), o milho é classificado como um cereal com grande quantidade de amido, que contém proteínas, gordura e pouca água. Analisar matrizes como cereais e leguminosas não é fácil, pois são matrizes muito complexas e possuem composição bastante característica (HE et al., 2015). Sendo assim, uma alta seletividade se faz necessária para a identificação de resíduos de agrotóxicos e para isso, se faz uso da Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de.

(39) 40. Massas (LC-MS/MS, do inglês Liquid Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry) (MORENO-GONZÁLEZ et al., 2014).. 2.6.1. Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em série (LC-MS∕MS) Na cromatografia líquida (LC – liquid chromatography), a amostra é introduzida e separada na coluna cromatográfica, através da eluição com fase móvel, e submetida a ionização e posterior determinação em espectrômetro de massas (STACHNIUK; FORNAL, 2016). Em cromatografia líquida as fontes de ionização geralmente mais empregadas são a ionização química a pressão atmosférica (APCI, do inglês Atmospheric pressure chemical ionization) e a ionização por eletronebulização (ESI, do inglês Electrospray ionization) (ALDER et al., 2006). Na ESI, a ionização é diretamente na solução, o que permite que os compostos sensíveis à temperatura sejam ionizados sem sofrer degradação. Sendo assim, é aplicada a compostos ionizáveis em solução e compostos altamente polares que podem ser facilmente ionizados (CHIARADIA; COLLINS; JARDIM, 2008). Na eletronebulização, a fase móvel contendo o analito de interesse dissolvido na mesma passa através de um capilar, à pressão atmosférica, mantido sob alta voltagem e forma pequenas gotas altamente carregadas ("spray") que são dessolvatadas. A dessolvatação ocorre através de um fluxo contínuo de gás seco, na região do "spray", onde o tamanho das gotas é reduzido até que ocorra a "explosão coulômbica”. Inúmeras explosões ocorrem até que são produzidos íons do analito e estes são direcionados para o interior do espectrômetro de massa por uma série de dispositivos de focalização (CHIARADIA; COLLINS; JARDIM, 2008). De acordo com Collins; Braga; Bonato (2006) o espectrômetro de massas é um instrumento constituído pela fonte de ionização, analisador de massas e detector. Após a injeção da amostra formam-se íons que são analisados de acordo com sua razão massa/carga (m/z) e a detecção é feita pela intensidade do feixe de elétrons. O acoplamento da cromatografia líquida com a espectrometria de massas tem como vantagem ser universal e altamente seletivo, ao operar no.

(40) 41. modo de monitoramento de reações selecionadas, permitindo a quantificação de picos sobrepostos, com alta detectabilidade, avaliação da pureza do pico e a confirmação da presença do analito. O analisador de massas triplo quadrupolo (TQ ou QqQ), utilizado neste trabalho, é um instrumento composto por três quadrupolos em série, onde o segundo quadrupolo não é utilizado para separar íons de mesma razão m/z, mas sim como cela de colisão, na qual ocorre a fragmentação dos íons selecionados no primeiro quadrupolo (Q1) geralmente por dissociação induzida por colisão (DIC do inglês Collision-induced dissociation) com um gás inerte (geralmente Ar, He ou N2), direcionando os íons produzidos ao terceiro quadrupolo (Q3), onde os fragmentos são selecionados e enviados ao detector (CHIARADIA; COLLINS; JARDIM, 2008), como pode ser observado na Figura 6: Figura 6 - Esquema de um analisador do tipo triplo quadrupolo.. Fonte: Adaptado de ALDA; KUSTER; BARCELÓ (2006).. De acordo com Chiaradia; Collins; Jardim (2008), “os triplos quadrupolos permitem a obtenção de menores limites de detecção, de forma que podem ser mais adequados em casos de compostos com menores LMRs”. O acoplamento da cromatografia líquida com o espectrômetro de massas em série permite uma alta seletividade, eficiência na separação, informação estrutural, massa molar e aumentar a detectabilidade em uma única ferramenta de análise (OSHITA e JARDIM, 2015)..