Estudo da função renal e da senescência e regeneração de podócitos durante o envelhecimento de animais submetidos à restrição protéica gestacional

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

ANA TEREZA BARUFI FRANCO

ESTUDO DA FUNÇÃO RENAL E DA SENESCÊNCIA E REGENERAÇÃO DE PODÓCITOS DURANTE O ENVELHECIMENTO DE ANIMAIS SUBMETIDOS À

RESTRIÇÃO PROTEICA GESTACIONAL

CAMPINAS 2019

ANA TEREZA BARUFI FRANCO

ESTUDO DA FUNÇÃO RENAL E DA SENESCÊNCIA E REGENERAÇÃO DE PODÓCITOS DURANTE O ENVELHECIMENTO DE ANIMAIS SUBMETIDOS À

RESTRIÇÃO PROTÉICA GESTACIONAL.

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências.

ORIENTADORA: PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER

ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA

ALUNA ANA TEREZA BARUFI FRANCO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER.

CAMPINAS 2019

COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO

ORIENTADORA:PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER

MEMBROS:

1. PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER

2. PROFA. DRA. PATRICIA SIMONE LEITE VILAMAIOR

3. PROFA. DRA. HELOISA BALAN ASSALIN

4. PROF. DR. JOSÉ RIBAMAR DOS SANTOS FERREIRA JUNIOR

5. PROFA. DRA. CARLA BEATRIZ COLLARES BUZATO

Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM

Dedicatória

Dedico este trabalho, com muito amor, aos meus pais Walter e Teresinha, que foram os primeiros a me

ensinar sobre valores, educação e fé e não mediram esforços desde o princípio para me proporcionar o melhor

estudo e a realização dos meus sonhos. Obrigada por todas as palavras, orações, apoio e carinho a mim

direcionados em diversos momentos dessa árdua trajetória,

Agradecimentos

A Deus, pelo dom da Vida, por todo cuidado comigo, por me sustentar durante todo esse percurso muitas vezes com obstáculos que, sem dúvidas, me ajudaram a amadurecer como ser humano e por me cobrir a cada instante com saúde e bênçãos.

Às minhas irmãs, Carolina e Ana Olivia e aos meus sobrinhos Maria Eduarda, Antonio e Maria Clara. Vocês fizeram e fazem a diferença em minha vida: a cada novo desafio, um sorriso e um abraço representam meu maior refúgio.

Ao meu esposo Eduardo, por todo amor, companheirismo e parceria durante os momentos mais difíceis. Você foi meu grande incentivador. Obrigada por nunca ter desistido de mim, quando eu mesma já havia desistido. Obrigada por ser minha alegria e por tornar meus dias mais leves.

A minha orientadora, Dra Patricia, por acreditar em meu potencial, por confiar na minha capacidade e por abrir horizontes para minha vida profissional. Obrigada por lutar ao meu lado para que pudéssemos realizar os experimentos e pela dedicação em unir e compreender todos os resultados finais. Ao meu coorientador, Dr Gontijo, pela paciência na explicação de cada conceito e pelas inúmeras conversas esclarecedoras dignas de verdadeiras aulas.

Aos colegas de laboratório que fizeram parte dessa jornada: Gabriela, Marina, Ana Rita, Vinícius, Marcela, Gustavo, Julia, Gabriel e tantos outros que passaram pela equipe durante esses anos, obrigada pelo apoio de cada um de vocês. De modo especial, agradeço à Ize, Daniel e Augusto, que dividiram toda essa empreitada junto comigo. Obrigada pelos desabafos, abraços, incentivos e opiniões valiosas que tornaram mais leves os dias cinzas, sem o apoio de vocês tudo seria mais difícil. À minha amiga Noemi, obrigada pelas inúmeras vezes que precisei de ajuda com os experimentos e você sempre esteve disposta, mesmo nos horários e dias mais inconvenientes. Obrigada pelas infinitas caronas, almoços e longas horas de conversa, você me ensinou, com suas atitudes, a ser uma pessoa e uma profissional muito melhor, só tenho a agradecer a Deus por colocar você em meu caminho.

Aos funcionários D. Maria, Sr Zé, Sr Marino, Cris, William e todos os demais funcionários do NMCE, equipe de limpeza, bioteristas, técnicos e alunos. Agradeço também de modo especial à secretária da Fisiopatologia Regina, que durante os últimos meses sempre esteve disposta a me ajudar.

Ao Dr Sergio Brunetto e ao prof Dr Celso Dario Ramos, pelas análises referentes ao microPET. A contribuição de vocês foi de tamanha valia que, sem a qual, eu não seria capaz de realizar esse experimento. Aos demais funcionários da Medicina Nuclear que muito me auxiliaram no manejo dos radiofármacos e do equipamento durante longos períodos.

Aos animais, que deram suas vidas para realização desse trabalho.

Agradeço também à UNICAMP, pela oportunidade de estar em uma universidade altamente estruturada e à Faculdade de Ciências Médicas e ao programa de Fisiopatologia Médica, pela excelência do corpo docente na execução de cada atividade no eixo do ensino e pesquisa.

A CAPES, pela concessão da bolsa de estudos, sem a qual seria inviável a realização desse trabalho. Ao CNPq e FAPESP pelos demais auxílios.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.

"E, no sexto mês, foi o anjo Gabriel enviado por Deus a uma cidade da Galiléia, chamada Nazaré, A uma virgem desposada com um homem, cujo nome era José, da casa de Davi; e o nome da virgem era Maria. E, entrando o anjo aonde ela estava, disse: Salve, agraciada; o Senhor é contigo; bendita és tu entre as mulheres. E, vendo-o ela, turbou-se muito com aquelas palavras, e considerava que saudação seria esta. Disse-lhe, então, o anjo: Maria, não temas, porque achaste graça diante de Deus. E eis que em teu ventre conceberás e darás à luz um filho, e pôr-lhe-ás o nome de Jesus. Este será grande, e será chamado filho do Altíssimo; e o Senhor Deus lhe dará o trono de Davi, seu pai; E reinará eternamente na casa de Jacó, e o seu reino não terá fim. E disse Maria ao anjo: Como se fará isto, visto que não conheço homem algum? E, respondendo o anjo, disse-lhe: Descerá sobre ti o Espírito Santo, e a virtude do Altíssimo te cobrirá com a sua sombra; por isso também o Santo, que de ti há de nascer, será chamado Filho de Deus. E eis que também Isabel, tua prima, concebeu um filho em sua velhice; e é este o sexto mês para aquela que era chamada estéril; Porque para Deus nada é impossível. Disse então Maria: Eis aqui a serva do Senhor; cumpra-se em mim segundo a tua palavra. E o anjo ausentou-se dela."

Lucas 1:26-38

“A persistência é o caminho do êxito” Charles Chaplin

RESUMO

Tanto a desnutrição protéico-calórica quanto a hipertensão arterial e a doença renal crônica representam problemas de saúde pública mundial. Evidências epidemiológicas em diversas populações, bem como resultados experimentais, indicam que as condições nutricionais sugeridas no ambiente intra-útero “programam” o desenvolvimento de hipertensão arterial e doenças cardiorrenais no adulto. Indicam ainda que a privação proteica durante o período gestacional causa redução no número de nefros, que está diretamente envolvido na predisposição à hipertensão. Assim podemos supor que na prole submetida à restrição proteica gestacional ocorra a perda antecipada de função renal, que é uma característica do processo de envelhecimento, associada à sobrecarga hemodinâmica imposta aos nefros remanescentes com consequências na redução da sobrevida. Desta forma, o objetivo desta Tese de Doutorado foi avaliar o impacto do envelhecimento na prole de ratos machos submetidos à restrição proteica intra-útero, e determinar como o número reduzido de nefros, em paralelo ao desenvolvimento da hipertensão arterial, implica na senescência glomerular, disfunção renal e longevidade.

Para isso, avaliou-se em animais com 48 e 62 semanas de vida, submetidos ou não à restrição proteica gestacional, parâmetros como a pressão arterial (32ª-62ª semana de vida), a função renal, avaliada através do clearance de creatinina, DMSA e DTPA, proteinúria e fração de excreção de sódio e potássio, e a marcação proteica de marcadores de alterações renais. A prole LP apresentou elevação da pressão arterial a partir da 32ª semana de vida que perdurou até a 62ª. Observamos redução da função de filtração glomerular, proteinúria e aumento do índice de adiposidade no grupo LP. Além disso, observamos alterações na marcação de proteínas relacionadas à lesão podocitária, possivelmente causada pelo aumento da pressão intraglomerular, assim como aumento do turnover celular, transição mesenquimal-epitelial e proliferação celular. Esses fenômenos sugerem mecanismos compensatórios e protetores renais contra o hiperfluxo glomerular e a hiperfiltração, induzidas pela redução progressiva das unidades de nefros nesse modelo de restrição proteica, como tentativa de restauração de podócitos danificados, retardando a evolução da insuficiência renal crônica. No entanto, a tentativa parece não ser suficiente já que houve perda significativa da função glomerular na 62 ª semana e redução significativa no tempo de vida dos animais LP.

ABSTRACT

Protein-caloric restriction, arterial hypertension and chronic kidney disease represent global public health problems. Epidemiological evidence, as well as experimental results, indicates that intrauterine nutritional conditions "program" the development of hypertension and cardiovascular disease in adults. They also suggest that gestational protein restriction causes a reduction in nephros number, which is involved in predisposition to hypertension. Thus, we can hypothesize that gestational protein restriction offspring accelerates renal dysfunctions, characteristics of aging, due to the hemodynamic overload imposed on the remaining nephros, resulting in reduction the survival percentage in these animals. The objective of PhD. Thesis was to evaluate the impact of aging on male rats, submitted to intrauterine protein restriction and to determine how the reduced nephros number in parallel to the development of arterial hypertension affect glomerular senescence, renal dysfunction and longevity.

The present thesis evaluated blood pressure (32nd-62nd weeks of life), renal function, by assessing creatinine clearance, fraction of sodium and potassium excretion and clearance of DTPA and DMSA and protein expression of markers of renal corpuscle in animals 48 and 62 weeks of age. LP offspring presented elevation of blood pressure from the 32nd week of life that lasted until the 62nd. We observed reduction of the glomerular filtration function, proteinuria and increase of the adiposity index in the LP group as compared to control group. In addition, we observed changes in the expression of markers related to podocyte injury, possibly caused by increased intraglomerular pressure, that can lead to podocyte simplification, as well as increased cell turnover, epithelial mesenchymal transition and cell proliferation. These phenomena suggest compensatory and renal protective mechanisms against glomerular hyperflow and hyperfiltration, induced by the progressive reduction of nephron number under protein restriction diet model. This compensarotry changes are an attempt to restore damaged podocytes, delaying the evolution of chronic renal failure. However, this mechanism was not enough since there was significant reduction in survival in the LP group.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Repercussões da programação fetal...23

Figura 2. Complicações renais por programação fetal e suas consequências...24

Figura 3. Estruturas do corpúsculo renal...29

Figura 4. Simplificação de podócitos...31

Figura 5. Catástrofe Mitótica do podócito...33

Figura 6. Desenho experimental...43

Figura 7. Peso corporal gestacional, ao nascer e ao longo das semanas de vida da prole...49

Figura 8. Índice de adiposidade da prole...50

Figura 9. Massa renal...51

Figura 10. Pressão arterial sistólica de 32 a 62 semanas de idade...52

Figura 11. Avaliação da função glomerular...53

Figura 12. Avaliação do clearance de DTPA...54

Figura 13. Avaliação da função tubular...55

Figura 14. Avaliação do clearance de DMSA...55

Figura 15. Imunomarcação para desmina...56

Figura 16. Imunomarcação para vimentina...57

Figura 17. Imunomarcação para Ki-67...58

Figura 18. Imunomarcação para Zeb2...59

Figura 19. Imunomarcação para nestina...60

Figura 20. Imunomarcação para WT1...61

Figura 21. Imunomarcação para TGFβ...62

Figura 22. Deposição de fibras colágenas na região cortical e na região medular...63

Figura 23. Deposição de fibras colágenas no tufo glomerular...64

Figura 24. Perfil de expressão das proteínas marcadas no tufo glomerular e no epitélio parietal...65

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição das dietas NP e LP...39 Tabela 2. Anticorpos primários e diluições utilizadas...45 Tabela 3. Valores pressóricos, nas diferentes semanas avaliadas...52

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

IGFI Fator de crescimento semelhante à

insulina tipo 1

IGFII Fator de crescimento semelhante à

insulina tipo 2

LP Low protein

NP Normal protein

FAS Ácido graxo sintase

G3PDH Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

ACC Acetil CoA- carboxilase

SCD Estearoil-CoA desaturase

11β-HSD2 11β-hidroxiesteroide desidrogenase

tipo-2

ACTH Hormônio Adrenocorticotrófico

HPA Eixo hipotálamo-pituitária-adrenal

TNFα Fator de necrose tumoral alfa

IL-1 Interleucina 1

IL-6 Interleucina 6

AT1R Receptores tipo 1 de Angiotensina II

AT2R Receptores tipo 2 de Angiotensina II

TFG Taxa de Filtração Glomerular

SHR Ratos espontaneamente hipertensos

WKY

DRC

Ratos Wistar Kyoto

NKF-KDOQ National Kidney Foundation's - Kidney Disease Outcomes Quality Initiative

NaCl Cloreto de sódio

EMT Transição epitélio-mesênquima

CLi Clearance de Lítio

CNa Clearance de Sódio

FENa Fração de excreção de Sódio

FEPNa Fração de excreção proximal de Sódio

FEPPNa Fração de excreção pós-proximal de

Sódio CCr Clearance de Lítio Na+ Sódio Li+ Lítio K+ Potássio Nm Nanômetros

CoRL Células da linhagem de renina

PECs Células parietais epiteliais

99m

Tc Tecnécio-99-metaestável

DMSA Ácido dimercaptossuccínico

SUMÁRIO

1. Introdução...16

1.1. Histórico epidemiológico da programação fetal...16

1.2. Modelos experimentais de programação fetal...19

1.3. Mecanismos envolvidos na programação fetal ...21

1.4. Repercussões da Programação Fetal...22

1.5. Doença Renal Crônica e envelhecimento...26

1.6. Corpúsculos renais...27 2. Hipótese de trabalho...35 3. Objetivos...36 3.1. Objetivo principal...36 3.2. Objetivos específicos...36 4. Materiais e Métodos...37 4.1. Desenho experimental...37 4.2. Acasalamento...37 4.3. Grupos experimentais...38 4.4. Parâmetros avaliados...39

4.5. Aferição da Pressão Arterial Caudal (PAC)...40

4.6. Estudo da função renal...40

4.7. Análises Bioquímicas...41 4.8. Análise MicroPET/SPECT/CT………...42 4.9. Coleta de material...42 4.10. Índice de adiposidade...44 4.11. Processamento histológico...44 4.12. Imunoperoxidase...44 4.13. Picrosirius red...45 4.14. Análise de Sobrevida...46

5. Análise estatística dos resultados...47

6.1. Perfil ponderal das mães e da prole nos diferentes grupos...48

6.2. Índice de adiposidade...50

6.3. Peso renal...51

6.4. Pressão arterial sistólica...52

6.5. Função renal: Clearance de creatinina (ClCr), Proteinúria, MicroPet/Spect/CT...52

6.6. Imunomarcação nos corpúsculos renais...56

6.7. Curva de sobrevida...67

7. Discussão...68

8. Conclusão...71

9. Referências...77

1. Introdução

1.1. Histórico epidemiológico da programação fetal

Desde a década de 60, se pressupunha que a restrição ao crescimento intrauterino e o consequente baixo peso ao nascer, resultasse em alterações permanentes em tecidos e órgãos como rim, coração e cérebro, promovendo alterações funcionais ao longo da vida1.

Em 1964, Geoffrey Rose2, ao estudar a prevalência de doenças familiares no Johns Hopkins Hospital em Baltimore, dentre aqueles pacientes admitidos com infarto agudo do miocárdio constatou que esta foi maior naqueles que possuíam irmãos natimortos ou mortos ainda na tenra infância. Essa associação foi três vezes maior entre os homens quando comparados às mulheres e, foi sugerido naquela época que tal associação estava relacionada à redução da atividade física, a condições ambientais adversas bem como a alterações dietéticas, ocorridas na infância.

Posteriormente em 1977, Forsdahl3 ao estudar os índices de mortalidade na Noruega, encontrou uma estreita associação entre a incidência de doenças vasculares ateroscleróticas e condições de pobreza na infância e na adolescência. Em 1979, Williams e colaboradores4 corroboraram os achados obtidos na Noruega ao constatarem que a transição da pobreza no início da vida para a prosperidade na meia-idade era determinante causal do aumento nas taxas de mortalidade por doenças cardiovasculares no País de Gales e na Inglaterra.

Em 1986, Barker e Osmond indicaram que taxas elevadas de mortalidade neonatal (0-28 dias incompletos) e pós-natal (após 28 dias de vida) poderiam estar associadas a fatores nutricionais maternos ocorridos durante o período gestacional. Observaram também que ocorrências de cardiomiopatia isquêmica na idade adulta estariam relacionadas com alterações funcionais determinadas pela subnutrição gestacional. Esses dados sugerem que tais alterações durante o período de desenvolvimento podem promover o aparecimento de doenças em longo prazo, como por exemplo, a maior probabilidade de alterações cardíacas na idade adulta5.

Estudos neste mesmo período demonstraram que o peso ao nascer bem como o crescimento pós-natal estão implicados às doenças cardíacas isquêmicas na idade adulta seguidas de morte6. Além disso, a associação entre baixo peso ao nascer e doenças coronarianas é variável independente dos hábitos de vida dos indivíduos 6,7. Em 1993, estudo epidemiológico realizado em Hertfordshire, Inglaterra, envolvendo uma coorte de homens e mulheres de aproximadamente 16.000 indivíduos nascidos entre 1911 e 1930, comparou a associação entre a restrição do crescimento intrauterino, o crescimento no primeiro ano de vida e a ocorrência de morte por doenças cardiovasculares 8. O estudo demonstrou que a taxa de mortalidade em decorrência de alterações coronarianas foi duas vezes maiores em indivíduos com baixo peso quando comparados àqueles com peso normal ao nascer. Entre as mulheres, as maiores taxas de mortalidade incluíram aquelas que apresentaram baixo peso ao nascer associado a níveis ponderais acima da média a partir do segundo ano de vida. Essa associação excluía fatores tais como diferentes classes sociais, tabagismo, consumo de álcool e obesidade 8. Adicionalmente, as taxas de mortalidade em decorrência de alterações cardiovasculares não se relacionaram com modificações ponderais no primeiro ano em pacientes do sexo feminino, o que ocorreu nos homens quando as taxas de mortalidade reduziram significativamente com o aumento do peso, apoiando a hipótese de que doenças cardiovasculares se relacionam à restrição do crescimento e desenvolvimento uterino. Estes resultados sugeriram que o baixo peso estava associado com doenças cardiovasculares em homens e mulheres, porém, o baixo peso durante o primeiro ano de vida e doenças cardiovasculares subsequentes apresentou-se fortemente associados somente na coorte masculina8.

Esses estudos fundamentaram a “Hipótese de Barker”, mostrando a importância do ambiente gestacional como determinante do processo saúde-doença da prole. Assim, a desnutrição materna promove a restrição no crescimento fetal, evidenciado através do baixo peso ao nascimento, sendo um fator contribuinte para as condições de saúde da prole, em longo prazo.

A “Hipótese de Barker” deu sustentação ao conceito de “Origem Fetal das Doenças”, descrita em 1991 por Alan Lucas9

, através da definição de programação fetal como estímulos ou insultos em períodos críticos do desenvolvimento gestacional capazes de desencadear alterações permanentes no organismodo feto.

Posteriormente, diversos estudos epidemiológicos em diferentes populações corroboraram a “Hipótese de Barker”. Em 1993, em Sheffield, Inglaterra, Barker e colaboradores10 buscaram avaliar o quanto as mortes por doenças cardiovasculares estariam relacionadas com restrição no crescimento fetal. Para isso, avaliaram 1500 homens nascidos entre 1907 e 1924 no Jessop Hospital, confirmando que o menor crescimento fetal estava relacionado com maior incidência de morte por doenças cardiovasculares na idade adulta. Diante de mais estes achados, os autores mostraram que alterações cardiovasculares podem ser consequência de “programação” durante a vida fetal e os primeiros anos de vida, determinadas por alterações no metabolismo, na fisiologia e morfologia, possivelmente associadas a aspectos nutricionais maternos.

Estas observações recorrentes foram confirmadas na Suécia em estudo envolvendo 1300 homens, que mostrou a associação recíproca entre baixo peso ao nascer e mortalidade cardiovasculares, em homens entre 50 a 75 anos de vida 11,12. Adicionalmente, estudo de coorte de gestantes expostas à Fome Holandesa, com gestações ocorridas entre 1944 e 1945, permitiu estudos acerca dos efeitos da restrição da ingestão nutricional materna. Dentre estes, indivíduos que sofreram a restrição nutricional intrauterina apresentaram maiores índices de obesidade, doenças coronarianas e metabólicas 13,14, indicando a transmissão de tais características às gerações futuras 15.

Estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS) consideram o baixo peso ao nascimento como importante problema de saúde pública a nível mundial, com consequências de curto e longo prazo, estimando-se a incidência entre 15 a 20%, de baixo peso quando comparado com o peso ideal ao nascimento, o que representa mais de 20 milhões de nascimentos/ano 16. No Brasil, em 2005, os índices mais relevantes de baixo peso ao nascer foram encontrados nos municípios economicamente mais desenvolvidos, justificando-se pela maior dificuldade de acesso aos serviços de atenção primária à saúde quando comparado ao acesso facilitado em municípios menores 17, sugerindo também sua relação com fatores sociais e a indisponibilidade de assistência pré-natal 18. Este estudo estimou para 2016, a existência de aproximadamente 8% de crianças com baixo peso ao nascer do total de nascidos vivos daquele ano 19.

Dessa maneira, ações que modificam as condições de saúde e fatores nutricionais durante a gestação e os dois primeiros anos de vida podem promover a

redução dos índices de mortalidade infantil. Estas metas já foram definidas pelos “Objetivos de Desenvolvimento do Milênio”, estabelecidos pela Organização das Nações Unidas em parceria com o governo federal (

http://www.odmbrasil.gov.br/os-objetivos-de-desenvolvimento-do-milenio). Adicionalmente, foram estabelecidos

“Objetivos de Desenvolvimento Sustentável”

(https://nacoesunidas.org/pos2015/ods3/) visando “Assegurar uma vida saudável e

promover o bem-estar para todas e todos, em todas as idades”. Também nesse sentido, foi sugerida pela ONU, a redução de 30% no índice de baixo peso ao

nascer a ser cumprida até o ano de 2025

(http://www.who.int/nutrition/topics/nutrition_globaltargets2025/en/).

1.2. Modelos experimentais de programação fetal

Os estudos epidemiológicos citados acima demonstram a associação entre as condições nutricionais adversas maternas e durante a primeira infância como situação de risco para o desenvolvimento de doenças crônicas no indivíduo adulto. Contudo, os mecanismos envolvidos nestas alterações não estão completamente esclarecidos. Assim, com a finalidade de compreender a maneira pela qual o período gestacional poderia influenciar tanto o desenvolvimento fetal quanto a predisposição a diversas doenças, alguns estudos têm sido propostos utilizando modelos experimentais.

Nestes modelos, a manipulação do conteúdo proteico ou calórico dietético durante a gestação tem sido utilizada em estudos fisiopatológicos de diferentes sistemas. Kohrs e colaboradores em 1976 20 avaliaram os efeitos da baixa ingestão proteica durante o período gestacional em macacos Rhesus. Neste estudo, o grupo experimental foi submetido a 75% de restrição proteína relativo ao grupo controle. Os resultados mostraram que os animais submetidos à restrição proteica aumentaram apenas 0,002kg em seu peso corporal durante a gestação, comparados ao grupo controle, cujo aumento observado foi de 1,3kg. A prole do grupo com restrição gestacional também apresentou menor peso ao nascer comparado ao grupo controle.

Posteriormente na década de 80 em outro estudo com ratas prenhas da linhagem Sprague-Dawley alimentadas com ração normoprotéica (20% de proteína) ou hipoprotéica (5% de proteína), a partir do sexto até o 21º dia gestacional,

apresentaram menor tamanho das placentas e fetos com menor peso em relação ao grupo controle. Além disso, os fetos apresentaram menor concentração sérica de IGFI e IGFII, associados à alteração do perfil metabólico destes animais 21. Dollet e colaboradores 22 avaliaram os efeitos endócrinos e metabólicos na prole de ratos da linhagem Wistar cujas mães foram alimentadas com dieta contendo 75g de caseína/kg de ração. Após o desmame, os animais foram divididos em dois grupos: o grupo 1, recebendo 180g de caseína/kg de dieta e o grupo 2 recebeu 50g de caseína/kg de dieta. Observaram que, em ambos os grupos as concentrações séricas de glicose apresentavam-se normais no período de desmame. Porém, a partir da 16ª semana de vida, houve aumento na concentração sérica de glicose, no grupo 1, associada a elevação crescente nas concentrações séricas de insulina e glucagon, sugerindo que a restrição proteica induz, na prole, adaptações pancreáticas e perfil de resistência à insulina.

Com o objetivo de verificar as alterações pancreáticas, Snoeck e colaboradores 23

avaliaram a prole de ratas alimentadas, durante o período gestacional, com ração de baixo teor proteico (LP, low protein: 8% de proteína), em comparação à prole do grupo controle (NP, normal protein: ração com 20% de proteína), e verificaram que

as Ilhotas pancreáticas de Langerhans apresentaram redução de sua capacidade

proliferativa, com menor tamanho médio dessas ilhotas, além de redução de

aproximadamente 50% na vascularização pancreática na prole LP. Tais alterações

na secreção hormonal observadas nestes estudos experimentais sugerem adaptações funcionais às condições encontradas no ambiente adverso intrauterino.

Com o objetivo de verificar se as alterações metabólicas na idade adulta são resultantes de condições de subnutrição, Guan e colaboradores 24 investigaram os efeitos da restrição proteica (8% de teor proteico) durante a gestação e lactação de ratas Wistar e verificaram que a restrição proteica não predispôs a sobrepeso na idade adulta. Entretanto, foi observada alteração drástica no perfil de deposição de tecido adiposo visceral, com aumento da lipogênese e redução da lipólise, paralelamente ao aumento de enzimas como FAS, G3PDH, ACC e SCD, no tecido adiposo do grupo tratado 24. Dentre os efeitos descritos, observou-se maior probabilidade de ganho de peso e desenvolvimento de obesidade, em longo prazo 24

. As alterações ponderais observadas neste estudo ocorreram particularmente naqueles animais com crescimento pós-natal rápido (catch-up growth). Essa diferença na massa corporal ocorreu principalmente em virtude da maior deposição

de tecido adiposo visceral, sugerindo a influência nutricional nas fases pré e pós natal 24.

Dessa maneira, o conceito de “plasticidade do desenvolvimento" definido como adaptações às diferentes condições encontradas pelo feto no ambiente intra-utero, em resposta às condições maternas ambientais ou nutricionais, permitiu a compreensão de efeitos indutores que podem iniciar na fase embrionária e/ou fetal25. Essas modificações no ambiente intra-útero podem ser decorrência de fatores ambientais ou nutricionais, que resultaria em alterações fenotípicas, as quais permaneceriam na idade adulta da prole e passariam por transmissão a várias gerações, mesmo que o fator que as desencadeou tenha cessado 26,27. Assim, as respostas adaptativas sugerem possíveis variações no desenvolvimento normal, levando ao aumento na incidência de doenças crônicas na idade adulta.

1.3. Mecanismos envolvidos na programação fetal

Em condições normais, o sangue fetal contém baixa concentração de cortisol comparativamente ao sangue materno, graças à ação placentária, onde ocorre conversão do cortisol ativo em metabólitos inativos 28. Essa diferença de concentração de esteroides depende da interação de mecanismos envolvendo o fluxo de líquido por área na circulação materna e fetal e da densidade da proteína transportadora na membrana placentária apical e basal, além das demandas anabólicas e metabólicas das camadas trofoblásticas 28. Assim, a circulação fetal apresenta concentrações de 10 a 13 vezes menores de cortisol em relação à circulação materna29. Como barreira a essa diferença de concentração fisiológica, a enzima denominada 11β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo-2 (11β-HSD2) apresenta-se altamente expressa e sua função é catalisar a transformação de cortisol/corticosterona ativo em inativo 28,29. Em modelos experimentais de camundongo C57 com deleção do gene da 11β-HSD2, verificou-se que a prole resultante apresentava menor peso em relação ao grupo controle, o que sugere que essa enzima seja capaz de controlar o desenvolvimento fetal e o peso ao nascer. Alterações na quantidade e função desta enzima resultam em concentrações excessivas de glicocorticoides na circulação fetal e/ou no trofoblasto 29.

Ratas Sprague-Dawley submetidas à restrição gestacional de 50% na ingestão alimentar apresentaram aumento na concentração de corticosterona materna,

redução da atividade e expressão da enzima 11β-HSD2, além do menor peso da prole ao nascer 30. Em outro estudo com ratos Wistar, também com restrição de 50% na ingestão alimentar durante o período gestacional, houve redução nos níveis de ACTH, atrofia adrenal e redução na expressão de mRNA para receptores mineralocorticoide e glicocorticoide no hipocampo fetal, sugerindo alteração no eixo HPA nesses animais 31.

Em humanos, estudos envolvendo mulheres que passaram por condições estressantes durante o período gestacional, tais como mudanças nas condições nutricionais, redução na prática de atividades físicas e estresse psicológico, apresentaram maiores níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias 32. Ainda, nestes estudos os autores demonstraram que a exposição fetal á concentração elevada de glicocorticoides reduziu a proliferação celular e, aumentou precocemente a diferenciação e maturação de sistemas de órgãos. Achados complementares aos acima citados foram obtidos a partir de culturas primárias de placentas humanas tratadas com TNFα, IL-1 e IL-6, quando observaram redução na atividade da 11β-HSD2, associada à elevação de TNFα e IL-1β e redução na expressão de mRNA para 11β- HSD233

.

Esses estudos indicam implicações importantes da exposição fetal a níevis elevados de os glicocorticoides, o que desencadearia alterações crônicas ao longo da vida, através da regulação da expressão gênica34. Assim, estudos que busquem compreender os mecanismos envolvidos na menor expressão da enzima 11β-HSD2 podem auxiliar na elucidação dos efeitos resultantes de um ambiente fetal adverso.

1.4. Repercussões da Programação Fetal

Estudos realizados em nosso laboratório demonstraram que animais submetidos à restrição protéica gestacional (grupo low protein – LP, 6% de teor proteico na ração) nascem com peso menor, com cerca de 30% menos de nefros e, a partir da oitava até a 16ª semana de vida, apresentam maiores níveis pressóricos 35,36. Em seres humanos, esses resultados descritos acima também são confirmados 37 (Figura 1).

Nosso grupo também demonstrou em animais LP, a reduzida expressão dos receptores tipo 1 e 2 (AT1R e AT2R, respectivamente) de angiotensina II e das

proteínas envolvidas na sua via de sinalização 36. Esses dados sugerem ainda que, tendo ocorrido a redução do número de nefros, ocorrem também ajustes na expressão gênica, as quais podem levar a mudanças funcionais do rim e a alterações hemodinâmicas na idade adulta 36.

Figura 1. Repercussões da programação fetal. Evidências epidemiológicas da associação entre o crescimento fetal e risco cardiovascular. O esquema apresenta possíveis correlações entre restrição do crescimento gestacional, a saúde cardiovascular, fatores de risco durante a vida e as oportunidades de correção dessas alterações ao longo da vida. (Traduzido de: Crispi e colaboradores, 2018)37. *TIM, espessura das camadas íntima e média dos vasos.

A redução do número de nefros causa hiperperfusão glomerular, como decorrência do aumento do fluxo sanguíneo para glomérulos remanescentes, o que promove o surgimento de alterações estruturais e funcionais glomerulares, culminando em glomeruloesclerose, senescência glomerular e, desenvolvimento de hipertensão arterial. Sabemos que as alterações na função glomerular, devidas à sobrecarga funcional, são características do processo de envelhecimento perpetuando o ciclo de elevação progressiva da pressão arterial e sobrecarga dos glomérulos remanescentes 38,39,40 (Figura 2).

O rim é diretamente relacionado ao desenvolvimento de hipertensão arterial como parte de um desequilíbrio hidro-salino e, consequentemente, da homeostase de fluidos e sal dos compartimentos corporais. Isso é claramente demonstrado em

FETO

● Remodelamento cardíaco ● TIM aumentadas ● Perfil lipídico aterogênico ● Perda de nefros

CRIANÇA

● Remodelamento cardíaco ● TIM aumentadas ● Pressão arterial aumentada

JOVEM

● Remodelamento cardíaco ● TIM aumentadas ● Pressão arterial aumentada

● Proteinúria glomerular ADULTO

● Pressão arterial aumentada ● Risco aumentado para doenças cardiovasculares e mortalidade

IDOSO

● Risco aumentado para doenças cardiovasculares e mortalidade

Morte por doenças coronarianas antes dos 65 anos

Relação de risco

Peso ao nascer (libras)

Suscetibilidade no adulto

Tabagismo Dieta rica em gordura Atividade física Estresse

Amamentação

ESTILO DE VIDA SAUDÁVEL

Controlar a pressão arterial Evitar excesso de peso

Dieta rica em ácidos graxos ω-3 de cadeia longa

IMPACTO DA RESTRIÇÃO NO CRESCIMENTO FETAL

OPORTUNIDADES PARA CORREÇÃO?

transplantes renais cruzados em modelos experimentais 41 e humanos 42 onde, se o doador é hipertenso, o receptor torna-se hipertenso. Em pesquisas experimentais, Zeman, em 1968 43, foi o primeiro a relatar que prole de ratas submetidas a restrição proteica gestacional (6% de caseína), apresentava menor número de glomérulos quando comparada ao grupo controle (alimentadas com dieta contendo 24% de caseína). Em 2000, estes achados foram confirmados por Vehaskari e colaboradores 44, avaliando a prole de ratos Sprague-Dawley tratadas com ração contendo 6% de proteína a partir do 12º dia gestacional até o final da prenhes. Este estudo demonstrou que a prole apresentava 28% menos glomérulos associado à elevação do número de apoptose de diferentes segmentos dos nefros.

Figura 2. Complicações renais por programação fetal e suas consequências. (Traduzido de: Zandi-Nejad e colaboradores, 2006 40)

Hendry e colaboradores 45 reviram os possíveis fatores que podem estar envolvidos na cessação da nefrogênese. Dentre eles, é descrito o mecanismo de exaustão passiva no qual a subpopulação de células tronco auto-renováveis do cap mesenquimal poderia ser exaurida precocemente. Durante a nefrogênese normal parte destas células se diferencia e parte permanece em divisões sucessivas mantendo o número necessário de células tronco suficientes para completar a nefrogênese. Dessa forma, o número de células tronco progenitoras em proliferação está diretamente relacionado ao número de nefros originados ao término da nefrogênese. Assim, é plausível supor que nos animais programados, os nefros formados possam também ter menor quantidade de células tronco, o que implicaria

Baixo número de nefros

Hipertensão/Hipertrofia Glomerular

Falência Renal Progressiva

Perda de nefros ↓Excreção de Na+ Hipertensão Glomeruloesclerose Eventos Intrauterinos Fatores Genéticos Prematuridade

em menor capacidade regenerativa (Boer e colaboradores, resultados não publicados).

Em outro estudo com a prole de ratos Wistar alimentados com ração contendo 8% de proteína durante a gestação, os autores observaram aumento da área glomerular e hipercelularidade no tufo glomerular dos animais tratados. Tais achados são característicos de doenças glomérulo-proliferativas, em conjunto ao aumento na deposição de colágeno. Além disso, observou-se aumento da proliferação mesangial como mecanismos contrarregulador na tentativa de redução de perfusão glomerular e reduzindo, consequentemente, a pressão de ultrafiltração46, sugerindo que os danos glomerulares causados por alterações nutricionais no período gestacional podem causar mudanças estruturais e funcionais capazes de se manifestar logo no início da vida.

Em humanos, necropsias tem revelado relação direta entre o baixo peso ao nascer, menor número de nefros e aumento no volume glomerular, que constituem componentes importantes no desenvolvimento de lesão renal 47.

Apesar de haver observações consistentes mostrando que a restrição proteica materna gestacional resulta na redução da nefrogênese 48-50, os efeitos decorrentes dessa alteração sobre modificações na taxa de filtração glomerular e elevação da pressão arterial não são claramente entendidos.

Estudo em ratas Sprague Dawley alimentadas com ração contendo 8.5% de proteína mostrou uma redução de 25% no número de nefros e 11% na taxa de filtração glomerular (TFG). Paralelamente, estas alterações foram acompanhadas pelo aumento de 10 mmHg na pressão arterial média relativo ao grupo controle, sugerindo mais uma vez um estado de hiperfluxo/hiperfiltração glomerular 51.

Em contrapartida, a redução no número de nefros em modelos de restrição proteica não é acompanhada, necessariamente, por hipertensão. Ratos Wistar-Kyoto (WKY) alimentados com 8,7% de caseína, durante duas semanas prévias ao acasalamento, período gestacional e nas duas primeiras semanas da lactação, não apresentaram alterações na pressão arterial e na TFG na prole até a 24a semana de idade 52, sugerindo que a variabilidade fenotípica pode ser resultante da exposição da dieta em diferentes períodos e/ou da intensidade desta restrição nutricional.

Estudos realizados em nosso laboratório avaliando a TGF em prole de ratas Wistar com 16 semanas de vida, pertencentes ao grupo LP, a filtração glomerular não foi alterada. Entretanto, estes animais apresentavam significativa proteinúria

associada à simplificação podocitária provavelmente em virtude de sobrecarga funcional glomerular, senescência podocitária precoce e perda de nefros 36.

Portanto, a nefrogênese requer o equilíbrio delicado de diversos fatores que podem ser alterados pela restrição no crescimento intrauterino, através da dieta materna, promovendo alterações na função renal com consequências ao longo da vida.

1.5. Doença Renal Crônica e envelhecimento

A Doença Renal Crônica (DRC) está associada ao declínio da função renal relacionada à idade, desenvolvimento da hipertensão, alterações metabólicas e renais, sendo definida por indicadores de danos renais, como marcadores da filtração glomerular e função tubular, presença de proteinúria, associados à diminuição da função renal, e alterações morfológicas do nefro 53. Conforme as diretrizes estabelecidas pelo National Kidney Foundation's - Kidney Disease

Outcomes Quality Initiative (NKF-KDOQ), a DRC pode ser classificada em cinco

estágios, através de limiares da TFG e/ou evidência de alterações renais estruturais significativas 54.

A DRC possui elevada prevalência global, com estimativas entre 11 e 13% da população mundial no estágio 3 da doença, com TGF entre 30 e 59 ml/min/1.73m2 55

.

Segundo o Inquérito Brasileiro de Diálise Crônica de 2016, o número total estimado de pacientes em diálise foi de 122.825, sendo 18,2% a taxa anual de mortalidade. Destes pacientes, 92% estavam em hemodiálise e 24% estavam em fila de espera para transplante 56, evidenciando, portanto, importante problema de saúde pública.

Em 2010, a prevalência de indivíduos com mais de 60 anos em tratamento dialítico nos EUA correspondia a 25% do total da população nesta faixa etária 57 e, estima-se que, no Brasil, este percentual tenha atingido a 33% do total da população em diálise no ano de 2016 56. Assim, considerando indivíduos idosos, diversas fatores devem ser avaliados na progressão desta doença como concentração de colesterol, triglicérides e ferritina, proteinúria, hipertensão e uso de medicamentos58. Porém, deve-se considerar também que a função renal diminui com a idade a uma taxa de cerca de 1mL/minuto/1.73 m2 por década após 40 anos (de 130 mL/minuto/

1.73 m2 para 80mL/minuto/1.73m2)entre 30 e 80 anos de idade60, evidenciando a importância de ações de saúde pública voltadas ao diagnóstico precoce ou ações para estabilizar sua progressão.

Além das alterações mencionadas, o envelhecimento é um fenômeno biológico complexo, caracterizado por redução progressiva e irreversível na capacidade do organismo de sobreviver a eventos estressores, o que geram os “biomarcadores do envelhecimento” 60

, os quais estão associados ao risco aumentado de morbidade e mortalidade 60-62. A idade cronológica se constitui no mais importante fator de risco para perdas funcionais, doenças crônicas e mortalidade. Existe, no entanto, enorme heterogeneidade na evolução e na progressão de acometimentos da saúde dos idosos, uma vez que a idade biológica difere muitas vezes, da idade cronológica 61.

De acordo com a Federação Americana de Pesquisas em Envelhecimento (para revisão ver 61), os biomarcadores devem ser capazes de predizer a taxa de envelhecimento, avaliar a expectativa de vida e monitorar o processo pelo qual envelhecimento ocorre e, não somente os efeitos finais das alterações patológicas61. Recentemente, vários novos biomarcadores para o envelhecimento biológico têm sido investigados e descritos na literatura podendo ser separados entre biomarcadores moleculares ou biomarcadores combinados tais como creatinina, hemoglobina glicada, colesterol, fosfatase alcalina, albumina sérica, pressão arterial sistólica e a idade biológica 62. Estes biomarcadores têm sido utilizados no monitoramento do processo de envelhecimento e para definir ações que prolonguem a expectativa de vida dos indivíduos. Assim, estudos são necessários para sobrepujar os desafios decorrentes do aumento no número de idosos e enfrentar às fragilidades associadas ao comprometimento de funções biológicas relativas ao envelhecimento. O estudo destes aspectos relativos ao entendimento deste comprometimento futuro deve ter inicio ainda precocemente, uma vez que está cada vez mais claro que o perfil de envelhecimento é definido durante o desenvolvimento embrionário e os períodos precoces da infância.

1.6. Corpúsculos renais

O rim exerce tanto função exócrina, que consiste na formação de urina, quanto funções endócrinas. Contudo, o rim tem por função principal a manutenção

da homeostasia do meio interno e, para tanto, sua unidade morfofuncional básica é o nefro, que consiste de um conjunto de estruturas vasculares e renais que realizam a depuração plasmática renal e encontram-se divididos em duas partes funcionalmente distintas: o corpúsculo renal e o túbulo renal 63.

O corpúsculo renal é composto pelo glomérulo e pela cápsula de Bowman, que envolve o glomérulo. A origem do glomérulo ocorre a partir da artéria aorta abdominal, que se ramifica em artéria renal e, após várias ramificações, forma-se a arteríola aferente, constituída de musculatura lisa desenvolvida, a qual compõe o aparelho justaglomerular, que é sensível às variações de fluxo sanguíneo e à presença de NaCl nos túbulos renais. Logo após a arteríola aferente, inicia a cápsula de Bowman a qual recobre uma profusa rede de capilares enovelados, que são os glomérulos renais, que exercem a função de filtração glomerular, formando a membrana de filtração 64. Dessa forma, a filtração possui três barreiras, que estão localizadas nas membranas dos capilares: 1 - endotélio do capilar, o qual possui fenestras ou poros; 2 - membrana basal, que impede principalmente a filtração de proteínas; 3 - células epiteliais, denominadas podócitos, que circundam a superfície externa da membrana basal capilar e garantem a produção do filtrado glomerular63, 65, 66

. Os podócitos são células altamente diferenciadas, que criam aberturas próprias para a filtração. Assim, as substâncias filtradas devem passar através do endotélio do capilar, da membrana basal e dos podócitos antes de chegarem ao lúmen da cápsula de Bowman. Em conjunto, essas estruturas têm por objetivo impedir a filtração de proteínas e células sanguíneas 63-66.

Figura 3. Estruturas do corpúsculo renal. Em A, observa-se as estruturas celulares do corpúsculo renal em indivíduos saudáveis. Em B, são sugeridas as modificações no corpúsculo renal em indivíduos programados e que, portanto, apresentam menor número de nefros. Em C, o corpúsculo renal composto pelo glomérulo e Cápsula de Bowman. (Modificado e traduzido de: Boer PA, Franco ATB, Gontijo JAR. Effects of Maternal Protein Restriction on Nephrogenesis and Adult and Aging Kidney 2017 67)

Portanto, neste filtrado glomerular encontra-se a maioria dos produtos finais do metabolismo, os quais devem ser eliminados dos fluídos orgânicos, sendo quatro as forças que influenciam na produção do filtrado glomerular e, portanto na TFG: Pressão hidrostática no interior do capilares glomerulares que promove a filtração; Pressão hidrostática na cápsula de Bowman fora dos capilares, que se opõe à filtração; Pressão coloidosmótica das proteínas plasmáticas no interior dos capilares glomerulares, que se opõe à filtração; Pressão coloidosmótica das proteínas na cápsula de Bowman, que favorece a filtração 63, 65.

Após passar pela barreira de filtração, o filtrado glomerular percorre os túbulos renais, sendo o túbulo contornado proximal o principal responsável pela reabsorção maciça do filtrado, uma vez que apresenta em sua composição, estruturas celulares cilíndricas com bordas em escova 66, que aumentam a área e

HEALTHY INDIVIDUALS

Parietal epithelial cell Parietal podocyte Visceral podocyte Mesangial matrix

Mesangial cell

INDIVIDUALS WITH PROGRAMMED NEPHRON NUMBER REDUCTION

The reduction in the glomerular filtration area

and hyper flow promote increase in the capillary

diameter (1) and podocyte detachment

and loss (2). Parietal epithelial cells can increase migration and

differentiation in new podocytes (3) or proliferate producing crescent (4) characterized by pericapilar fibrosis (5), sclerosis of the capillary

tuft (6), mesangial cells proliferation (7), matrix expansion and glomerular basement membrane thickening. 1 1 1 2 2 2 3 4 5 5 6 7 Indivíduos saudáveis Podócito parietal Podócito visceral Células parietais epiteliais (PECs)

Matriz mesangial Célula mesangial

Indivíduos programados-Redução do número de nefros

A redução da área de filtração glomerular e hiperfluxo, promovem aumento do diâmetro do capilar (1) e destacamento e perda de podócitos (2); Células parietais epiteliais podem

proliferar, migrar e diferenciar em novos podócitos (3) ou proliferar e produzir crescentes (4), caracterizando a fibrose pericapilar (5), esclerose do tufo capilar (6), proliferação de células mesangiais (7), expansão da matriz mesangial e alteração da espessura da membrana basal glomerular. Corpúsculo renal Túbulo contornado proximal Arteríola aferente Arteríola eferente A B C

superfície tubular, além das bombas transportadoras para co-transporte e contra-transporte, que aumentam sua capacidade de absorção65.

Posteriormente ao túbulo contornado proximal, o líquido percorre a alça de Henle, túbulo distal, ducto coletor cortical e ducto coletor para o interior da pelve renal. Ao longo do percurso, as substâncias são reabsorvidas ou secretadas seletivamente pelo epitélio tubular e pelos capilares peritubulares, sendo o líquido resultante, a composição final da urina63, 65

.

Embora as alterações renais relacionadas ao envelhecimento sejam diversas, a redução no número de podócitos é fator chave na progressão da disfunção renal e na progressão de doenças glomerulares68. Os podócitos são células altamente diferenciadas com pouca ou nenhuma capacidade de proliferativa. Entretanto, Appel e colaboradores 69 mostraram em camundongos transgênicos no décimo dia pós-natal, um aumento do número de células parietais epiteliais (PECs) que expressavam proteínas marcadoras de podócitos. Estes achados sugerem que mesmo após a cessação da nefrogênese, o rim apresenta células progenitoras capazes de diferenciarem em podócitos que assegurem a reposição, pelo menos parcial, da redução podocitária.

Por serem estruturas altamente diferenciadas, os podócitos possuem na composição de seus filamentos intermediários, proteínas como desmina, vimentina e

nestina 70-73. A expressão glomerular normal da desmina ocorre

predominantemente, nas células mesangiais 70,71, tendo sua expressão aumentada nos podócitos em situações de lesão ou estresse 70 ou associada à hiperfunção glomerular 72. Tem sido demonstrado que o aumento da expressão de desmina nas células glomerulares de roedores Wistar King Aptekman (WKA), Fischer 344 (F344),

Lewis (Lew) e em ratos espontaneamente hipertensos (SHR), com 50 ou mais

semanas de vida, resultam de alterações estruturais e celulares 71.

A vimentina também encontra-se presente nas células glomerulares epiteliais de origem mesenquimal, particularmente nos prolongamentos dos podócitos 68,69,71. Em situações patológicas, o aumento na sua expressão, reflete alterações morfológicas e proliferativas na estrutura glomerular, utilizada como marcador de diferenciação 70,71,73 . Tem sido demonstrado que o aumento na expressão de

vimentina em modelos de nefrose induzida por puromicina, sugere retração dos processos podais podocitários em direção a parede capilar, aumentando a estabilidade mecânica do citoesqueleto 73.

A nestina, componente do citoesqueleto e associada à classe VI das proteínas do filamento intermediário 74,76, está relacionada ao desenvolvimento e diferenciação celular, especificamente dos pedicelos 74. Em camundongos trangênicos usando Cre recombinase Z/Pax2, verificou a redução na expressão de nestina associado a um fenótipo desdiferenciado do podócito, possivelmente acompanhado pela redução na expressão de WT1 74, de tal modo que a desdiferenciação ou expressão anormal de proteínas do citoesqueleto dos podócitos podem estar relacionadas ao processo de desdiferenciação e simplificação podocitária (Figura 4) e, consequentemente, proteinúria 75. Estudos recentes em camundongos transgênicos Cre recombinase Nestina, ficou demonstrada a expressão de nestina em podócitos diferenciados de rins adultos 74,75 e sua atuação na manutenção da citoarquitetura glomerular, interagindo com microtúbulos e microfilamentos, e regulando a organização de proteínas estruturais 75.

Figura 4. Simplificação de podócitos. Em A, temos o esquema de um podócito e seu citoesqueleto no corpo celular e nos pedicelos que se ancoram à lâmina basal (os prolongamentos primários e secundários não estão representados). Em B, representação da simplificação podocitária onde os processos celulares e pedicelos são retraídos e o corpo celular se adere à lâmina basal. Observe que ocorre rearranjo dos elementos do citoesqueleto que se posicionam em feixes paralelos aos capilares glomerulares. (Modificado deSuleiman e colaboradores, 2017 77)

A _B Lâmina basal Podócito Pedicelos Podócito Retração e simplificação dos processos podais Lâmina basal

Porém, em situações patológicas, as lesões glomerulares são acompanhadas por mudanças na expressão dos filamentos intermediários nas células glomerulares. Esta expressão dos filamentos intermediários se apresenta de formas e em tempos diferentes, sendo que a vimentina e a nestina tem sua expressão aumentada antes da proteinúria massiva, enquanto que a desmina aumenta somente após o estabelecimento da proteinúria 73. Associada a nestina, ocorre também a expressão sobreposta de WT1, no núcleo dos podócitos, sugerindo que a regulação na expressão de nestina é regulada pela expressão de WT1 74. Em camundongos com glomerulonefrite com crescentes e na esclerose mesangial, observa-se redução na expressão de WT1, sugerindo que os genes alvos de WT1 não são totalmente expressos nos podócitos 78. Isso ocorre porque existem mais de 20 tipos diferentes de proteínas que são gerados por splicing alternativo de mRNA codificante de WT1 74

. Existem quatro isoformas de WT1 amplamente estudadas, as quais podem atuar em diferentes tecidos com pesos que variam entre 52 a 54kDa. Contudo, não se sabe exatamente o que determina a expressão das diferentes isoformas e ação destas, uma vez que o WT1 apresenta ação diferente nos epitélios parietais e viscerais. Supõe-se que WT1 atue regulando a proliferação celular e modificando a arquitetura do citoesqueleto, uma vez que o WT1 apresenta-se nas estruturas glomerulares, como os podócitos e as células parietais, porém ainda não há uma função claramente definida para WT1 no glomérulo adulto 78.

Com base em estudos prévios, é plausível sugerir que a restrição proteica gestacional, cause alterações importantes na estrutura e função podocitária o que culminaria com simplificação e morte de podocitária, e progressiva evolução para glomeruloesclerose e estágios finais da disfunção renal. Isso ocorre porque os podócitos adultos são considerados células quiescentes presas em fase G0 da divisão mitótica 79.

Em situações de estresse podocitário, estes são capazes de entrar no ciclo celular, aumentarem a síntese proteica, se hipertrofiam no sentido de compensar a redução expressiva no número de podócitos sem, entretanto, apresentarem divisão mitótica. Isso ocorre porque eles permanecem restritos a fases específicas do ciclo celular, sendo este mecanismo fundamental para a hipertrofia celular e prevenção de mitoses aberrantes e danos significativos no DNA. Assim, os podócitos expressam marcadores de proliferação celular, tais como o Ki67, mas caso haja progressão do ciclo celular, os podócitos se destacam da superfície de adesão,

morrem e são eliminados pela urina, o que caracteriza a chamada catástrofe mitótica 79

(Figura 5). Existe a possibilidade de que isto ocorra no nosso modelo experimental, uma vez que previamente verificamos na prole de animais com 16 semanas de vida, que sofreram restrição proteica intrauterina, simplificação podocitária, com a perda das fendas de filtração e a redução das inter-digitações podais. Estas alterações celulares são acompanhadas por um aumento glomerular de TGFβ1, colágeno tipo I, e pelo aumento na expressão de Zeb2, que é um fator de transição epitélio-mesenquima (EMT), sugerindo ser esta uma resposta a condições patológicas para o reestabelecimento da função glomerular 80.

Figura 5. Catástrofe Mitótica do podócito. Em A, observa-se ilustrado o podócito no ciclo celular que, por serem células quiescentes, permanecem presas na fase G0 do ciclo celular, incapazes de realizar divisão mitótica. Em B, o estresse atua como estímulo a essas células para deixarem a fase G0 do ciclo celular. Nesse momento, os podócitos respondem ao estímulo através da síntese proteica e hipertrofia. Porém, por serem incapazes de constituir o fuso mitótico, destacam-se da superfície, morrem e são eliminados, evento denominado de Catástrofe Mitótica.

Hackl e colaboradores 81, utilizando camundongos C57 machos e fêmeas com idades entre 4 e 12 semanas após indução de nefropatia por adriamicina, avaliaram por microscopia seriada, o mesmo glomérulo durante vários dias, com o objetivo de

PODÓCITOS _PODÓCITOS

ESTRESSE

PODÓCITOS PARAR AQUI HIPERTROFIA CASO SIGA O CICLO DESTACAMENTO E MORTE: CATÁSTROFE MITÓTICA A B Preparação para Mitose (19%) Preparação para Mitose (19%) Mitose e divisão celular (2%) Mitose e divisão celular (2%) Síntese de DNA (39%) Síntese _{de DNA} (39%) Síntese de componentes necessários para síntese do DNA (40%) Síntese de componentes necessários para síntese do DNA (40%)

Ciclo celular

Ciclo celular

visualizar possível mobilidade de podócitos e células parietais epiteliais (PECs). Neste estudo, os autores observaram a formação de conglomerados multicelulares, constituídas de PECs as quais migravam simultaneamente para a cápsula do Bowman e em direção ao tufo glomerular em conexão com nanotubos, efeito demonstrativo da dinâmica e peculiar característica da composição celular e do ambiente glomerular 81.

Em humanos, após a obtenção de fragmentos renais normais oriundos de pacientes submetidos à nefrectomia em decorrência de tumores renais, também foi identificada uma população de células progenitoras renais, que se organizavam em sequência precisa ao longo da cápsula de Bowman, representando um “depósito de células progenitoras que contribuiam para o turnover das células glomerulares senescentes ou lesionadas 82. Estas células progenitoras renais apresentam expressão de proteínas diversas conforme sua localização. Aquelas localizadas no polo urinário expressam CD133 e CD24 mas não expressam podocalexina, sendo capazes de se diferenciar em células tubulares e podócitos. Já as células localizadas entre o polo urinário e o polo vascular, expressam marcadores de progenitores de podócitos (CD133, CD24 e podocalexina), sendo capazes de diferenciar somente em podócitos. Por fim, as células localizadas no polo vascular apresentavam características de podócitos diferenciados, expressando somente podocalexina 83.

Em contrapartida, ao investigarem a possível participação das células progenitoras renais na resposta à lesão podocitária, Smeets e colaboradores 84 usaram amostras de tecidos renais de pacientes com diferentes tipos de doenças glomerulares, e verificaram que essas células localizadas na cápsula de Bowman são capazes de diferenciar em podócitos, mas a sua proliferação desregulada contribui para a formação de crescentes, levando a lesões hiperplásicas 84.

Portanto, pesquisas que permitam o entendimento da capacidade de regeneração de células glomerulares, visando tanto manter a arquitetura glomerular quanto prevenir lesões escleróticas, podem auxiliar no estabelecimento de terapias promissoras.

2. Hipótese de trabalho

Diante das informações apresentadas acima é plausível supor que a restrição proteica materna, dada as peculiaridades dos animais LP, possa predispor à antecipação de alterações morfológicas, bem como funcionais renais, características do envelhecimento e senescência glomérulo-tubular, possivelmente como decorrência de sobrecarga hemodinâmica imposta aos nefros remanescentes. Isso poderia ainda, contribuir para a redução da sobrevida destes animais.

3. Objetivos

3.1. Objetivo principal

Avaliar o impacto do envelhecimento na prole de ratos machos submetidos à restrição proteica intraútero, e determinar como o número reduzido de nefros, em paralelo ao desenvolvimento da hipertensão arterial, implica na senescência glomerular, disfunção renal e longevidade.

3.2. Objetivos específicos

Avaliar na prole de ratos machos, com 48 e 62 semanas de vida submetidos a restrição proteica gestacional:

• Pressão arterial;

• Função renal glomerular, através de parâmetros como CCr, Proteinúria, Prot/Crea e DTPA;

• Função renal tubular, através de parâmetros como FENa, FEPNa, FEPPNa, FEK e DMSA.

• Marcação de proteínas do ciclo celular, como Ki67; de lesão podocitária, como Desmina, Vimentina, Nestina e TGFβ1; e da EMT, como Zeb2 e WT1; • Grau de deposição de fibras colágenas no corpúsculo renal pelo método de

picrosirius red;

4. Materiais e métodos

4.1. Desenho experimental

O protocolo experimental do presente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) (Protocolo número 3425-1; anexo) da Universidade Estadual de Campinas– Unicamp e está em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

Ratos machos e fêmeas Wistar HanUnib, com quatro semanas de vida, oriundos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na área de Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas foram mantidos no Biotério do Núcleo de Medicina e Cirurgia Experimental, da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp. Os animais foram acondicionados em gaiolas de polipropileno de 41x34x16 cm, forradas com maravalha autoclavada, com tampa de arame cromado e permaneceram em ambiente com temperatura (23±2°C), umidade relativa do ar (50±10%) e luminosidade (ciclo claro e escuro de 12 horas- das 7 às 19 horas) controladas. Durante todo o período experimental, os animais tiveram livre acesso à ração e à água filtrada. Os animais permaneceram em grupos de três, do mesmo sexo, na mesma gaiola até atingirem a maturidade sexual, na décima primeira semana. Durante este período e até a confirmação da prenhes, foi oferecida aos animais a ração padrão do biotério (Purina Labina®). Após o acasalamento, as fêmeas prenhes foram alocadas em caixas individuais, com acesso irrestrito à água e ração. As ratas e sua prole foram mantidas na mesma gaiola até o momento do desmame (21° dia após nascimento). Após o desmame, os machos de cada prole foram devidamente identificados e alocados em caixas, constituindo duplas ou trios, nas quais permaneceram durante o restante do período experimental.

4.2. Acasalamento

A partir da décima primeira semana até a décima sexta semana de idade as ratas fêmeas foram consideradas em maturidade sexual e, portanto, aptas a iniciar o protocolo de acasalamento.

Os animais foram acasalados em sistema de acasalamento poligâmico temporário (harém) durante o ciclo escuro. Para tanto, um rato macho e três ratas fêmeas foram colocados juntos em uma mesma gaiola.

No início do ciclo claro, para verificação do acasalamento, além da visualização do plug copulatório (cilindro branco seroso formado na vagina da rata coberta, e que é expelido durante as 24 horas após o acasalamento), foi realizado esfregaço vaginal. Para isso, foi inserida uma pipeta contendo água destilada na vagina do animal e o conteúdo foi dispensado e imediatamente aspirado e colocado sobre uma lâmina para a visualização do tipo de células epiteliais presentes e para a procura por espermatozoides. As fêmeas foram consideradas prenhes quando estavam no ciclo estral e quando é possível a visualização de espermatozoides no lavado vaginal. Este protocolo foi seguido, durante o período de cinco semanas, até que todas as fêmeas estivessem prenhes.

4.3. Grupos experimentais

Após a constatação da prenhes, as ratas foram dispostas, aleatoriamente, em um dos grupos de acordo com o conteúdo proteico da dieta ofertada durante todo o período gestacional:

 NP – grupo normal protein (n=30): fêmeas receberam dieta AIN-93G normoproteica, contendo 17% de caseína, ad libitum.

 LP – grupo low protein (n=30): fêmeas receberam dieta AIN-93G, contendo 6% de caseína, ad libitum.

Os animais foram mantidos em gaiolas individuais e em ambiente com temperatura (25±1°C) e luminosidade (ciclo claro/ escuro de 12 horas) controladas. No dia do nascimento, as dietas foram retiradas e substituídas pela ração padrão do biotério, a qual foi mantida às genitoras durante toda a lactação.

Ao final da terceira semana de vida da prole, portanto final da lactação, os filhotes foram separados da genitora, identificados e realocados em novas gaiolas. A figura 6 ilustra o delineamento experimental realizado nessa Tese.

A ração padrão do biotério foi oferecida ad libitum até o final do protocolo experimental. A tabela a seguir (Tabela 1) mostra a composição das diferentes dietas utilizadas durante todo o período experimental. As dietas oferecidas são