UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
THATIANE YOSHIE KANAZAWA
AVALIAÇÃO DAS DISPLASIAS ESQUELÉTICAS LETAIS E INVESTIGAÇÃO DAS BASES MOLECULARES DE UM FENÓTIPO INÉDITO UTILIZANDO
SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO
CAMPINAS 2018
THATIANE YOSHIE KANAZAWA
AVALIAÇÃO DAS DISPLASIAS ESQUELÉTICAS LETAIS E INVESTIGAÇÃO DAS BASES MOLECULARES DE UM FENÓTIPO INÉDITO UTILIZANDO
SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO.
Orientadora: Denise Pontes Cavalcanti
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA THATIANE YOSHIE KANAZAWA, E ORIENTADA PELA PROFª. DRA. DENISE PONTES CAVALCANTI.
CAMPINAS 2018
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências, Área de Concentração Genética Médica.
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
THATIANE YOSHIE KANAZAWAORIENTADORA: PROFA. DRA. DENISE PONTES CAVALCANTI
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. DENISE PONTES CAVALCANTI
2. PROFA. DRA. MARIA TERESA VIEIRA SANSEVERINO
3. PROF. DR. FERNANDO REGLA VARGAS
4. PROF. DR. ANDRÉ SCHWAMBACH VIEIRA
5. PROF. DR. RODRIGO SECOLIN
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
RESUMO
As osteocondrodisplasias (OCD) são doenças genéticas que afetam o crescimento e o desenvolvimento do tecido condro-ósseo, comprometem a estatura, e muitas vezes as proporções corporais, e contribuem para a morbimortalidade infantil. Cerca de um terço das OCD são letais no período perinatal, destacando-se entre estas a displasia tanatofórica (DT) e a osteogênese imperfeita (OI) letal. Algumas OCD letais são extremamente raras e apresentam grande variabilidade clínico-radiológica e heterogeneidade etiológica. Dados epidemiológicos desse grupo de OCD além de limitados são muitos antigos. O objetivo desse trabalho foi avaliar descritivamente as características clínico-radiológicas e epidemiológicas de uma casuística local de OCD letais reunida ao longo de 26 anos e investigar por meio do estudo do exoma, as bases moleculares de dois fetos identificados entre os casos, cujo fenótipo idêntico ainda é inédito. As variáveis clínicas referentes a dados de nascimento, de pré-natal, familiares, além dos diagnósticos clínico-radiológico e molecular foram computados numa planilha e analisados descritivamente. Amostras de DNA dos dois fetos com o fenótipo inédito foram submetidas à análise do exoma a partir da abordagem do trio das duas famílias. No período 1990 – 2016, um total de 131 fetos com OCD letais foram incluídos no presente estudo. Entre os nascidos localmente, a alta prevalência [9,4 (IC=7,40-11,79) por 10.000 nascimentos] encontrada pode ser atribuída a um viés decorrente do hospital ser de referência. Em 80 casos (61,1%) foi levantada uma hipótese diagnóstica no pré-natal. No entanto, a identificação do tipo de OCD no pré-natal ainda é muito imprecisa. A alta taxa de consanguinidade parental (9,2%) é explicada em grande parte pela origem das famílias, maioria oriunda do Nordeste. Os grupos mais frequentes encontrados e os fenótipos letais mais comuns entre esses grupos foram: o grupo FGFR3 [43 (32,8%)] sendo a DT-I a mais comum [36 (83,7%)]; o grupo das OI [33 (25,2%)] com a OI-IIA a mais prevalente [22 (66,7%)]; e o grupo das colagenopatias do tipo 2 [17 (13%)], destacando-se aqui o fenótipo da acondrogênese tipo II (ACG-II) [10 (58,8%)]. Esses três grupos juntos representaram 71% de toda a casuística. Os 38 casos restantes (29%) estão distribuídos em outros nove grupos. Do total de 131 casos, 75 (57,3%) possuem investigação molecular com confirmação do diagnóstico radiológico em 63 casos (84%). A análise do exoma dos dois casos com o fenótipo inédito se mostrou inconclusiva. Em conclusão, a avaliação epidemiológica da presente série de casos
mostra uma alta prevalência de OCD letais, porém relacionada a um viés por se tratar de um hospital de referência na região. As principais OCD encontradas são a DT-I (grupo FGFR3), a OI-IIA (grupo OI) e a ACG-II (grupo colagenopatias tipo 2). Apesar da maioria dos casos de OCD letais serem suspeitadas durante a gestação, o diagnóstico pré-natal específico é ainda muito impreciso. A alta taxa de consanguinidade encontrada na casuística parece ser decorrente da origem das famílias, a maioria oriunda do Nordeste brasileiro.
Palavras-chave: Osteocondrodisplasias. Doenças do desenvolvimento ósseo. Epidemiologia.
ABSTRACT
The osteochondrodysplasias (OCD) are genetic diseases that affect the growth and development of the chondro-osseous tissue leading to short stature, and body disproportion in several individuals, and contribute to the infant morbimortality. Around one-third of these conditions are lethal in the perinatal period, being thanatophoric dysplasia (TD) and lethal osteogenesis imperfecta (OI) the most frequent lethal-OCD. Some OCD in this group are extremely rare, present great clinical-radiological variability and used to be etiologically heterogeneous. Epidemiological information regarding the lethal-OCD is limited and outdated. The aim of this study was to perform a descriptive clinical-epidemiological study based on a local series of cases collected over 26 years. In addition, this study aimed to investigate the molecular bases of two fetuses with a novel phenotype by the whole exome sequencing (WES). The clinical data related to birth, prenatal, family, and clinical-radiological and molecular diagnoses were computed in a spreadsheet and analyzed descriptively. DNA samples from the two fetuses with the novel phenotype were submitted to the exome analysis with the trio approach for both families. In the period 1990 - 2016, a total of 131 fetuses with lethal-OCD evaluated and included in the present study. Among the patients born locally, the high prevalence [9.4 (CI = 7.40-11.79) per 10,000 births] found can be attributed to the bias of reference hospital. Prenatal diagnosis of skeletal dysplasia was performed in 80 cases (61.1%), however, this examination is still very imprecise regarding to reach the specific type of OCD. The high parental consanguinity rate (9.2%) found in this series of cases is, at least partially explained, by the origin of the families from the Brazilian Northeast. The most common groups and lethal phenotypes found were: the FGFR3 group [43 (32.8%)] mainly represented by DT-I [36 (83.7%)]; the OI group [33 (25.2%)] with OI-IIA [22 (66.7%)] as the most common; and the collagenopathies type 2 group [17 (13%)], being the achondrogenesis type II (ACG-II) [10 (58.8%)] the most frequent condition. Together these three groups represent 71% of the total patients. The remaining 38 cases (29%) are distributed in nine other groups. Of the total of 131 cases, 75 (57.3%) had molecular investigation, confirming the radiological diagnosis in 63 cases (84%). The analysis of the exome of the two cases with the novel phenotype was inconclusive. In conclusion, the epidemiological evaluation of the
present case series shows a high prevalence of lethal OCD, but related to a bias because it is a reference hospital in the region. The main OCD found are DT-I (FGFR3 group), OI-IIA (OI group) and ACG-II (type 2 collagenopathies group). Although most cases of lethal OCD are suspected during pregnancy, prenatal diagnosis is too imprecise to identify the specific type of the OCD. The high rate of consanguinity found in the sample seems to be due to the origins of the families, most coming from the Brazilian Northeast.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fluxograma geral simplificado das análises realizadas utilizando os arquivos VCF... 34 Figura 2. Resumo das informações obtidas da vitalidade ao nascimento e idade de óbito dos propósitos estudados... 38
Figura 3. Entre os heterozigotos, o principal tipo de alteração encontrada foram as missenses. Entre os heterozigotos compostos e os homozigotos, o tipo de alteração encontrada foi bastante heterogêneo. (Mis: missense. Del: deleção. Non: nonsense. Dup: duplicação. S. splicing: sítio de splicing)... 51 Figura 4. Distribuição das mutações encontradas em seis famílias aparentemente não relacionadas no nordeste do Brasil... 52
Figura 5. Comparação das radiografias dos casos com a displasia esquelética letal inédita: A) Paciente 101; B) Irmão do paciente 101; C) Paciente 123. Nos três casos se observa: calvário bem calcificado, ausência de calcificação dos corpos vertebrais com pedículos bem calcificados, clavículas levemente espessadas, costelas curtas, sem fraturas e preservadas (aparência de sino), hipoplasia das porções inferiores do ilíaco (aparência de leque), ossos longos encurtados, afilados, sobretudo nas extremidades e com alteração da modelação... 55 Figura 6. Número de variantes antes da filtragem e número de variantes presentes apenas nos genes compartilhados entre os dois propósitos para cada modelo de herança... 57 Figura 7. A) Visualização da alteração missense em heterozigose (16A e 11G) encontrada no paciente 101. B) Exemplo de um éxon com baixa cobertura, inclusive com regiões sem nenhuma read... 61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resumo dos estudos epidemiológicos sobre as OCD que apresentam informações sobre prevalências totais e prevalências das OCD letais. As taxas de prevalência apresentadas são por 10.000 nascimentos... 23
Tabela 2. Média, mediana e desvio-padrão da idade gestacional e principais medidas antropométricas ao nascimento dos indivíduos da casuística... 37 Tabela 3. Idade gestacional dos recém-nascidos/fetos em relação ao tipo/período do óbito... 38
Tabela 4. Informações referentes à média, mediana e desvio-padrão de idade
materna e paterna ao nascimento do propósito... 39 Tabela 5. Achados no exame de ultrassonografia dos casos avaliados e diagnóstico final da OCD associada... 39 Tabela 6. Comparação entre os diagnósticos sugeridos no pré-natal e os diagnósticos finais pós-natal, com número de casos concordantes e discordantes... 41
Tabela 7. Relação dos recém-nascidos/fetos com OCD-letal por grupos diagnósticos segundo a nosologia-2015 (17) e seus respectivos fenótipos e número de casos com estudo molecular... 42
Tabela 8. Número de reads sequenciados, que foram mantidos após o filtro de cada amostra e mapeados. O número real de reads utilizado para a análise foi aquele após a remoção de duplicatas... 56
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Relação das displasias esqueléticas letais mais conhecidas quanto ao grupo, herança, número MIM do fenótipo e gene(s) associado(s)... 27
Quadro 2. Genes associados à OCDs letais analisados na etapa 2 da análise do exoma...
35
Quadro 3. Recorrência da OCD letal na casuística, padrão de herança, presença ou não de consanguinidade e informações sobre irmandade...
44
Quadro 4. Casos com consanguinidade referida, padrão de herança, coeficiente de endocruzamento (F) e origem parental...
45
Quadro 5. Casos numerados a partir da casuística total com estudo molecular, diagnóstico da OCD, padrão de herança, tipo de sequenciamento utilizado na investigação, gene estudado, alteração encontrada e referência em caso de mutações não inéditas...
47 Quadro 6. Variantes identificadas após os filtros amplo e restrito da etapa 3, baseados em características clínicas dos propósitos... 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABraOM Arquivo Brasileiro Online de Mutações ACG AcondrogêneseAD Autossômico dominante
AL Alagoas
Ala (A) Alanina
AO Atelosteogênese AR Autossômico recessivo Arg ( R ) Arginina
Asn (N) Asparagina Asp (D) Ácido aspártico
BA Bahia
BAM Binary Alignment Map
BINOCAR British Isles Network of Congenital Anomaly Registers BMP Bone morphogenetic protein
BWA Burrows-Wheeler Aligner c. DNA complementar
CAAE Certificado de Apresentação para Apreciação Ética CADD Combined Annotation-Dependent Depletion
CAISM Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher CDP Condrodisplasia punctata
cm Centímetros
CNP C-type natriuretic peptide Cys ( C ) Cisteína
DBQ Displasia de Desbuquois DC Displasia campomélica
DNA Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico) DP Desvio padrão
DT Displasia tanatofórica
ECLAMC Estudo Colaborativo Latino-Americano de Malformações Congênitas EUA Estados Unidos da América
F Coeficiente de endocruzamento FGF Fibroblast growth factor
g Gramas
GATK Genome Analysis Tool Kit Gln (Q) Glutamina
Glu (E) Ácido glutâmico Gly (G) Glicina
GQ Genotype quality
HAD Herança autossômica dominante HAR Herança autossômica recessiva hg19 Genoma humano versão 19 HGMD Human Gene Mutation Database His (H) Histidina
HPCG Hipocondrogênese IC Intervalo de confiança IG Idade gestacional
IGV Integrative Genomics Viewer IHH Indian hedgehog
Ile (I) Isoleucina
ILG Interrupção legal da gestação
LaCTAD Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho Leu (L) Leucina
Lys (K) Lisina
MAF Minor allele frequency (menor frequência alélica) Met (M) Metionina
MGI Mouse Genome Informatics MIM Mendelian Inheritance in Man NM Natimorto (nascido morto) NV Nativivo (nascido vivo) OCD Osteocondrodisplasia OFD Síndrome oral-facial-digital OI Osteogênese imperfeita ON Óbito neonatal
PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)
PE Pernambuco
Phe (F) Fenilalanina
PR Paraná
Pro (P) Prolina
PTHrP Parathyroid hormone-related protein RN Recém-nascido
RS Rio Grande do Sul
SEDC Spondyloepiphyseal dysplasia congenita (Displasia espondiloepifisária congênita)
Ser (S) Serina
SHH Sonic hedgehog
SIFT Sorting Intolerant from Tolerant
SNP Single nucleotide polymorphism (Polimorfismo de nucleotídeo único)
SP São Paulo
SRPS Short-rib polydactyly syndrome (Síndrome costela curta polidactilia) TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β Transforming growth factor beta Thr (T) Treonina
Trp (W) Triptofano Tyr (Y) Tirosina
UBDN The Utah Birth Defect Network UF Unidade federativa
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas US Ultrassonografia
UTR Untranslated region (região não traduzida) Val (V) Valina
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1. Revisão da literatura ... 17
1.1.1. Aspectos gerais das displasias esqueléticas ... 17
1.1.2. Displasias esqueléticas letais ... 18
1.1.3. Diagnóstico das displasias esqueléticas letais ... 19
1.1.4. Características epidemiológicas sobre as displasias esqueléticas ... 21
1.1.5. Particularidades das displasias esqueléticas letais mais frequentes ... 25
1.1.6. Uso do exoma nas displasias esqueléticas ... 28
1.2. Justificativa ... 29 2. OBJETIVOS ... 30 2.1. Objetivos gerais ... 30 2.2. Objetivos específicos ... 30 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 31 3.1. Casuística ... 31 3.2. Métodos ... 31 3.2.1. Estudo epidemiológico ... 31 3.2.2. Sequenciamento do exoma ... 32 3.2.3. Bioinformática ... 32 3.2.4. Análises do exoma ... 34 4. RESULTADOS ... 37 4.1. Estudo epidemiológico ... 37
4.1.1 Antecedentes gestacionais, recorrência e consanguinidade. ... 44
4.2. Avaliação molecular da casuística ... 45
4.2.1. Casos com resultado molecular negativo ... 52
4.3. Relato dos casos com fenótipo inédito submetidos ao exoma ... 53
4.4. Dados do exoma ... 56 4.4.1. Análises do exoma ... 57 5. DISCUSSÃO ... 62 5.1. Estudo epidemiológico ... 62 5.2. Consanguinidade ... 63 5.3. Avaliação molecular ... 64
5.4. Fenótipo inédito e genes candidatos ... 65
6. CONCLUSÕES GERAIS ... 68
7. REFERÊNCIAS ... 69 8. APÊNDICES ... Erro! Indicador não definido. 9. ANEXOS ... Erro! Indicador não definido.
1. INTRODUÇÃO
As displasias esqueléticas ou osteocondrodisplasias (OCD) compreendem um grande grupo de condições patológicas que acometem o crescimento e a estrutura do tecido condro-ósseo e se caracterizam por grande heterogeneidade clínica e etiológica. Embora individualmente sejam doenças raras, a sua prevalência como grupo é relativamente alta, contribuindo para a morbimortalidade infantil, sobretudo para a mortalidade perinatal, pois uma fração importante das displasias reconhecidas nesse período são letais ou semi-letais.
Embora o avanço no conhecimento das bases moleculares de muitas displasias esqueléticas tenha sido muito rápido nos últimos anos, um número significativo dessas condições continua sem etiologia definida, seja pela raridade de algumas OCD, seja porque condições inéditas continuam sendo identificadas na medida em que recém-nascidos e crianças com distúrbios de crescimento são mais e melhor investigadas.
A revolução no conhecimento sobre a etiologia das OCD começou com o emprego de técnicas de sequenciamento clássico e vem sendo enriquecidas nos dias de hoje, pelos chamados sequenciamentos de alto desempenho, facilitando não apenas o reconhecimento de novos genes, como também melhorando o diagnóstico e aconselhamento genético dessas condições.
Apesar do avanço no conhecimento das bases moleculares das displasias esqueléticas, estudos epidemiológicos relacionados às condições letais, são obsoletos e descritos numa época na qual várias condições ainda não estavam delineadas clínico-radiologicamente e muitas vezes baseados num pequeno número de casos.
A partir de uma casuística local com mais de 100 OCD letais bem estudadas num período de mais de 20 anos, este trabalho teve como finalidade realizar um estudo epidemiológico descritivo das OCD letais e tentar definir as bases moleculares de um fenótipo inédito observado em dois fetos não relacionados, por meio do estudo do exoma.
1.1. Revisão da literatura
1.1.1. Aspectos gerais das displasias esqueléticas
Os ossos do esqueleto são formados a partir de dois processos principais: a ossificação intramembranosa, que dá origem aos ossos chatos como os ossos do crânio e a clavícula e a ossificação endocondral, que ocorre a partir de um molde cartilaginoso e é o processo de formação dos ossos longos (1). Nesse processo de ossificação, exerce papel fundamental a placa de crescimento, localizada na região metafisária dos ossos longos promovendo um crescimento da extremidade para a região mediana do osso. Vários fatores atuam em sinergia regulando a expressão gênica correta dessa ossificação. A placa de crescimento é constituída por um tecido extremamente organizado, onde diversas vias de sinalização regulam a diferenciação do primeiro tipo de célula específica do esqueleto a aparecer, os condrócitos (2): via de sinalização Hedgehog (SHH e IHH) (3), peptídeo relacionado ao hormônio da paratireóide (PTHrP) (4), fator de crescimento de fibroblastos (FGF) (5), peptídeo natriurético tipo C (CNP) (6), fator de crescimento transformador beta (TGF-β) (7), proteína morfogênica do osso (BMP) (8), Notch (9) e Wnt (10). Devido a diversos mecanismos patogênicos, pode ocorrer uma desregulação primária ou secundária dessas vias, levando a uma sinalização inapropriada, comprometendo profundamente a placa de crescimento, resultando em distúrbios do esqueleto (11,12).
As displasias esqueléticas surgem a partir de alterações, em geral, monogênicas, de genes que regulam os processos metabólicos ou o desenvolvimento da placa de crescimento (13). As displasias têm caráter progressivo, visto que o tecido condro-ósseo começa se desenvolvendo no período embrionário e só termina na idade adulta (14).
A elaboração da primeira nomenclatura e classificação das OCD ocorreu no final da década de 60, quando especialistas se reuniram para elaborar um consenso acerca das características heterogêneas das displasias (15). Desde então, nove revisões foram publicadas e em sua última versão, a nosologia das doenças ósseas constitucionais, listou 436 condições em 42 grupos, sendo a maioria dessas condições displasias esqueléticas. Nessa nosologia encontram-se também as disostoses (malformações) e síndromes malformativas com um envolvimento ósseo preponderante (9). Dentre as displasias esqueléticas, pelo menos 110 condições são
de manifestação perinatal e, aproximadamente metade destas, são letais ou semi-letais (16,17). Atualmente, a classificação desses distúrbios em famílias ou grupos leva em conta não só aspectos clínicos e radiológicos, como também as suas bases moleculares (18).
Mutações em um mesmo gene podem causar diferentes fenótipos de displasia esquelética com gravidades diferentes. Um exemplo clássico é o gene FGFR3, cujas mutações podem produzir fenótipos compatíveis com a vida, como a hipocondroplasia e a acondroplasia, até condições letais como a displasia tanatofórica tipos I e II. Por outro lado, mutações em diferentes genes podem causar fenótipos muito similares, ou quase idênticos, sendo o grupo da osteogênese imperfeita o maior exemplo dessa variabilidade (17,19).
1.1.2. Displasias esqueléticas letais
A mortalidade perinatal pode ser definida como o óbito do concepto que ocorre tardiamente intra-útero (natimorto ou óbito fetal), ou no período neonatal, até quatro semanas de vida pós-natal (20). As displasias letais ou semi-letais, portanto, incluem aquelas condições cujo óbito costuma ocorrer dentro desse período perinatal. O conjunto dessas displasias se reveste de importância não apenas pela sua frequência, como também pela sua importância dentro da morbimortalidade infantil. O termo “semi-letal” pode ser empregado àquelas OCD com evoluções inconstantes, com diferenças na expressividade clínica, que podem variar de condições com uma apresentação de menor gravidade até a evolução fatal nos primeiros dias de vida (21).
As displasias esqueléticas letais começaram a ser postas em evidência no início dos anos 60, quando Maroteaux e Lamy mencionaram que “certos casos de osteocondrodisplasias considerados como uma acondroplasia grave com desfecho letal correspondiam, na realidade, a condições completamente diferentes" (22). Compreendendo a complexidade do espectro de gravidade que as displasias esqueléticas apresentavam, em 1971, Bailey separou as condições conhecidas em três grupos para auxiliar o diagnóstico clínico: o grupo da acondroplasia (uma vez que esse termo era muitas vezes empregado erroneamente para classificar qualquer indivíduo portador de baixa estatura/displasia esquelética), o grupo das condições invariavelmente letais (que incluía o nanismo tanatofórico, acondrogênese,
acondroplásicos homozigotos e a síndrome Conradi) e por último as condições semi-letais (nanismo metatrópico,diastrófico e distrofia de Jeune; síndrome Ellis-van Creveld, hipofosfatasia, osteogênese imperfeita e osteopetrose) (21).
A maior causa da letalidade entre as displasias esqueléticas é a hipoplasia pulmonar, em geral, secundária, a uma caixa torácica pequena e estreita que não permite o desenvolvimento pulmonar adequado. Na maioria das vezes, um bebê com displasia esquelética letal morre pela dificuldade respiratória, inerente à hipoplasia pulmonar, logo após o nascimento (23).
No entanto, nem todas as displasias esqueléticas associadas a tórax estreito estão associadas à letalidade imediata, por isso a importância de se avaliar corretamente o conjunto de achados que exames pré-natais oferecem a fim de se obter uma forte sugestão de letalidade ou de OCD com bom prognóstico (24). A sobrevida de algumas OCD letais pode ser prolongada em alguns casos, em função da utilização de alguns recursos terapêuticos no período pós-natal ou mesmo quando a apresentação clínica acontece de modo menos grave do comumente observado (14).
Algumas características usuais observadas intra-útero estão presentes na maioria das displasias esqueléticas, já o conhecimento de particularidades de OCD específicas, pode contribuir para a sugestão de um diagnóstico preciso (25).
1.1.3. Diagnóstico das displasias esqueléticas letais
Apesar do grande avanço relacionado às bases moleculares das displasias esqueléticas, o diagnóstico das mesmas ainda se baseia, essencialmente, em critérios clínico-radiológicos (26). A maioria das OCD tem ampla heterogeneidade clínica e genética. No entanto, como atualmente mais de 70% das OCD têm sua etiologia genética conhecida, para àqueles casos com diagnósticos duvidosos pode-se lançar mão do estudo molecular. A identificação das mutações pode-serve para precisar o diagnóstico, ajudar a definir o diagnóstico definitivo entre os diagnósticos diferenciais.
As manifestações clínicas das displasias esqueléticas podem variar, e dependendo da gravidade das alterações, podem ser evidentes já ao nascimento, no caso das OCD letais e algumas não letais. O sinal clínico mais frequente é o comprimento reduzido, muitas vezes com desproporções corporais importantes.
Além disso, podem ser encontradas fraturas, luxações, malformações de outros órgãos e hipoplasia pulmonar, sendo esta, um dos principais determinantes da letalidade das displasias esqueléticas (14)
A suspeita pré-natal de uma displasia esquelética normalmente é feita após o primeiro trimestre da gestação. Quanto mais precoces os sinais, mais grave ela tende a ser (25).
A avaliação ultrassonográfica fetal no segundo trimestre para a identificação de anomalias congênitas tornou-se padrão de atendimento em muitos serviços hospitalares. Devido a uma alta mortalidade perinatal, quando surge a suspeita de uma displasia esquelética em curso, uma das interpretações mais importantes que precisam ser realizadas no exame pré-natal, é a respeito da letalidade perinatal (24). A possibilidade de predição da letalidade por meio de achados ultrassonográficos foi sugerida por Rahemtullah e colaboradores (1997), em um estudo retrospectivo que identificou 18 casos com suspeita pré-natal de displasia esquelética dentre 35.000 fetos avaliados por ultrassonografia e encontrou na razão comprimento do fêmur/circunferência abdominal (F/CA) um bom parâmetro para estimar o prognóstico fetal, principalmente quando realizado no segundo trimestre gestacional. Uma razão inferior a 0,16 foi observada nos nove casos com evolução letal e maior do que 0,16 nos nove restantes, que englobaram OCD não letais e casos em que a suspeita de displasia esquelética não foi confirmada posteriormente. Essa proposta de utilizar a razão F/CA foi reforçada pelo trabalho de Ramus e colaboradores (1998), que também utilizou a mesma razão como parâmetro para letalidade. Assim, uma razão de comprimento do fêmur/circunferência abdominal <0,16 são fortemente sugestivos de letalidade (24,25). Vale ressaltar que, os autores consideraram que esta razão pode tornar-se inadequada para estimar o prognóstico nos casos em que existe um encurvamento ou hipoplasia grave do fêmur, como em alguns casos de osteogênese imperfeita tipo III (27,28).
Ainda no exame de ultrassonografia, outros sinais indicativos de uma displasia esquelética letal são: presença de hidropisia fetal, grave polidrâmnio e, ocasionalmente, anormalidades viscerais (24,25).
1.1.4. Características epidemiológicas sobre as displasias esqueléticas A maioria dos trabalhos epidemiológicos que abordam as displasias esqueléticas são das décadas de 70 a 90 e as prevalências encontradas não são consistentes. Ademais de serem estudos antigos, corroboram para essa inconsistência, amostras de base populacional ou hospitalar com populações muito pequenas e algumas vezes enviesadas, além de subdiagnóstico de várias condições (29–32). Cabe ressaltar que, os estudos epidemiológicos sobre displasias esqueléticas se baseiam, sobretudo ou exclusivamente em displasias esqueléticas de manifestação perinatal. A inclusão de casos com manifestação tardia pode acarretar em uma falsa alta prevalência, pois a obtenção de dados consistentes sobre a frequência dessas OCD é difícil. No trabalho de Andersen e Hauge (1989), na qual displasias esqueléticas diagnosticadas tardiamente foram incluídas, a prevalência geral foi de 7,6 a cada 10.000 nascimentos (32).
Recentemente, dois trabalhos epidemiológicos foram publicados paralelamente e apresentaram resultados semelhantes em relação à prevalência das displasias esqueléticas. No primeiro, Stevenson e colaboradores desenvolveram um estudo de base populacional no estado de Utah (EUA) entre os anos de 1999 a 2008, e encontraram uma prevalência geral de 3,0 para 10.000 nascimentos e, entre os natimortos, uma prevalência de 20,0/10.000 (33). O segundo estudo, realizado pelo grupo local de Displasias Esqueléticas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), foi baseado nos dados do ECLAMC (Estudo Colaborativo Latino Americano de Malformações Congênitas) entre os anos de 2000 a 2007 e mostrou uma prevalência geral das displasias esqueléticas de 3,2 casos a cada 10.000 nascimentos. A prevalência entre os natimortos foi de 33,6/10.000 (16). Esse estudo também mostrou uma alta taxa de diagnóstico pré-natal em 359 casos (73%).
No estudo dos EUA, os grupos mais frequentes encontrados foram: FGFR3 (0,81/10.000), grupo das OI (0,79/10.000) e o grupo do colágeno tipo 2 (0,2/10.000). No trabalho da América Latina, 33% (0,45/10.000) dos casos se enquadraram no grupo das OI, 29% (0,39/10.000) no grupo FGFR3 e 8% (0,11/10.000) no grupo da campomélica e distúrbios relacionados.
Alguns trabalhos epidemiológicos com foco especificamente nas displasias esqueléticas letais foram publicados entre as décadas de 80 e 90 e a prevalência
encontrada entre eles varia de 0,92 a 1,62 por 10.000 nascimentos (30,34–36) (Tabela 1).
Em 1971 na Austrália, Kozlowski e colaboradores, deram início ao primeiro estudo com base hospitalar das displasias esqueléticas raras com óbito neonatal. Porém, esse estudo não compara o número de casos encontrados com uma população controle, assim não há dados de prevalência. Foram relatados 17 casos, todos com diagnóstico estabelecido pelo exame de radiografias. Essa casuística, na verdade uma mescla de displasias esqueléticas e síndromes malformativas, era composta por oito casos de acondrogênese, duas displasia campomélica, duas OI, um caso de condrodisplasia punctata, uma acondroplasia em homozigose, um com síndrome de Meckel-Gruber, um Majewski e um caso do que era conhecido como síndrome do crânio em trevo (37).
Em 2009, outro estudo descritivo, também sem dados de prevalência, foi publicado quando já se tinha um conhecimento diagnóstico das OCD semelhante ao que temos atualmente. Uma série de 32 casos de OCD letais foi estudada por Lahmar-Boufaroua e colaboradores em uma cidade da Tunísia durante um período de 14 anos no qual registraram uma alta taxa de término da gestação (23 fetos), seis nativivos e três natimortos. Entre eles: oito casos de acondrogênese tipo 1, três casos de acondrogênese tipo 2, nove casos de OI letal, oito casos de displasia tanatofórica, quatro casos de displasia Schneckenbecken, dois casos de costela-curta-polidactilia e um caso de displasia torácica asfixiante (Jeune). Consanguinidade foi observada em 61% dos casos e três relatos de recorrência na família foram registrados. Alterações ósseas foram detectadas na ultrassonografia em 25 casos (87%) e em sete casos ao nascimento (38).
Tabela 1. Resumo dos estudos epidemiológicos sobre as OCD que apresentam informações sobre prevalências totais e prevalências das OCD letais. As taxas de prevalência apresentadas são por 10.000 nascimentos.
Ano Autores Base Local Período Inclusão de casos Total
Nasc. Nº Casos OCD Prev. Total Prev. Letal
1975 Gustavson e Jorulf Hospitalar (1) Suécia 4 anos (Fev/1970 -
Ago/1974) RN (NV e NM) 14.816 7 4,72 2,68
1982 Camera e
Mastroiacovo Hospitalar (90) Itália 3 anos (1978 - 1981) Até 7 dias (NV e NM) 217.061 53 2,4 1,33 1985 Connor et al.* Populacional Oeste da Escócia 13 anos (1970 - 1983) RN (NV e NM) 337.771 38 - 1,12
1986 Orioli et al. ECLAMC (26 hosp)
América do Sul (9
países) 5 anos (1978 - 1983)
Até 3 dias (NV) e
NM>500g 349.470 80 2,3 1
1989 Andersen* Populacional Condado de Fyn (Dinamarca)
13 anos (Jan/1970 -
Dez/1983) RN (NV e NM) 77.977 12 - 1,54
1989 Andersen e Hauge£ Populacional Condado de Fyn (Dinamarca)
13 anos (Jan/1970 - Dez/1983)
RN (NV e NM>28
semanas) 77.977 55 7,57 -
1989 Andersen e Hauge¥ Populacional Condado de Fyn
(Dinamarca) 31 Dez 1983 População geral 453.921 150 3,3 -
1989 Stoll et al. Populacional (11
hosp) Estrasburgo (França)
7 anos (Jan/1979 - Dez/1986)
Até 8 dias (NV) e
NM>20 semanas 105.374 34 3,22 1,23 1990 Cobben et al.* Populacional Holanda 7 anos (1981 - 1988) RN (NV e NM) 73.879 12 - 1,62
1991 Sánchez et al. Hospitalar (1) Venezuela 12 anos (Abr/1978 - Ago/1990)
RN (NM>500G a partir
de 1980) 70.152 25 3,56 1,42 1993 Källén et al. Internacional Vários§ 24 anos (1965 - 1989) Vários§ 9.5M 1500 1.6 -
Ano Autores Base Local Período Inclusão de casos Total Nasc. Nº Casos OCD Prev. Total Prev. Letal
1996 Rasmussen et al. Hospitalar (1) Boston (EUA)
15 anos (Fev/1972 - Fev/1975; Jan/1979 -
Dez/1990)
Até 5 dias (NV) e
NM>20 semanas 126.316 27 2,14 0,95
2003 Al-Gazali et al. Populacional Emirados Árabes Unidos
5 anos (Jan/1996 - Dez/2000)
Até 7 dias (NV) e
NM>500g 38.048 36 9,46 -
2008 Waller et al.β Hospitalar (4)
Atlanta (EUA) 33 anos (1968 - 2001)
NV, NM>20 semanas e AE>20 semanas
1.129.972 28 - 0,25 Iowa (EUA) 18 anos (1983 - 2001) 733.196 22 - 0,3 Oklahoma (EUA) 9 anos (1994 - 2003) 484.013 10 - 0,21 Texas (EUA) 6 anos (1996 - 2002) 2.042.554 43 - 0,21
2010 Donnelly et al.# Populacional Irlanda do Norte 12 anos (Jan/1995 - Dez/2006) NM e Óbitos até 6 meses 274.621 22 DT; 4 OI - 0,8 DT; 0,15 OI
2011 Boyd et al.* Populacional (BINOCAR)
Inglaterra e País de Gales
1 ano (Jan/2005 -
Dez/2006) RN (NV e NM) 601.545 79 - 1,3
2012 Barbosa-Buck et al. ECLAMC (132 hosp)
América do Sul (9 países)
8 anos (Jan/2000 -
Dez/2007) RN (NV e NM>500g) 1.544.496 492 3,2 1,58
2012 Stevenson et al. Populacional
(UBDN) Utah (EUA) 9 anos (1999 - 2008)
NV, NM, AE, Aes <20
semanas 509.283 153 3 0,92
*Incluído apenas as OCD letais. £ Prevalência ao nascimento. ¥ Prevalência populacional em todos os cidadãos vivos no período especificado. β Incluído apenas Displasia Tanatofórica. # Incluído apenas Displasia Tanatofórica e Osteogênese imperfeita formas letais. § Inclui 7 programas de vigilância epidemiológica (Austrália, Dinamarca, França, Itália, México, América do Sul, Suécia) com bases, critérios de inclusão e períodos variando de um programa para outro. ECLAMC: do espanhol –
Estudio Colaborativo Latino-Americano de Malformaciones Congénitas. BINOCAR: do inglês – British Isles Network of Congenital Anomaly Registers. UBDN: do inglês
– The Utah Birth Defect Network. EUA: Estados Unidos da América. RN: recém-nascido. NV: nascido vivo. NM: nascido morto. AE: aborto eletivo. AEs: aborto espontâneo.
Visto que as displasias esqueléticas letais mais prevalentes são DT e OI, dois estudos relativamente recentes abordaram especificamente essas displasias. Em 2010, em um estudo populacional na Irlanda do Norte, 39 casos de DT e OI foram identificados em um período de 12 anos, sendo a displasia tanatofórica mais comum (0,8/10.000) seguida da OI tipo 2 (0,15/10.000) (39). E em outro trabalho de base populacional nos Estados Unidos, Waller e colaboradores (2008) encontraram uma prevalência de 0,21 a 0,30 de displasia tanatofórica em 10.000 nascimentos (40).
Não existem estudos epidemiológicos recentes incluindo etiologia das displasias esqueléticas letais. Apesar disso, a partir de referências de relatos de casos e outros trabalhos, o estudo etiológico das OCD está em constante avanço e quase todas as displasias esqueléticas letais reconhecidas tem suas bases moleculares ao menos parcialmente conhecidas. Assim, além de poucos, o estudo epidemiológico das displasias esqueléticas letais encontra-se defasado do ponto de vista diagnóstico.
1.1.5. Displasias esqueléticas letais mais frequentes
O grupo FGFR3 das OCD se destaca entre todas as displasias esqueléticas por sua alta prevalência e engloba as OCD mais frequentes e decorrentes de mutações no gene que codifica o Receptor 3 do Fator de Crescimento de Fibroblastos - FGFR3. Todas têm padrão de herança autossômico dominante. A displasia letal presente nesse grupo é a Displasia Tanatofórica tipos I e II. Além disso, quando ambos os pais têm acondroplasia, o risco para a forma em homozigose é de 25% e as características fenotípicas são semelhantes à displasia tanatofórica, consequentemente letal (41).
No grupo das displasias com diminuição da densidade óssea, que inclui os diferentes fenótipos de osteogênese imperfeita (OI) e outras condições, se destaca, sobretudo a forma letal perinatal, OI tipo 2 (17,42). Vale ressaltar que, tipicamente a OI está associada a defeitos na produção do colágeno tipo 1 e 85-90% dos casos têm mutações no gene COL1A1 ou no COL1A2, que codificam o procolágeno α1 e α2, respectivamente. Atualmente, sabe-se que as OCD do espectro fenotípico da OI, outrora associados basicamente a mutações nos colágenos, podem estar associados a vários genes, entre eles: IFITM5 e P4HB com mutações em heterozigose e padrão de herança AD, e uma série de genes recessivos, incluindo
P3H1, SPARC, SERPINF1, OI16, WNT1, SP7/OSX, BMP1, CRTAP, FKBP10, LEPRE1, PLOD2, PPIB, SEC24D, SERPINH1 e TMEM38B (43,44).
O grupo das ciliopatias com maior envolvimento esquelético, antes chamado de grupo costela-curta-polidactilia (embora os dedos extra-numerários possam ou não estar presentes) (13,17), compreende as displasias esqueléticas relacionadas, como o nome atual indica, aos genes do ciliosoma, sobretudo os genes que codificam proteínas dos complexos de transporte intraflagelar e os genes associados às proteínas do corpo basal (45). O cílio primário, estrutura baseada em microtúbulos presente nos condrócitos, está relacionado à arquitetura e a organização da placa de crescimento. O desequilíbrio na ciliogênese pode levar a diversas formas graves de displasias esqueléticas (46). Entre elas, as síndromes letais desse grupo se encontram os seguintes tipos: Síndrome costela-curta-polidactilia [do inglês short rib-polydactyly syndrome (SRPS)] tipo 1/3 (Síndrome Saldino-Noonan/Verma-Naumoff), SRPS tipo 2 (Síndrome Majewski), SRPS tipo 4 (Síndrome Beemer-Langer), SRPS tipo 5 e síndrome oral-facial-digital tipo 4 (Síndrome Mohr-Majewski) (17).
O quarto grupo mais frequente na América do Sul relatado por Barbosa-Buck e colaboradores foi o grupo do colágeno 2. Esse grupo inclui 10 fenótipos diferentes que, semelhante ao grupo FGFR3, formam um espectro de gravidade variando de casos letais como a acondrogênese tipo 2 (Langer-Saldino), a displasia platispondilíaca tipo Torrance e a hipocondrogênese até casos mais leves como a displasia de Stickler (14,17).
No grupo das displasias relacionadas a ossos encurvados – grupo das displasias Bent-bones atualmente chamado - devido à grande frequência da displasia campomélica (DC) - de grupo da DC e desordens relacionadas, todas as condições são de manifestação perinatal, mas somente a displasia campomélica e a displasia Stuve-Wiedemann podem ser letais no período perinatal e neonatal, respectivamente (17).
As demais displasias esqueléticas letais são muito raras e possuem frequências muito baixas. No quadro 1, as displasias esqueléticas letais ou semi-letais reconhecidas até o momento foram listadas (17,47).
Quadro 1. Relação das displasias esqueléticas letais mais conhecidas quanto ao grupo, herança, número MIM do fenótipo e gene(s) associado(s).
GRUPO/OCD LETAL HERANÇA MIM # GENE
1. Grupo FGFR3
Displasia tanatofórica tipo I (DT-I) AD 187600 FGFR3
Displasia tanatofórica tipo II (DT-II) AD 187601 FGFR3
Acondroplasia em homozigose AD 100800 FGFR3
2. Grupo do colágeno tipo 2
Displasia espondiloespifisária congênita (SEDC)* AD 183900 COL2A1
Acondrogênese tipo II (Langer-Saldino) (ACG-II) AD 200610 COL2A1
Hipocondrogênese (HPCG) AD 200610 COL2A1
Displasia platispondilíaca tipo Torrance** AD 151210 COL2A1
3. Grupo do colágeno tipo 11
Fibrocondrogênese AR 228520 COL11A1
4. Grupo dos distúrbios da sulfatação
Acondrogênese tipo IB (ACG-IB) AR 600972 SLC26A2
Atelosteogênese tipo II (AO-II) AR 256050 SLC26A2
5. Grupo perlecan
Displasia dissegmentar tipo Silverman-Handmaker AR 224410 HSPG2
Displasia dissegmentar tipo Rolland-Desbuquois AR 224400 HSPG2
7. Grupo da filamina e distúrbios relacionados
Atelosteogênese tipo I (AO-I) AD 108720 FLNB
8. Grupo TRPV4
Displasia metatrópica forma perinatal AD 156530 TRPV4
9. Ciliopatias com maior comprometimento esquelético
Síndrome costela curta polidactilia tipo I/III
(Saldino-Noonan/Verma-Naumoff) (SRP-I/III) AR
613091 DYNC2H1
208500 SRTD1
Síndrome costela curta polidactilia tipo II (Majewski)
(SRP-II) AR 611263
DYNC2H1 IFT80
Síndrome costela curta polidactilia tipo IV (Beemer)
(SRP-IV) AR 613819
IFT122 TTC21B
Síndrome costela curta polidactilia tipo V (SRP-V) AR 614376 WDR35
WDR19
Síndrome oral-facial-digital (Mohr-Majewski) (OFD) AR 258860 TCTN3
D. Cranioectodermal (Sensenbrenner)* AR 218330 IFT122
14. Displasias espondilodisplásicas graves
Acondrogênese tipo IA (ACG-IA) AR 200600 TRIP11
Displasia Schneckenbecken AR 269250 SLC35D1
GRUPO/OCD LETAL HERANÇA MIM # GENE
Opsismodisplasia** AR 258480 INPPL1
18. Displasia campomélica e distúrbios relacionados
Displasia campomélica*** AD 114290 SOX9
Displasia Stuve-Wiedemann*** AR 601559 LIFR
19. Grupo das diplasias de ossos delgados
Osteocraniostenose AD 602361 FAM111A
20. Displasias com luxações múltiplas
Displasia de Desbuquois tipo I (DBQ-I)§ AR 251450 CANT1
Displasia de Desbuquois tipo II (DBQ-II) § AR 615777 XYLT1
21. Grupo condrodisplasia punctata
Displasia Greenberg AR 215140 LBR
Displasia Astley-Kendall AR? - -
22. Displasias osteoscleróticas neonatais
Displasia de Blomstrand AR 215045 PTHR1
Displasia Caffey AR 114000
Displasia Raine AR 259775 FAM20C
25. Grupo da osteogênese imperfeita e diminuição da densidade óssea
Forma letal perinatal da osteogênese imperfeita (OI tipo II). OI-IIA; OI-IIB; OI-IIC
AD
166210 COL1A1
AD COL1A2
26. Grupo da mineralização anormal
Hipofosfatasia perinatal letal# AR 241500 ALPL
Hiperparatireoidismo neonatal AR 239200 CASR AR: autossômico recessiva. AD: autossômico dominante. MIM: do inglês - Mendelian Inheritance in Man.*O óbito perinatal é eventual. **Maioria morre no período perinatal, mas há relatos de sobrevida com bom prognóstico além da baixa estatura. ***O óbito costuma sem mais tardio, além do período perinatal. § Poucos casos com história de óbito perinatal. # Atualmente se discute possibilidade de tratamento.
1.1.6. Uso do exoma nas displasias esqueléticas
Uma nova abordagem de sequenciamento mais viável e custo-efetiva de regiões codificantes do genoma começou a surgir por volta de 2009 – 2010, quando os primeiros trabalhos de descrição das técnicas utilizadas para a captura de éxons e os primeiros diagnósticos genéticos foram realizados utilizando essa tecnologia (48,49). Em 2010, o gene WDR35 foi o primeiro a ser identificado em uma displasia esquelética (Sensenbrenner) utilizando-se o estudo do exoma em dois pacientes não relacionados com estudo de array negativo e com fenótipo extremamente
semelhante (50). No início do ano seguinte, mais dois trabalhos envolvendo o estudo do exoma nas displasias esqueléticas foram publicados. O primeiro investigou em dois pacientes não relacionados uma OCD espondiloepimetafisária rara denominada displasia anauxetic (MIM 607095) cujo gene relacionado é o RMRP. Com a exclusão de mutações nesse gene, o estudo do exoma foi realizado e duas novas alterações de perda de função em heterozigose composta no gene POP1 - que interage diretamente com o gene RMRP - foram identificadas (51). No segundo, Becker e colaboradores investigaram um único indivíduo com uma forma grave osteogênese imperfeita, cujos pais eram primos de segundo grau. Após mutações em todos os genes relacionados à OI serem descartadas, a análise do exoma identificou uma mutação nonsense em homozigose no gene SERPINF1. Mutações nesse mesmo gene foram identificadas em outros dois pacientes não relacionados com OI e consanguinidade parental (52).
Atualmente o exoma tem se sobressaído como melhor estratégia para identificar a etiologia genética de displasias esqueléticas inéditas ou mesmo para aquelas em que as bases moleculares ainda não foram determinadas. Em casos esporádicos, a análise de trios (pai, mãe e propósito) pode revelar mutações de novo. Em casos familiares, a combinação do sequenciamento do exoma com, por exemplo, a genotipagem de SNPs pode produzir informações para se priorizar variantes raras (53).
1.2. Justificativa
As displasias esqueléticas letais compreendem um grupo com poucos estudos epidemiológicos e, trabalhos descritivos com foco nas OCD letais, são quase inexistentes. Nesse contexto, a disponibilidade de um grande registro de OCD letais associado com a experiência local adquirida, oferece uma situação ímpar para a investigação dessas condições. Além disso, a identificação e descrição de um fenótipo inédito com estudo de exoma, poderia contribuir para a identificação de um novo gene relacionado a uma OCD letal.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
Avaliar as displasias esqueléticas letais de uma casuística local incluindo seus aspectos clínico-radiológicos e características epidemiológicas.
2.2. Objetivos específicos
1. Descrever os diagnósticos da casuística local, avaliando as frequências dos diferentes tipos de displasias esqueléticas letais bem como suas etiologias;
2. Descrever as principais características epidemiológicas dessa casuística;
3. Investigar por meio do estudo do exoma duas famílias com dois fetos portadores do mesmo fenótipo letal ainda inédito na literatura e tentar estabelecer suas bases moleculares.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Casuística
Os dados dos indivíduos incluídos no presente estudo fazem parte dos arquivos do grupo local dedicado ao estudo das displasias esqueléticas e incluem também dados do Programa de Genética Perinatal. A presente casuística inclui todas as OCD letais diagnosticadas no período de 1990 a 2016 (26 anos).
Foram incluídos os fetos e recém-nascidos (RN) com diagnóstico radiológico de displasia esquelética letal. Para os RN vivos, foram incluídos apenas aqueles cujo óbito ocorreu até o 28º dia.
O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 1) previamente aprovado pelo comitê de ética local (Anexo 2) foi aplicado a todos os pacientes investigados no presente projeto.
Todos os casos de displasias esqueléticas letais incluídos nesse trabalho foram revisados a partir de fichas clínicas do grupo de displasia esquelética, da documentação fotográfica e dos exames radiológicos. As seguintes variáveis foram introduzidas em planilha de análise específica: dados antropométricos do propósito ao nascimento (comprimento, peso, perímetro cefálico e torácico), sexo, vitalidade ao nascimento, idade de óbito, dados de pré-natal (realização de US pré-natal, suspeita diagnóstica), idade gestacional, idades materna e paterna, consanguinidade parental, recorrência na família, local de nascimento dos pais, local de nascimento dos avós maternos e paternos, diagnóstico clínico-radiológico, diagnóstico molecular. A relação de todas as variáveis, com suas respectivas definições, se encontra no apêndice 1.
Além disso, os dois fetos com fenótipos idênticos e inéditos foram detalhadamente descritos e submetidos ao estudo do exoma.
3.2. Métodos
3.2.1. Estudo epidemiológico
A obtenção das variáveis mencionadas no item anterior foi feita a partir da revisão de fichas clínicas (Anexo 3), bem como de prontuários hospitalares quando necessário. As variáveis foram avaliadas de forma descritiva, analisando-se
prevalência (método da Binomial Exata; Intervalo de Confiança=95%), média, mediana e desvio padrão.
3.2.2. Sequenciamento do exoma
A integridade do DNA dos indivíduos selecionados foi testada por eletroforese em gel de agarose 1%. O padrão de pureza foi aferido com um espectrofotômetro da marca Epoch e valores de taxa de absorbância 260/280nm que se encontrem entre 1.8 e 2.0 foram considerados como ideais para a construção da biblioteca de éxons.
Dada a disponibilidade de material biológico, a abordagem de estudo de trios foi utilizada e, propósito, pai e mãe das duas famílias foram submetidas ao sequenciamento do exoma. Para o preparo e corrida do exoma este projeto utilizou-se de um laboratório facility – Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho (LaCTAD) da UNICAMP. O kit utilizado para o enriquecimento dos éxons e preparação das bibliotecas foi o Nextera® Rapid Capture Exome (Illumina©) e a plataforma utilizada foi o HiSeq 2500 (Illumina©). As amostras foram multiplexadas para que pudessem ser submetidas ao sequenciamento na mesma “lane". O sequenciamento foi realizado em 2x100pb (paired ends) com cobertura mínima de 150X (mais de 95% dos SNPs são identificados com esta taxa de cobertura).
3.2.3. Bioinformática
A primeira etapa da análise de bioinformática consistiu em filtrar as sequencias (reads) geradas pelo Illumina HiSeq 2500 usando o programa NGSToolkit (54), que remove adaptadores e sequências de baixa qualidade. Sequências que possuíam menos de 70% das bases com nota Phred menor ou igual a 20 foram descartadas.
Os reads filtrados de cada exoma foram alinhados com o genoma de referência (Homo Sapiens, hg19 - Genome Reference Consortium GRCh37), utilizando o programa BWA (55) sem alteração nos parâmetros. Os arquivos de saída foram gravados em formato “.bam”. Após o alinhamento o programa SAMtools (56) foi utilizado para remover duplicatas de PCR dos resultados de alinhamento.
A identificação de SNPs foi realizada usando o programa GATK (Genome Analysis ToolKit) (57,58). O programa executa 4 etapas, sendo: i) realinhamento local; ii) recalibragem do score de qualidade das bases; iii) chamada de SNPs; iv)
recalibragem dos SNPs identificados visando separar SNPs verdadeiros de artefatos. Foram filtrados SNPs com GQ (Genotype quality) menores que 20 e ao mesmo tempo DP (cobertura de reads) menores que 20 em todas as amostras.
O PhenoDB é um banco de dados gratuito robusto que coleta, armazena e analisa dados fenotípicos padronizados na abordagem de exomas e genomas para a identificação de genes candidatos em doenças mendelianas (59). Essa ferramenta de análise foi aplicada para filtrar e priorizar as variantes raras em cada trio (pai, mãe e propósito) em cada modelo de herança aplicável.
A ferramenta de análise de variantes Ingenuity (Qiagen Bioinformatics) permite associar filtros e contextos biológicos para análise de variantes candidatas e classifica utilizando uma pontuação CADD (do inglês – Combined Annotation-Dependent Depletion) a patogenicidade das alterações. Variantes funcionais possuem pontuação ≥10; variantes prejudiciais (deletérias) ≥20 e por fim variantes humanas patogênicas possuem pontuação ≥30 (60).
O programa IGV (Integrative Genomics Viewer), um visualizador de alto desempenho que lida eficientemente com grandes conjuntos de dados heterogêneos, foi utilizado para investigação e confirmação visual das variantes selecionadas.
Para análise de frequência populacional das variantes selecionadas após as etapas de filtragem, foram utilizados além dos bancos de dados convencionais [1000 Genomes (61), ExAC – Exome Aggregation Consortium (62)], um arquivo recente baseado especificamente em variantes genômicas brasileiras, o ABraOM (Arquivo Brasileiro Online de Mutações) (63).
Durante o período das análises, obteve-se acesso a um arquivo VCF de um exoma do paciente 123 realizado em colaboração prévia com um laboratório de Lausanne – Suíça e o mesmo foi adicionado, com filtro semelhante ao utilizado nos VCFs locais, às análises subsequentes e foi codificado como Pac.123-F (Paciente 123-Fora).
Um resumo geral das etapas de análises utilizando os arquivos VCF pode ser observado na figura 1.
Figura 1. Fluxograma geral simplificado das análises realizadas utilizando os arquivos VCF.
3.2.4. Análises do exoma
Etapa 1.
Todos os arquivos VCF individuais foram solicitados ao LaCTAD para que a análise de cada trio pudesse se dar de maneira independente. Inicialmente, o processo de filtragem utilizou a ferramenta PhenoDB e uma tabela foi gerada para cada padrão de herança (autossômico dominante de novo, autossômico recessivo heterozigoto composto e autossômico recessivo homozigoto). Foi priorizado um modelo autossômico dominante de novo, pois, não há relato de consanguinidade
entre os pais, ambas as famílias não são relacionadas, a idade paterna é avançada em ambos os casos e se trata de um fenótipo idêntico, raro e letal. Porém, os demais padrões também foram checados.
Para a localização das variantes, foram consideradas regiões de éxon, splicing, UTR 3’ e UTR 5’. Variantes identificadas nos bancos de dados db126, db129 e db131 e marcadores cujas frequências do alelo raro [MAF (minor allele frequency)] foram maiores que 1%, segundo o 1000 Genomes foram removidas. A primeira análise manual consistiu em combinar os arquivos de ambos os trios para que, em cada modelo específico de herança, fosse possível observar apenas as variantes que estejam presentes em ambos os propósitos, ou ainda, nos mesmos genes. Para informações sobre como cada variante foi selecionada, correspondente à cada padrão de herança, vide apêndice 1 - glossário.
Etapa 2.
A filtragem seguinte baseou-se na verificação de todos os genes associados à fenótipos de displasias esqueléticas letais já descritos (Quadro 2) utilizando o programa IGV.
Quadro 2. Genes associados à OCDs letais analisados na etapa 2 da análise do exoma.
Genes
FGFR3 SOX9 COL1A2
COL2A1 LIFR CRTAP
COL11A1 FAM111A TRIP11
SLC26A2 CANT1 SLC35D1 HSPG2 XYLT1 GPX4 FLNA LBR INPPL1 FLNB PTHR1 LEPRE1 TRPV4 FAM20C ALPL DYNC2H1 WTX CASR WDR35 COL1A1 IFT122 TCTN3 Etapa 3.
A corrida de exoma das seis amostras enviadas ao LaCTAD não obteve um bom rendimento e um número de reads foi abaixo do esperado, resultando em regiões pouco cobertas. A cobertura geral do arquivo VCF recebido posteriormente é
melhor, com uma média de cobertura de 44 reads por região de interesse, assim, optou-se por prosseguir as análises tendo-o como arquivo predominante. Os arquivos locais (BAM, VCF) permaneceram sendo utilizados para contra-checagem das variantes encontradas no arquivo externo.
O arquivo VCF Pac.123-F possui 87.212 variantes. O passo seguinte foi filtrar esse número de variantes, a partir de características clínicas dos próprios propósitos e selecionar genes envolvidos em processos patogênicos conhecidos ou previstos nessas vias de interesse. Foram utilizados dois filtros: Amplo – para aqueles genes associados à hidropisia fetal, morte perinatal, ossificação, ossificação anormal de corpos vertebrais ou doenças compatíveis com esses fenótipos; Restrito – para aqueles genes associados à hidropisia fetal, morte perinatal, ossificação, atraso no início da mineralização do ísquio, hipoplasia de escápulas, micromelia, ossificação anormal de corpos vertebrais, tórax estreito ou doenças compatíveis com esses fenótipos.
Etapa 4.
Ainda analisando o VCF 123-F, o passo seguinte foi filtrar as variantes de acordo com Patel e colaboradores (64): cobertura ≥ 15x, excluídas variantes com a média de frequência máxima menor ou igual a 0,05, região gênica alvo foram os éxons e foram priorizadas mutações missenses ausentes em dbSNP e HGMD.
Etapa 5.
No período das análises, os pais do paciente 101 relataram nova gestação com recorrência para o fenótipo letal inédito. Esse evento mudou o panorama de análises e um modelo de herança autossômico recessivo foi priorizado. Utilizando o VCF 123-F foram priorizadas: regiões exônicas, alterações em heterozigose ou homozigose (excluindo sinônimas), mantidas variantes com cobertura ≥10 reads, foram removidas alterações “toleradas” e benignas” nos campos de análise do SIFT e PolyPhen, respectivamente. Função e características dos genes oriundos dessa análise foram checadas utilizando o GeneCards® (Human Gene Database). Nessa etapa, a ferramenta Ingenuity também foi utilizada para se obter as pontuações de patogenicidade CADD.
4. RESULTADOS
4.1. Estudo epidemiológico
A revisão dos arquivos do Grupo de Displasia Esquelética identificou 156 indivíduos registrados com o diagnóstico de OCD letal. Desse total, 25 foram eliminados – 23 por apresentarem uma sobrevida maior do que 28 dias e 2 por falta de registros de raio-X para reavaliação da condição. Portanto, 131 casos foram incluídos no presente estudo. Entre os casos avaliados, 75 (57,3%) nasceram na maternidade do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM) e 56 (42,7%) em outros hospitais. Desses, 31 (55,4%) embora tenham nascido fora, as respectivas famílias foram avaliadas localmente. Por último, 25 casos (44,6%) foram referidos ao grupo local, em geral com exame de Raio-X e poucos dados clínicos, para auxílio na avaliação/comprovação diagnóstica. Entre os nascidos no CAISM (n=75) a prevalência de OCD letais foi de 9,40 (IC=7,40-11,79) a cada 10.000 nascimentos.
Dos 120 casos com informação de peso ao nascimento, 16,7% (n=20) apresentaram um peso extremamente baixo ao nascimento (<1.000g), 13,3% (n=16) um peso muito baixo (<1.500g) e 42,5%, a maioria dos casos (n=51), apresentaram um baixo peso no nascimento (<2.500g). O restante dos casos (27,5%; n=33) estão distribuídos entre 2.505g e 4.160g. A tabela 2 resume os valores encontrados para as principais medidas realizadas ao nascimento dos propósitos.
Tabela 2. Média, mediana e desvio-padrão da idade gestacional e principais medidas antropométricas ao nascimento dos indivíduos da casuística.
n Média Mediana DP
Idade gestacional (semanas) 126 32,8 34 4,8
Peso (g) 120 1922,7 1855 859,8
Comprimento (cm) 105 34,2 35 6,3
Perímetro cefálico (cm) 89 32,1 32,5 5,5
A razão de sexo foi de 1,43 [77 do sexo masculino e 54 do sexo feminino]. Dos 126 casos com informação sobre idade gestacional ao nascimento, 73% (n=92) foram gestações pré-termo (<37 semanas) e 27% (n=34) das gestações foram à termo (37 a 42 semanas). A comparação entre as idades gestacionais do grupo dos fetos submetidos à interrupção legal da gestação (ILG) ou natimorto por ILG (NM-ILG), natimortos (NM) e os óbitos neonatais (ON) pode ser observada na tabela 3.
Tabela 3. Idade gestacional dos recém-nascidos/fetos em relação ao tipo/período do óbito.
Idade Gestacional
Recém-nascido/Feto n Média Mediana DP
NM-ILG 16 27,4 27 4,9
NM 38 31,3 32 4,5
ON 72 34,8 36 3,7
NM-ILG: natimorto pós interrupção legal da gestação. NM: natimorto. ON: óbito neonatal. DP: desvio-padrão. n: número avaliado.
Com relação à vitalidade, dos 131 casos, 56 foram NM e 75 ON. Dos 56 NM, 16 foram ILG. Entre os ON, 45 morreram no primeiro dia, 11 entre o segundo e 14º dia e 7 casos morreram entre 15 e 28 dias. A informação de idade de óbito não pôde ser recuperada para 12 casos entre os ON. (Figura 2).
Figura 2. Resumo das informações obtidas da vitalidade ao nascimento e idade de óbito dos propósitos estudados.
Na presente casuística, a média de idade materna foi de 28 anos e a paterna, 33,1 anos.
Tabela 4. Informações referentes à média, mediana e desvio-padrão de idade materna e paterna ao nascimento do propósito.
n Média Mediana DP
Idade materna 120 28 28,5 5,7
Idade paterna 111 33,1 32 7,2
n: número estudado. DP: desvio padrão.
Em relação ao diagnóstico pré-natal, em 114 casos (87%) houve suspeita diagnóstica associada à OCD e, dentre esses, em 87 (76,3%) a hipótese foi de um prognóstico letal. Para 61 casos onde foi possível recuperar informações sobre a situação do líquido amniótico, em 47 (77%) foi registrado polidrâmnio. Para 105 casos, a descrição do exame de ultrassonografia foi analisada e, dentre esses, 92 (87,6%) apresentaram como achado principal ossos longos encurtados e 80 (76,2%) tórax estreito. Outros achados diferenciais foram relatados e podem ser observados na tabela 5.
Tabela 5. Achados no exame de ultrassonografia dos casos avaliados e diagnóstico final da OCD associada.
Achados/Descrição no US (N=105) Tipo de OCD
Hidropisia (n=17) Acondrogênese tipo IB (1) Acondrogênese tipo II (1) Condrodisplasia punctata (1) D. de Desbuquois tipo II (1) S. Oral-facial-digital (1)
Osteogênese imperfeita tipo IIA (6) S. costela curta polidactilia tipo III (3) S. costela curta polidactilia tipo IV (1) OCD-Inédita 1 (2)
Fraturas em ossos longos (n=16) Osteogênese imperfeita tipo IIA (11) Osteogênese imperfeita tipo IIC (1) Osteogênese imperfeita tipo III (3) Osteogênese imperfeitaI-Like (1) Hipomineralização óssea (n=16) Acondrogênese tipo IA (1)
Acondrogênese tipo II (1) D. CYP26B1 (1)
Osteogênese imperfeita tipo IIA (10) Osteogênese imperfeita tipo III (2) D. platispondilíaca tipo Torrance (1)
Achados/Descrição no US (N=105) Tipo de OCD
Platispondilia (n=12) Acondrogênese tipo IA (1) Acondrogênese tipo IB (1) D. de Blomstrand (1) D. tanatofórica tipo I (3) D. tanatofórica tipo II (1)
Osteogênese imperfeita tipo IIA (1) Opsismodisplasia (1)
D. espondiloepifisária congênita (1) S. costela curta polidactilia tipo III (2) Pé torto (n=9) Atelosteogênese tipo II (1)
D. campomélica (2) D. de Desbuquois tipo I (1)
Osteogênese imperfeita tipo IIA (1) Osteogênese imperfeita tipo IIB (1) S. costela curta polidactilia tipo II (1) OCD inédita 1 (1)
OCD inédita 2 (1)
Hidrocefalia (n=7) Condrodisplasia punctata (1) D. tanatofórica tipo II (2)
Osteogênese imperfeita tipo IIA (4) Fraturas em costelas (n=7) Osteogênese imperfeita tipo IIA (5) Osteogênese imperfeita tipo IIB (1) Osteogênese imperfeita tipo III (1) Polidactilia (n=6) Sensenbrenner (1)
S. costela curta polidactilia tipo III (4) S. costela curta polidactilia tipo IV (1) Onfalocele (n=2) D. de Desbuquois tipo I
S. costela curta polidactilia tipo III
US: ultrassonografia. OCD: osteocondrodisplasia. D: displasia.S: síndrome.
Dentre os casos, em 80 (61,1%) foi levantada uma hipótese diagnóstica específica, sendo a displasia tanatofórica a principal suspeita (42 casos; 52,5%), seguida da osteogênese imperfeita (26 casos; 32,5%). Desses 80 diagnósticos específicos no pré-natal, em 51 fetos (63,8%) o diagnóstico se confirmou na avaliação pós-natal e em 29 (36,2%) os diagnósticos foram discordantes. A tabela 6 resume os diagnósticos sugeridos no pré-natal, bem como quantos estavam corretos e, em caso de discordância, qual foi o diagnóstico final pós-natal.
