UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DIELLE PIEROTTI PROCOPIO
ESTUDO DA EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE CELULASES DE ACREMONIUM STRICTUM EM LINHAGENS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE VISANDO A
PRODUÇÃO DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO
Campinas 2017
DIELLE PIEROTTI PROCOPIO
ESTUDO DA EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE CELULASES DE ACREMONIUM STRICTUM EM LINHAGENS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE VISANDO A
PRODUÇÃO DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Engenharia de Alimentos.
Orientador: FRANCISCO MAUGERI FILHO Coorientadora: ROSANA GOLDBECK
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA DIELLE PIEROTTI PROCÓPIO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. FRANCISCO MAUGERI FILHO.
Campinas 2017
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2015/02007-8
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Márcia Regina
Garbelini Sevillano - CRB 8/3647
Procópio, Dielle Pierotti, 1989-
P942e Estudo da expressão heteróloga de celulases de Acremonium strictum em linhagens de Saccharomyces cerevisiae visando a produção de bioetanol de segunda geração / Dielle Pierotti Procópio. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
Orientador: Francisco Maugeri Filho. Coorientador: Rosana Goldbeck. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Expressão heteróloga. 3. Celulases. 4. Bagaço de cana. 5. Bioetanol. I. Maugeri Filho, Francisco,1952-. II. Goldbeck, Rosana,1982-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Study of heterologous expression of cellulases of Acremonium
strictum in Saccharomyces cerevisiae strains aimed at second generation bioethanol production
Palavras-chave em inglês:
Saccharomyces cerevisiae
Heterologous expression Cellulase Sugarcane bagasse
Bioethanol
Área de concentração: Engenharia de Alimentos Titulação: Mestra em Engenharia de Alimentos Banca examinadora:
Francisco Maugeri Filho [Orientador] Gabriela Alves Macedo
Osmar Vaz de Carvalhlo Netto Data de defesa: 31-03-2017
COMISSÃO EXAMINADORA
____________________________________________________ Prof. Dr. Francisco Maugeri Filho
(FEA/UNICAMP) – Orientador
____________________________________________________ Profa. Dra. Gabriela Alves Macedo
(FEA/UNICAMP) – Membro Titular
____________________________________________________ Dr. Osmar Vaz de Carvalho Netto
(GRANBIO – BIOCELERE) – Membro Titular
____________________________________________________ Prof. Dr. Adriano Pinto Mariano
(FEQ/UNICAMP) – Membro Suplente
_____________________________________________________ Dra. Jaciane Lutz Ienczak
(CENTRO NACIONAL DE PESQUISA EM ENERGIA E MATERIAS) – Membro Suplente
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho às pessoas que fazem esta minha jornada mais feliz: meus pais, Rosemary e Geraldo,
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Departamento de Engenharia de Alimentos e à UNICAMP por me acolherem e permitirem meu desenvolvimento profissional e pessoal.
Agradeço ao Prof. Dr. Francisco Maugeri Filho pela orientação, dedicação, amizade, confiança, pela oportunidade oferecida e, claro, pelo grande ensinamento científico durante esses dois anos.
Agradeço à Prof. Dr. Rosana Goldbeck pela co-orientação, pela infinita disponibilidade, pela amizade e por todo ensinamento, contribuindo muito para meu conhecimento científico.
Agradeço ao Dr. Gleidson Silva Teixeira pelas contribuições e pelos ensinamentos e, também a toda equipe do Laboratório de Genômica e Expressão (LGE/IB), em especial Juliana Pimentel Galhardo e Alessandro Coradini, pelos auxílios e pela amizade, todos foram fundamentais ao meu aprendizado.
Agradeço à Drª. Priscila Hoffmann e Drª. Fátima Aparecida de Almeida Costa (Fifa) por sempre estavam dispostas a ajudar na realização do meu trabalho e pela tranquilidade como o fizeram.
Agradeço a toda equipe do Laboratório de Engenharia Metabólica e Bioprocessos (LEMeB), pessoas maravilhosas que se tornaram grandes amigos e que sempre participaram do meu projeto. Em Especial, quero agradecer a Daniele, colega de laboratório, que sempre esteve disposta a ajudar, seja com os fermentadores, HPLC ou conselhos e a Patrícia pela amizade e auxílio nas horas de necessidade.
Agradeço aos professores do Programa de Pós Graduação em Engenharia de Alimentos, pelas disciplinas oferecidas e aos funcionários da secretaria, Fredi e Reinaldo, pela amizade, conversas e pelos serviços prestados.
Agradeço aos membros da banca, pelo aceite do convite, pelas correções e sugestões que contribuíram muito para este trabalho.
Agradeço à FAPESP pela concessão da bolsa de mestrado e financiamento do projeto. Agradeço aos amigos e colegas que ingressaram comigo no Programa de Pós Graduação, pelo acolhimento e pelas conversas descontraídas.
Agradeço imensamente a minha família, pelo apoio incondicional, incentivo e amor. À minha mãe Rosemary pelos ensinamentos, inspiração e grande incentivo a seguir os meus sonhos. Ao meu pai Geraldo pelos incentivos e estímulos à seperação. Ao meu irmão Diego pelo apoio e amizade. Ao meu namorado Ronaldo pelo incentivo, carinho e conforto em todos os momentos.
Aos meus sogros, Vanilda e Pedro, pelo apoio, carinho e paciência. Aos meus tios, Solange e Ronan, por todo incentivo e apoio. Sem vocês eu nada seria... Amo muito vocês!!!
Agradeço a todos os outros amigos que aqui não citei, mas que de alguma forma me ajudaram e estão presentes em meu coração.
Aos Deuses principalmente, que me iluminam e me protegem todos os dias. Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO
A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais utilizado para produção de etanol, por apresentar uma excelente capacidade fermentativa e ser tolerante ao estresse gerado nos processos fermentativos industriais. No entanto, esta levedura não consegue metabolizar carboidratos complexos em etanol, como por exemplo a celulose, componente majoritário do bagaço de cana de açúcar, fazendo-se assim necessária a hidrólise da celulose em glicose, para posterior conversão da glicose em etanol. Neste sentido, a linhagem industrial de S. cerevisiae (Pedra-2) foi transformada com celulases originárias de Acremonim strictum, micro-organismo silvestre isolado do Bioma Brasileiro, visando a produção de etanol de segunda geração através da sacarificação e fermentação simultânea da celobiose, celulose cristalina (AVICEL®) e bagaço de cana de açúcar pré-tratado (145 °C, 12 minutos, 0.5% (v / v) H2SO4). Para a expressão heteróloga foi empregado o vetor pRS426 com marca de seleção para uracila (URA+). Três modelos de vetores foram montados, dois vetores com expressões isoladas das enzimas endoglucanase e β-glicosidase e o terceiro com expressão simultânea das duas enzimas e, apenas as leveduras transformadas com esse vetor, foram submetidas aos testes de sacarificação e fermentação simultânea. As atividades verificadas pelas enzimas foram 0,289 U/mL, endoglucanase, e 0,169 U/mL, β-glicosidase. Quanto às fermentações, foram realizadas empregando combinação de diferentes substratos: AVICEL® (celulose comercial) + glicose, celobiose + glicose, glicose, além de bagaços de cana pré-tratados (ácido 0,5%) + glicose, em condição semi-anaeróbica e anaeróbica, à 37ºC durante 120 horas. As fermentações conduzidas em condição semi-anaerobiose não apresentaram bons rendimentos de etanol, comparando as fermentações empregando meio complexo com o controle, empregando apenas glicose. As concentrações de etanol não apresentaram diferença a 5% de significância. Com o propósito de favorecer a fermentação alcóolica, foram realizadas fermentações em anaerobiose. Dentre os substratos utilizados, a levedura apresentou melhor velocidade específica de crescimento em AVICEL® + glicose. O maior teor de etanol registrado, 14,930 (g/L) ocorreu às 120 h de fermentação quando empregado glicose + celobiose como fontes de carbono, 53% superior à fermentação conduzida somente com glicose (controle).
ABSTRACT
The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most used microorganism to produce ethanol, because it presents an excellent fermentative capacity and is tolerant to the stress generated in industrial fermentation processes. However, this yeast can’t metabolize complex carbohydrates into ethanol, such as cellulose, the major component of sugarcane bagasse, making it necessary to hydrolyse the cellulose into glucose for subsequent conversion of glucose into ethanol. In this sense, an industrial strain of S. cerevisiae (Pedra-2) was transformed with cellulases from Acremonim
strictum, a wild microorganism isolated from the Brazilian Biome, aiming to the production of
second generation ethanol through simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of cellobiose, cellulose (AVICEL®) and pre-treated sugarcane bagasse (145 °C, 12 minutes, 0.5% (v / v) H2SO4). For the heterologous expression, the vector pRS426 with uracil selection marker (URA +) was used and three vector models were assembled, two of them with isolated expressions of the enzymes endoglucanase and β-glycosidase, and the third one with simultaneous expression of the two enzymes. Only the yeasts transformed with this vector were subjected to simultaneous saccharification and fermentation tests. The enzyme activities were 0.289 U / mL for endoglucanase, and 0.169 U/mL, for β-glucosidase. Regarding the fermentations, they were performed using a combination of different substrates: AVICEL® (commercial cellulose) + glucose, cellobiose + glucose, glucose, as well as pretreated sugarcane bagasse (acid 0,5%) + glucose, in semi-anaerobic and anaerobic conditions, at 37 ° C for 120 hours. The semi-anaerobic fermentations did not present good ethanol yields, comparing the fermentations using complex medium with the control, using only glucose. In order to improve the alcoholic fermentation, processes were carried out in anaerobiosis. In such conditions the yeast showed a better specific growth rate in AVICEL + glucose. The highest ethanol content, 14,930 (g / L) occurred at 120 h of fermentation when glucose + cellobiose was used as carbon sources, representing 53% higher than fermentation conducted with glucose alone (control).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação esquemática da parede celular proposta juntamente com a localização dos componentes principais em biomassa. Adaptado de Murphy e Mccarthy
(2005); Shen et al. (2013)...23
Figura 2 – Estrutura da celulose...24
Figura 3 – Ação sinergética das celulases. Adaptado de Watanabe e Tokuda (2010)...27
Figura 4 – Produção, área e produtividade brasileira de cana de açúcar (FIESP, 2013)...33
Figura 5 – Processo de hidrólize enzimática, perspectiva de integração (HAMELINCK et al. 2005)...40
Figura 6 – Principais características dos processos SSF e SHF, (CHEN e FU, 2016)...41
Figura 7 – Exemplificação da recombinação homóloga...48
Figura 8 - Representação esquemática das principais etapas metogológicas desenvolvidas...49
Figura 9 – Esquema das metodologias aplicadas para a obtenção dos vetores p426>TEF1>g006>CYC1, p426>PGK1>g249>IDP1, p426>TEF1>g006>CYC1>PGK1>g249>IDP1...58
Figura 10 - Esquematização do teste de fenótipo das colônias transformadas com vetores com os genes da endoglucanase, glicosidase e endoglucanase mais β-glicosidase...59
Figura 11 - Esquematização do teste de interferência do oxigênio na atividade das enzimas endoglucanase e β-glicosidase...61
Figura 12 – Esquematização da fermentação em regime semi-anaeróbico com a levedura FGY050 (derivada PE, URA-) transformada com os vetores que contém os genes da endoglucanase, β-glicosidase e endoglucanase mais β-glicosidase, isoladamente...64
Figura 13 – Esquematização da fermentação em regime anaeróbico com a levedura FGY050 (derivada PE, URA-) transformada com os vetores que contém os genes da endoglucanase, β-glicosidase e endoglucanase mais β-β-glicosidase, isoladamente...65
Figura 14 – Fotografia do frasco utilizado para a fermentação em regime anaeróbico...65
Figura 15 - Representação esquemática do método de montagens dos cassetes no vetor pRS426. Tracejados exemplificam regiões de homologia...68 Figura 16 – (A) Mapa do vetor da série pRS, construído por Mumberg et al. (1995). (B) e (C) Representação esquemática dos vetores pRS423-g006 (endoglucanase) e pRS423-g249
(β-glicosidase), respectivamente, com simulação dos pontos de clivagem das enzimas SacI e KpnI. O cassete TEF1>g006>CYC1 não sofreu lise por ação das enzimas SacI e KpnI, em contrapartida o g249 sofreu duas clivagens...70 Figura 17 - Resultado da digestão dos vetores pRS423-gene006 e pRS423-gene249. Para a digestão foram usadas duas enzimas de restrição, SacI e KpnI. Tamanhos esperados: pRS423-006 (5797bp, 2832bp) e pRS423-249 (5698bp, 1789bp, 1076bp, 41bp)...72 Figura 18 - (A) Resultado da amplificação do cassete TEF1>g006>CYC1 pelos primers DPP_001 e DPP_002, para a montagem do vetor p426>TEF>006. Tamanho esperado, 2984bp. (B) Resultado da amplificação do cassete TEF1>g006>CYC1 pelos primers DPP_001 e DPP_003, para a montagem do vetor p426>TEF>006>CYC>PGK>249>IDP. Tamanho esperado, 2984bp. (C) Resultado das amplificações do gene da β-glicosidase pelos primers DPP_006 e DPP_007, para a montagem do vetor p426>PGK>249 e do vetor p426>TEF>006>CYC>PGK>249>IDP. Tamanho esperado, 2172bp. (D) Resultado da amplificação do promotor PGK pelos primers DPP_004 e DPP_005, utilizado na montagem do vetor p426>PGK>249. Tamanho esperado, 929bp. (E) Resultado da amplificação do promotor PGK pelos primers DPP_005 e DPP_010, utilizado na montagem do vetor p426>TEF>006>CYC>PGK>249>IDP. Tamanho esperado, 929bp. (F) Resultado da amplificação do terminador IDP1 pelos primers DPP_008 e DPP_009, utilizado na montagem do vetor p246>PGK>249 e p426>006>249. Tamanho esperado, 245bp. Para amplificação das partes foram utilizadas enzimas DNA polimerases de alta especificidade, evitando assim eventuais mutações causadas durante a reação de PCR...75 Figura 19 - Resultado da digestão dos vetores pRS426. Para a digestão foram usadas duas enzimas de restrição, BamHiI Tamanho esperado: 5660bp...77 Figura 20 - (A) Confirmação da montagem do vetor p426>TEF1>g006>CYC1. Nessa amplificação foram utilizados os pares de primers 3’CCGAGAAGGTCGTCAGAGTC5’ e 3’CATGGTCATAGCTGTT5’. Tamanho esperado, 1104bp. (B) Primeira confirmação do vetor p426>PGK1>g249>IDP1. Nessa amplificação foram utilizados os pares de primers 3’GCAAACGCCAACGAAAAC5’ e 3’CATGGTCATAGCTGTT5’. Tamanho esperado, 1024pb. (C) Segunda confirmação do vetor p426>PGK1>g249>IDP1. Nessa amplificação foram utilizados os pares de primers 3’GTAAAACGACGGCCAGT5’ e 3CTTTTTACAACAAATATAAAACAATGTATCACAAGACTCTCGCAGCATTC5’. Tamanho esperado, 974pb. (D) Primeira confirmação do vetor p426>TEF1>g006>CYC1>PGK1>g249>IDP1. Nessa amplificação foram utilizados os pares
de primers 3’ACTGGCCGTCGTTTTAC5’ e 3’TGGGGTGATGTTAGTCCATTC’5. Tamanho esperado, 1466pb. (E) Segunda e terceira confirmação do vetor p426>TEF1>g006>CYC1>PGK1>g249>IDP1. Nessa amplificação foram utilizados os pares de primers 3’GCAAACGCCAACGAAAAC5’ e 3’CATGGTCATAGCTGTT5’, 3’ CCGAGAAGGTCGTCAGAGTC5’ e 3’GGAACGGACAGGTTTCTCAG5’. Tamanhos esperados, 1024pb e 2771pb ...79 Figura 21 – (A) Resultado da digestão dos vetores p426>TEF1>g006>CYC1 (Plasmídeo 1), p426>PGK1>g249>IDP1 (Plasmídeo 2) . Para a digestão foi usada a enzima de restrição. Tamanho esperado: 5660bp. (B) Resultado da digestão dos vetores p426>TEF1>g006>CYC1>PGK1>g249>IDP1 (Plasmídeo 3). Para a digestão foi usada a enzima de restrição NedI. Tamanhos esperados: 5672bp, 3840bp, 2318bp...81 Figura 22 - (A) Amplificação do cassete TEF1>g006>CYC1 clonado no vetor pRS426 com
os pares de primer
3’TAGAAACATTTTGAAGCTATGGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATAT5’ e
3’TCGAAGGCTTTAATTTGCGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGC5’, e do cassete PGK1>g249>IDP1 também clonado no vetor pRS426 com os pares de primer 3’
CAACTAAAAGCAATTACAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATC5’ e
3’CAAGTTCGGATCATTACCATCGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCAC5’. (B) Cassetes amplificados com extremidades homólogas entre si e o vetor pRS426. (C) Vetor
pRS426>g006>g249 montado via recombinação
homóloga...82 Figura 23 – Atividade de endoglucanase para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando meio YNB (URA-) e Glicose 2% (A), Glicose 2% + CMC 0,5% (B), Glicose 2% + Celobiose 2% (C) como fontes de carbono em experimentos distintos. P3C2 = plasmídeo 3/ colônia 2; P3C11 = plasmídeo 3/ colônia 11. P3 = p426>TEF1>g006>CYC1>PGK1>g249>IDP1, Pvazio = p426 sem enzima...85 Figura 24 – Atividade de β-glicosidase para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando meio YNB (URA-) e Glicose 2% + CMC 0,5% (A), Glicose 2% + Celobiose 2% (B) como fontes de carbono em experimentos distintos. P3C2 = plasmídeo 3/ colônia 2; P3C11 = plasmídeo 3/
colônia 11. P3 = p426>TEF1>g006>CYC1>PGK1>g249>IDP1, Pvazio = p426 sem enzima...85 Figura 25 – Valores de concentração de células ao longo das 170 horas de fermentação em meio líquido YNB (Yeast Nitrogen Base) 0,67% sem a presença do aminoácido uracila (URA), em regime aeróbico, empregando como fonte de carbono: (A) CMC 0,5 % + glicose e CMC 0,5%, %; (B) celobiose 2% + glicose e celobiose 2%; (C) CMC 0,5 % + celobiose 2% + glicose e CMC 0,5% + celobiose 2%, em experimentos distintos...87 Figura 26 – Valores de concentração de células (g/L) ao longo das 18 horas de fermentação em meio YNB (URA-) quando empregado glicose 2%...89 Figura 27 – Concentração de células (g/L) ao longo das 72 horas de fermentação quando empregado glicose 2%, CMC 0,5 % + glicose 2%, celobiose 2% + glicose 2% e AVICEL® 2% + glicose 2%...89 Figura 28 – Atividade de β-glicosidase (U/mL) para as fermentações realizadas com a S.
cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando
meio YNB sem a presença do aminoácido uracila (URA-), utilizando glicose 2% + CMC 0,5%, glicose 2% + celobiose 2% e glicose 2% + AVICEL® 2% como fontes de carbono em experimentos distintos...97 Figura 29 – Atividade de β-glicosidase (U/mL) para as fermentações realizadas com a S.
cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando
meio YNB sem a presença do aminoácido uracila (URA-), utilizando glicose 2% + CMC 0,5%, glicose 2% + gelobiose 2% e glicose 2% + AVICEL® 2% como fontes de carbono em experimentos distintos...90 Figura 30 – Atividade de endoglucanase (U/mL) e de β-glicosidase (U/mL) para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em semi-anaerobiose utilizando meio YNB sem a presença do aminoácido uracila (URA-), utilizando glicose 2% + CMC 0,5%, glicose 2% + celobiose 2% e glicose 2% + AVICEL® 2% como fontes de carbono em experimentos distintos...94 Figura 31 – Concentração de células (g/L) e variação de pH para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando meio YNB sem a presença do aminoácido uracila (URA-), utilizando glicose 2% + CMC 0,5% como fonte de carbono...94 Figura 32 – Concentração de células (g/L) e variação de pH para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose
utilizando meio YNB sem a presença do aminoácido uracila (URA-), utilizando glicose 2% + AVICEL® 2% como fonte de carbono...95 Figura 33 - Concentração de etanol (g/L) para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando meio YNB sem a presença do aminoácido uracila (URA-), utilizando glicose 2% e glicose 2% + AVICEL® 2% como fontes de carbono em experimentos distintos...96 Figura 34 - Concentração de etanol (g/L) e glicose (g/L) para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando meio YNB sem a presença do aminoácido uracila (URA-), adicionado de solução tamponate, utilizando glicose 2%, como fonte de carbono...97 Figura 35 - Concentração de etanol (g/L) e glicose (g/L) para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando meio YNB sem a presença do aminoácido uracila (URA-), adicionado de solução tamponate, utilizando glicose 2% + AVICEL®, como fonte de carbono...98 Figura 36 – Atividade de Endoglucanase em relação ao tempo de fermentação da linhagem industrial FGY050 (URA-, derivada PE) geneticamente modificada com genes de celulase quando cultivada em aerobiose utilizando definido de acordo com Verduyn et al (1992) sem a presença do aminoácido uracila (URA-), utilizando glicose 2%, glicose 2% + celobiose 2%, glicose 2% + AVICEL® 2%, glicose 2% + bagaço pré-tratado com ácido (0,5% v/v) 5% e glicose 2% + bagaço pré-tratado com ácido (0,5% v/v) 10% como fontes de carbono em experimentos distintos...99 Figura 37 – Atividade de β-glicosidase em relação ao tempo de fermentação da linhagem industrial FGY050 (URA-, derivada PE) geneticamente modificada com genes de celulase quando cultivada em aerobiose utilizando definido de acordo com Verduyn et al (1992) sem a presença do aminoácido uracila (URA-), utilizando glicose 2%, glicose 2% + celobiose 2%, glicose 2% + AVICEL® 2%, glicose 2% + bagaço pré-tratado com ácido (0,5% v/v) 5% e glicose 2% mais bagaço pré-tratado com ácido (0,5% v/v) 10% como fontes de carbono em experimentos distintos...100
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Principais bactérias produtoras de celulases...30 Tabela 2 - Oligos utilizados na amplificação das sequências gênicas de interesse...52 Tabela 3 – Descrição da reação de PCR de colônia em Veriti® 96-Well Thermal Cycler...55 Tabela 4 – Meio de cultura e fontes de carbono dos inóculos das leveduras transformadas com os vetores gene006-p426, gene249-p426, gene006-gene249-p426 e o vetor pRS426 vazio, com os melhores fenótipos...67 Tabela 5 – Guia de montagem dos plasmídeos...92 Tabela 6 – Resultados das concentrações de glicose, celobiose, etanol e biomassa para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada sob microaeração utilizando meio YNB (URA-) e (glicose, glicose + celobiose, glicose + AVICEL®) como fontes de carbono em experimentos distintos...93 Tabela 7 – Resultados das concentrações de glicose, celobiose, etanol e biomassa para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em anaerobiose utilizando meio YNB (URA-) e (glicose, glicose + calobiose, glicose + AVICEL®) como fontes de carbono em experimentos distintos...101 Tabela 8 – Concentração de glicose (g/L), celobiose (g/L) e etanol (g/L) das fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando definido de acordo com Verduyn et al (1992) sem a presença do aminoácido uracila (URA-), utilizando glicose 2%, glicose 2% + celobiose 2%, glicose 2% + AVICEL® 2%, glicose 2% + bagaço pré-tratado com ácido (0,5% v/v) 5% e glicose 2% + bagaço pré-tratado com ácido (0,5% v/v) 10% como fontes de carbono em experimentos distintos...102 Tabela 9 – Valores dos parâmentros cinéticos µmáx (velocidade específica máxima de crescimento), YX/S (fator de conversão de substrato em biomassa) e YP/S (fator de conversão de substrato em produto) para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em semi-anaerobiose utilizando meio YNB (URA-) e (glicose, glicose + celobiose, glicose + AVICEL®) como fontes de carbono em experimentos distintos...110
SUMÁRIO ABSTRACT ... 9 1. INTRODUÇÃO ... 19 2. OBJETIVOS ... 22 2.1. Objetivo geral ... 22 2.2. Objetivos específicos ... 22 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 22 3.1. Biomassa lignocelulósica ... 22 3.2. Enzimas celulolíticas ... 25
3.3. Microrganismos produtores de celulases ... 30
3.4. Histórico da produção de etanol no Brasil ... 32
3.5. Produção de bioetanol ... 34
3.5.1. Etapas de produção do etanol de segunda geração ... 35
3.5.1.1. Pré-tratamento ... 35
3.5.1.2. Hidrólise ... 37
3.5.1.3. Fermentação ... 38
3.5.1.4. Destilação ... 42
3.6. Engenharia genética... 42
3.6.1. Expressão heteróloga de celulase em Saccharomyces ceresisae ... 45
3.6.2. Recombinação homóloga ... 47
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 48
4.1. Isolamento dos genes da endoglucanase (g006) e β-glicosidase (g249) ... 49
4.2. Amplificação das sequências de interesse ... 51
4.3. Montagem dos vetores via recombinação homóloga ... 52
4.4. Extração do DNA plasmidial dos transformantes positivos da linhagem S. cerevisiae laboratorial BY4741 ... 53
4.5. Transformação dos vetores gene006-p426, gene249-p426 e gene006-gene249-p426
em Escherichia coli ... 54
4.5.1. Preparo de células eletrocompetentes ... 54
4.5.2. Diálise do DNA ... 54
4.6. Validação das montagens dos vetores p426, gene249-p246 e gene006-gene249-pRS426 ... 55
4.7. Extração dos vetores gene006-p426, gene249-p246 e gene006-gene249-pRS426 clonados em células de Escherichia coli ... 55
4.8. Transformação dos vetores gene006-p426, gene249-p426 e gene006-gene249-p426 em Saccharomyces cerevisiae (linhagem industrial FGY050, diploide, ura-)... 57
4.9. Sacarificação e fermentação simultânea em Câmara Incubadora com Agitação Orbital (Shaker) ... 59
4.9.1. Teste para verificação do melhor fenótipo ... 59
4.9.2. Interferência da glicose na ativação das celulases ... 60
4.9.3. Sacarificação e Fermentação Simultânea em condição de micro-aeração ... 61
4.9.4. Sacarificação e Fermentação Simultânea em meio anaeróbico ... 63
4.10. Determinação dos Parâmetros Cinéticos e de Conversão ... 66
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 66
5.1. Construção dos vetores e linhagens ... 67
5.1.1. Isolamento dos genes clonados no vetor pRS423 ... 69
5.1.2. Amplificação e clonagem dos cassetes no vetor pRS426 ... 73
5.1.3. Transformação em S. cerevisiae (linhagem industrial FGY050, derivada PE, URA-)... ... 81
5.2.1. Sacarificação e Fermentação Simultânea em meio YNB sob condição
micro-aeróbico... ... 87
5.2.2. Sacarificação e fermentação simultânea em shaker em regime anaeróbico ... 92
6. CONCLUSÃO ... 105
7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 106
1. INTRODUÇÃO
Segundo dados da BP Statistical Review of World Energy (2016) a produção mundial de barris/dia de petróleo aumentou 3,2% entre os anos de 2014 e 2015, passando de 88,834 milhões de barris/dia para 91,670 milhões de barris/dia. Acompanhando esse aumento houve uma elevação de 1,9% no consumo mundial de petróleo. O aumento do consumo comprova a dependência humana pelos combustíveis não renováveis, já que esses permitem o desenvolvimento da dinâmica operacional da sociedade humana nos seus mais variados aspectos, a começar do bem-estar individual até o desempenho industrial, incluindo os meios de transporte rápidos e eficientes, assim como a viabilização de serviços (BNDES; CGEE, 2008; SILVA, 2010).
O interesse na utilização de fontes alternativas de energia também é crescente, e é impulsionado pela possibilidade da depleção do petróleo, visto que tem ocorrido uma estabilização do número de reservas associado ao efeito nocivo dos gases liberados na queima dos combustíveis derivados de petróleo, intensificadores do efeito estufa e influenciando negativamente a qualidade e o equilíbrio do meio ambiente. Essa busca por fontes renováveis de energia e de alternativas ao uso do petróleo está mobilizando a população e, de forma ímpar, setores acadêmicos, industriais, sociais e governamentais com ênfase no desenvolvimento de processos biotecnológicos de menor impacto ambiental, a fim de se evitar índices de poluição nos grandes centros urbanos que ponham em risco o ecossistema do planeta (PEREIRA Jr. et al., 2008; SILVA, 2010; SALEHI et al., 2012; NUNES et al., 2013). Nesse contexto, os biocombustíveis, como o etanol, têm sido apontados como solução viável para aliviar a pressão exercida pelos combustíveis fósseis e seus derivados (ALMEIDA, 2009; LIMAYEM; RICKE, 2012). Segundo Paludo (2014), outra vantagem atribuída aos biocombustíveis está relacionada à sua baixa toxicidade, biodegradabilidade e renovabilidade, em comparação aos combustíveis derivados do petróleo.
A produção de etanol já foi introduzida em escala industrial, principalmente no Brasil, procedente da cana-de-açúcar, e nos Estados Unidos, procedente do milho. No Brasil, segundo os levantamentos realizados pela Conab – Companhia Nacional de Abastecimento, Conab (2015) e Conab (2016), houve um incremento de 1,9% na produção de etanol entre as safras de 2014/15 (28,66 bilhões de litros) e 2015/16 (29,21 bilhões de litros), porém a safra de 2016/17 houve redução de 8,5% (27,9 bilhões de litros) em razão da preferência pela produção de açúcar, reflexo dos preços mais rentáveis. O etanol já é comercializado em
preços competitivos, além disso, tecnologias como a dos carros bicombustíveis tendem a aumentar ainda mais a sua utilização (LIMAYEM; RICKE, 2012).
A expansão da produção de etanol para satisfazer a demanda energética exigida pelo acelerado crescimento econômico mundial apresenta limitantes, tais como a produção de alimentos e a competitividade frente ao preço do petróleo. Para solucionar esse impasse, os materiais lignocelulósicos, tais como resíduos gerados nos setores agrícolas e florestais, representam uma fonte promissora para a produção de biocombustível, posto que o rendimento teórico para a produção de etanol a partir do bagaço de cana é de aproximadamente 215 Kg de etanol/ tonelada de bagaço, assumindo que apenas as hexoses formadas a partir da degradação da celulose original são fermentadas (RABELO et al., 2011; SALEHI et al., 2012). Além disso, a biomassa apresenta baixo custo de aquisição e não compete com a produção de alimentos, já que não é necessário aumentar a área de plantio de cana de açúcar, no Brasil, para melhorar o rendimento de etanol (BASTOS, 2007; SILVA, 2010; GONÇALVES et al., 2011; SILVA, 2012).
A biomassa celulósica é composta essencialmente por cadeias de celulose unidas entre si por ligações de hidrogênio, hemicelulose e lignina. A celulose é o produto primário da fotossíntese no meio ambiente terrestre, sendo formada por moléculas de glicose ligadas através de ligações β-1,4-glicosídicas. Essas longas fibras celulósicas são, por sua vez, recobertas por hemiceluloses, estas são formadas por polissacarídeos ramificados constituídos principalmente por xilose com pequenas quantidades de L-arabinose, glicose, D-manose, D-galactose, ácidoglucurônico e ácido manurônico e, ligninas. As ligninas são redes poliméricas tridimensionais formadas por unidades fenilpropano interligadas, que são depositadas durante a maturação da parede celular. O complexo formado por lignina, celulose e hemicelulose é conhecido como lignocelulose (BUCHANAN et al., 2003; WYMAN et al., 2005; ZHANG et al., 2006).
As porções celulósicas e hemicelulósicas da biomassa representam em torno de 40 a 50 e 20 a 30% do peso seco das plantas, respectivamente. Estes polissacarídeos podem ser hidrolisados a açúcares fermentescíveis e por sua vez fermentados (LORA, 2002). O processo de hidrólise utiliza tecnologias complexas e multifásicas, e são baseadas no uso de rotas ácidas e/ou enzimáticas para a liberação dos açúcares, gerando glicose (monossacarídeo) e celobiose (dissacarídeo), procedentes da celulose e xilose, arabinose e xilo-oligômeros, a partir da hidrólise da hemicelulose (PEREIRA Jr. et al., 2008).
No entanto, para que o processo de hidrólise seja eficiente é necessário, de acordo com Carrasco et al. (2010), submeter, primeiramente, a biomassa lignocelulósica a um pré-tratamento que facilite o processo enzimático. Os processos de pré-pré-tratamentos de materiais lignocelulósicos podem ser térmicos, químicos, físicos, biológicos ou uma combinação de todos esses, o que dependerá do nível de separação desejado e de sua finalidade (SUN; CHENG, 2002).
Após a etapa de pré-tratamento, a fermentação pode ocorrer sequencialmente à atividade das enzimas celulolíticas ou em conjunto às mesmas. O primeiro processo é denominado de SHF – Hidrólise e Fermentação Separadas e, a segunda operação é designada SSF – Sacarificação e Fermentação Simultâneas, termo este descrito primeiramente por Takagi et al. (1977). A desvantagem do primeiro processo (SHF) é que a atividade da exoglucanase é inibida pela celobiose e a da β-glicosidase pela glicose, diminuindo a eficiência do processo (PHILIPPIDIS, 1993; PALMQVIST; HAHN-HÄGERDAL, 2000). A Sacarificação e Fermentação Simultânea (SSF) surgem como uma alternativa viável ao inconveniente do processo SHF, pois evita o efeito inibidor sobre a sacarificação enzimática pelo produto final. Isso ocorre porque a fermentação e a hidrólise enzimática ocorrem ao mesmo tempo no mesmo recipiente, em função disso as enzimas hidrolisam os polissacarídeos a açúcares e estes são consumidos pela levedura para a produção de etanol, proporcionando melhor rendimento final de etanol (WILKINS et al., 2007; MARTÍN et al., 2008; WANG et al., 2015). Isto representa a principal vantagem deste processo (OLOFSSON et al., 2008). Neste caso, no entanto, as condições ótimas de hidrólise e de fermentação em geral não são coincidentes, o que representa uma desvantagem da técnica.
No que diz respeito à identificação de microrganismos produtores de celulases, ao longo dos anos, contribuições científicas vêm sendo dadas continuamente ao aumento da expressão de celulases por mutações gênicas, à purificação e caracterização de componentes celulósicos, ao entendimento sobre mecanismos de ataque à celulose, clonagem e expressão de genes, determinação de estruturas tridimensionais das celulases e à demonstração do potencial industrial dessas enzimas (BHAT; BHAT, 1997).
Neste trabalho, a fim de aproveitar a Biodiversidade Brasileira daremos continuidade à pesquisa realizada por GOLDBECK (2012) cujo título “Determinação das propriedades lignocelulolíticas e estudo genético de micro-organismos silvestres isolados de diversas regiões brasileiras visando à produção de bioetanol” que durante seu trabalho de doutoramento identificou as sequências dos genes de endoglucanase (gene 006) e
β-glicosidase (gene 249) de Acremonium strictum, micro-organismo silvestre isolado do Cerrado brasileiro. A proposta agora é a expressão heteróloga destes genes em linhagem industrial de S. cerevisiae visando à produção de bioetanol de segunda geração através do processo de sacarificação e fermentação simultânea do bagaço de cana de açúcar. Sendo que, a determinação de sistemas eficazes de expressão de celulase é um dos principais fatores para o sucesso da produção de biocombustíveis (LAMBERTZ et al.; 2014).
2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral
Realizar a expressão heteróloga de celulases originárias de Acremonium strictum (micro-organismo silvestre isolado do Bioma Brasileiro) em linhagens de Saccharomyces
cerevisiae, em linhagem industrial (Pedra-2) visando à produção de etanol de segunda
geração através da sacarificação e fermentação simultânea de bagaço de cana de açúcar.
2.2. Objetivos específicos
Isolar os genes de celulase de Acremonium strictum transformados em Escherichia
coli;
Construir os vetores com genes de interesse via recombinação homóloga; Transformar os genes de celulases em Saccharomyces cerevisiae;
Realizar as fermentações com as leveduras geneticamente modificadas visando à produção de etanol de 2ª geração através do processo de sacarificação simultânea; Avaliar os parâmetros cinéticos das fermentações realizadas.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Biomassa lignocelulósica
A biomassa lignocelulósica é encontrada em diversos tipos de matérias-primas, variando de resíduos urbanos e industriais, madeira e resíduos agrícolas como palha de milho, palha de trigo, palha de arroz e bagaço de cana (CARDONA; SANCHEZ, 2007; CHEN; FU, 2016).
O material lignocelulósico é um composto derivado da parede das células das plantas e representa uma rica fonte de inspiração para biotecnologia, biocombustíveis e biomateriais industriais. A parede celular da planta é uma estrutura caracterizada por uma malha de polissacarídeos, proteínas estruturais e compostos fenólicos que além de proteger a célula da
planta contra ataques externos, fornece suporte estrutural e mecânico para o tecido da planta, o que torna essa matriz uma estrutura altamente compacta e muito resistente a tratamentos. É constituída essencialmente por microfibrilas de cellulose, representando 30-60% da composição total, hemicelulose e lignina, que apresentam composições entre 20-40% e 10-20%, respectivamente. Essa variação da composição é devida à variabilidade climática, genética e à região produtora. A Figura 1 apresenta um esquema estrutural da composição da biomassa lignocelulósica (PETTERSEN, 1984; MIELENZ, 2001; GIRIO et al., 2010; CASTRO; PEREIRA, 2010; GUERREIRO et al., 2016).
Figura 1 – Representação esquemática da parede celular, juntamente com a localização dos componentes principais da biomassa. Adaptado de Murphy e Mccarthy (2005); Shen et al. (2013).
A celulose é um homopolissacarídeo linear composto por unidades de D-glicose, unidas por ligações β-1,4-glicosídicas. Cada resíduo de glicose tem orientação de 180° em relação ao resíduo adjacente, formando, assim, a celobiose, a subunidade repetitiva do polímero. A extremidade da cadeia de celulose, em que se encontra um carbono anomérico livre, é chamada de extremidade redutora, e a extremidade em que o carbono anomérico não está disponível é chamada de não redutora. A cristalinidade desse composto é decorrente da configuração β do carbono anomérico e da ausência de cadeias laterais que permite a longa cadeia de glicose compactar-se hermeticamente devido o estabelecimento de ligações de van der Waals e de hidrogênio dentro da cadeia, formando numerosos grupos hidroxil que por sua vez formam as microfibrilas. (O’SULLIVA, 1997; EBRINGEROVA et al., 2005; SANDGREN et al., 2005; PARTHASARATHI et al., 2011; BRANDT et al., 2013). A representação da cadeia linear da celulose está apresentada na Figura 2.
Figura 2 – Estrutura da celulose.
A hemicelulose é estruturalmente amorfa e variável, sendo composto principalmente por de hexoses, como D-glicose, D-galactose e D-manose, por pentoses, como D-xilose e L-arabinose, e ainda por ácidos urânicos como D-galacturônico, D-glucurônico e ácido metilgalacturônico. A cadeia principal da hemicelulose contém principalmente xilose β (1-4), aproximadamente 90% e L-arabinose, 10% (McMILLAN, 1993; SAHA, 2003). Encontra-se em associação com a celulose na parede das células vegetais, ligando-se não-covalentemente à superfície das fibrilas de celulose mantendo-as em seu lugar (TIMELL, 1967).
A lignina é um composto complexo altamente ramificado, não cristalino, formado por grupos metoxi e fenilpropanoicos depositados durante a maturação da parede celular, auxiliando na união das células. As ligninas são compostas por nove unidades de carbono, derivadas do álcool cinamil substituído, que são cumaril, coniferil e álcool siringil. Este composto faz ligações cruzadas, pontes covalentes e de hidrogênio, com os polissacarídeos da parede, formando um lacre físico e promovendo seu empacotamento, conferindo impermeabilidade e resistência contra o ataque microbiano e o estresse oxidativo. O complexo formado por lignina, celulose e hemicelulose é denominado de lignocelulose (BUCHANAN et al., 2003; SANCHES et al., 2009; MIELENZ, 2001).
Dentre os polímeros lignocelulósicos, a celulose é o composto que possui maior grau de polimerização, alcançando um número de 10000 ou mais de unidades de glicose numa cadeia (JORGENSEN, 2007). E em função da grande extensão da cadeia, esse polissacarídeo apresenta elevado peso molecular, sendo assim não apresenta solubilidade em água, diferente da glicose (AGARWAL et al., 1977). A celulose é uma fonte essencial de alimento para diversos animais ruminantes (bovinos, ovelhas, cabras, girafas e camelos) em função da presença de bactérias e protistas em seus estômagos (rúmen) que secretam a celulase. Na ausência desses microrganismos esses animais seriam incapazes de digerir as moléculas de
celulose, assim como os outros animais, devido à incapacidade em produzir enzimas que hidrolisem as ligações β (1-4) (SANDERMA; SHMIDT, 1973; PEIXOTO, 2006).
3.2. Enzimas celulolíticas
Enzimas, em sua maioria, são biocatalisadores de natureza proteica, altamente específicos e eficazes que atuam em pequenas quantidades, podendo ser recuperadas, conforme condições do tratamento utilizado. Elas são divididas em seis classes principais, oxiredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases, conforme o tipo de reação por elas catalisada (SANTOS, 2010). Por efeito de suas características, biodegradabilidade e especificidade, as enzimas minimizam os efeitos indesejáveis dos processos industriais biocatalisados, propiciando menor impacto ambiental e menor consumo energético. A tecnologia enzimática é hoje um dos campos mais promissores dentro das novas tecnologias para a síntese de compostos de alto valor agregado (ROCHA, 2010).
A rota enzimática para a liberação de açúcar a partir de celulose é decorrente da utilização das enzimas celulolíticas, que são biocatalisadores altamente específicos compostos por pelo menos quatro grandes grupos celulases: as endo-β(1-4)glucanases ou CMCases (E.C.3.2.1.4), as exo- β (1-4)glucanases ou celobiohidrolases ou avicelases (E.C.3.2.1.91), as β(1-4)D-glucana-glucano-hidrolases ou exoglicohidrolases (E.C.3.2.1.74) e as β(1-4) glicosidases ou celobiases (E.C.3.2.1.21) (WHITAKER, 1994). Estas atuam em sinergia promovendo a bioconversão do material lignocelulósico a açúcares fermentescíveis (CHANDEL et al., 2012). Contudo, a necessidade de doses elevadas de celulases comerciais torna o processo de sacarificação da biomassa lignocelulósica dispendioso (HIMMEL et al., 2007). Diversas estratégias têm sido propostas para a redução dos custos da celulase, tais como mutagênese de sítios específicos das enzimas (LIU et al., 2016; SAINI et al., 2016), melhoramento de plantas e etapas de pré-tratamento, objetivando melhorar a disponibilidade de celulose e hemicelulose (STICKLEN, 2008; TALEBNIA et al., 2010; ZHOU et al., 2016), emprego de tecnologias de engenharia genética (GOLDEBECK et al.; 2013; ULAGANATHAN et al., 2015), novos desenhos de coquetéis enzimáticos (PANDEY et al., 2016; SAINI et al., 2016), manipulação de novas vias de codificação da celulase, modificações no processo de fermentação e busca por microrganismos produtores de enzimas que degradam componentes da biomassa lignocelulósica (CHANDEL et al., 2012; GOLDEBECK et al.; 2012).
Celulases ou complexo celulolítico pertencem à classe das hidrolases, e podem ser produzidas por bactérias e fungos. Esse complexo age eficientemente devido a cooperação sinérgica das enzimas que o compõem, cada uma criando um novo sítio no substrato lignocelulósico e possibilitando a ação da outra enzima, promovendo a hidrólise de materiais celulósicos e a liberação de açúcares, dos quais glicose é o que desperta maior interesse industrial, devido à sua maior concentração e possibilidade de sua conversão em etanol (CASTRO; PEREIRA, 2010).
Essas enzimas são classificadas em quatro grupos conforme o ponto de ação no substrato:
1) Endo-β(1-4)-glucanases ou CMCases (E.C.3.2.1.4), têm sítios catalíticos em forma de ranhuras que permitem que a enzima clive ao acaso ligações β(1–4) dentro da cadeia de celulose amorfa ou solúvel (carboximetilcelulose e hidroxietilcelulose) liberando oligossacarídeos com terminações redutoras e não redutoras livres (LYND et al., 2002).
2) Exo-β(1-4)-glucanases ou celobiohidrolases ou avicelases (E.C.3.2.1.91) são responsáveis pela hidrólise das ligações glicosídicas da celulose a partir da extremidade não redutora liberando celobiose em maior quantidade em detrimento aos demais produtos. Em associação, as exoglucanases e as endoglucanases, degradam totalmente a celulose cristalina, sendo a primeira mais eficiente na redução da viscosidade (CASTRO; PEREIRA, 2010).
3) β(1-4) D-glucana-glucano-hidrolases ou exoglicohidrolases (E.C.3.2.1.74) hidrolisam as ligações β(1–4) glicosídicas de celodextrinas liberando glicose diretamente do polímero. A atividade diminui proporcionalmente com a diminuição da cadeia do substrato;
4) β(1-4) glicosidases ou celobiases (E.C.3.2.1.21) são responsáveis por hidrolisar as ligações do tipo β(1–4) de celobiose, trealose, gentiobiose liberando glicose. Ao contrário das exoglicohidrolases, a taxa de hidrólise das celobiases aumenta proporcionalmente com a diminuição do tamanho da molécula do substrato. As β-glicosidases e as exoglicohidrolases têm em comum os substratos de cadeia de glicose de 2 a 6 unidades, mas podem ser distinguidos com base nas suas atividades relativas sobre os dois substratos celobiose e celohexose. As β-glicosidases hidrolisam muito mais rapidamente a celobiose do que as
celobiohexoses, enquanto o oposto ocorre com as exoglicohidrolases (WHITAKER, 1994).
O esquema de biodegradação da celulose por ação das celulases é mostrado na Figura 3. As celobiohidrolases agem sobre os terminais redutores e não redutores das fibras de celulose liberando celobiose. As endoglucanases quebram as cadeias de celulose aleatoriamente e são responsáveis pela rápida solubilização do polímero celulósico, devido à fragmentação da celulose em oligossacarídeos. Enquanto que as β-glicosidases hidrolisam celobiose liberando glicose a partir das extremidades não redutoras (KLEMAN-LEYER et al., 1996; WATANABE; TOKUDA, 2010).
Figura 3 – Ação sinergética das celulases. Adaptado de Watanabe; Tokuda (2010). As celulases são amplamente utilizadas em diversos ramos da indústria, sendo elas, indústria têxtil e de detergentes, indústria de cerveja, indústria de extração de sucos, óleos vegetais, pigmentos, alcaloides e amido. Em meados da década de 1980 teve início sua utilização da área de alimentação animal, sendo utilizada como um aditivo em ração para aves e suínos com a finalidade de aumentar a digestibilidade de alimentos ricos em fibras de
celulose. Na área energética, essas enzimas vêm sendo empregadas na obtenção de hidrolisado de celulose, que são utilizados na fermentação visando à fabricação de produtos de interesse, tal como etanol (KUBICEK et al., 1993).
Enzima celulolítica é, portanto, uma das enzimas industriais mais importantes em termos de utilização de biomassa. No entanto, o alto custo de produção do complexo celulítico representa um obstáculo significativo para sua expansão industrial. Sendo que a composição de enzimas celulase de sistemas fúngicos nativos não é necessariamente adequada ao processo de hidrólise da biomassa pré-tratada. Uma estratégia proposta para maximizar a hidrólise de biomassa é suplementar as preparações de celulase com enzimas adicionais, além do uso de modelagem estatística para criar misturas otimizadas de enzimas celulolíticas (WYMAN et al., 2005; GUSAKOV, 2011; LIU et al., 2013). Devido à heterogeneidade e complexidade da biomassa lignocelulósica, a bioconversão requer múltiplas atividades enzimáticas. Logo, um sistema de enzimas eficiente deveria conter atividades balanceadas de celulases (endoglucanase, exoglucanases e β-glicosidade), xilanase, entre outras (BRIJWANI et al., 2010).
No que se refere à produção de etanol empregando biomassa lignocelulósica, a utilização de celulase contabiliza 20-30% do custo total (GEDDES et al., 2013). Mas recentes pesquisas relacionadas à produção de biocombustível de biomassa lignocelulósica têm permitido o acelerado desenvolvimento de celulases ideais à eficiência da sacarificação de biomassa, a fim de tornar o processo economicamente viável (KISHISHITA et al., 2014). É possível observar continuamente ao longo dos anos as contribuições científicas geradas no que se refere ao isolamento de microrganismos produtores de celulases, aos diversos métodos que possibilitem a superexpressão das celulases, como técnicas clonagem e expressão de genes.
Celulases que apresentam temperaturas elevadas de atividade, as celulases hipertermofílicas, podem ser muito úteis para as indústrias de têxteis e detergentes, porque podem ser facilmente inativadas à temperatura ambiente após a utilização, além de atribuir as vantagens de menor risco de contaminação microbiana, aumento da solubilidade dos substratos e melhor taxa de reação (KISHISHITA et al., 2014). Contudo, celulases com essa característica não são ideais à produção de bioetanol, quando as etapas de sacarificação e fermentação ocorrerem simultaneamente, visto que a temperatura ótima para a fermentação é ao redor de 30ºC (MARTÍN et al., 2008). Em processos nos quais as etapas de sacarificação e fermentação ocorram separadamente, a alta temperatura de sacarificação não representa um
impasse à fermentação, contudo o aquecimento do líquido reacional pode representar um custo adicional ao processo. Em contrapartida, Amorim et al. (2011) e Abdel-Banat et al. (2010) afirmam que a produção de bioetanol é beneficiada quando as fermentações ocorrem em altas temperaturas (≥ 40 ˚C), pois reduz os custos de refrigeração e ajuda a evitar a contaminação. A alta temperatura favorece a hidrólise mais eficiente da matéria-prima, conduzindo assim a produtividade melhorada no processo de sacarificação e fermentação simultâneas, pois haverá maior disponibilidade de açúcares fermentescíveis à levedura (CASPETA et al., 2014). Estratégias de engenharia genética estão desenvolvendo linhagens termotolerantes, resultado de modificações nos fluxos metabólicos que as tornam melhor adaptadas ao meio (NEVOIGT, 2008). O número de artigos científicos publicados nos últimos anos dedicados a este tema ilustra a importância e abrangência do mesmo, por exemplo, Nonklang et al. (2008), Dasgupta et al. (2013), Caspeta et al. (2014), Talukder et al. (2016). Diante disso é possível afirmar que o rendimento do processo de sacarificação e fermentação simultânea pode ser maximizado pelo emprego de temperaturas elevadas já que o desenvolvimento de linhagens termotolerantes é um tema promissor e em desenvolvimento e há favorecimento da hidrólise.
Em geral, as celulases produzidas por fungos filamentosos têm valores óptimos de pH na gama ácida (3,6 a 5,0), e a temperatura óptima cerca de 50 °C (CASTRO; PEREIRA, 2010). Em relação ao processo de regulação de celulases em fungos, Suto e Tomita (2001) demonstraram três estados de regulação: expressão a nível basal, secreção de celulases induzidas por indutores e repressão catabólica. Acredita-se que a celulase expressa em nível basal pode ajudar os fungos a reconhecer a existência da celulose, pois a transcrição das celulases não é afetada nem pelas proteínas ativadoras nem pela repressão catabólica. Quando um indutor entra na célula ele aciona a transcrição do gene da celulase mediada por proteínas ativadoras e elementos de ativação, e com uma grande quantidade de celulase secretada ocorre a degradação de mais celulose para oligossacarídeos e glicose favorecendo o crescimento. Após a degradação da celulose, uma grande quantidade de glicose é liberada o que causa a repressão catabólica. A proteína repressora catabólica é diretamente responsável pela regulação negativa a nível transcricional. A repressão catabólica vai impedir o fungo de sintetizar uma quantidade excessiva de celulases em circunstâncias em que há abundância de fonte de carbono facilmente assimilável.
3.3. Microrganismos produtores de celulases
Na natureza existe uma grande variedade de microrganismos que produzem celulases, porém, apenas algumas cepas são conhecidas como verdadeiros celulolíticos, isto é, são capazes de degradar extensivamente a celulose natural até açúcares solúveis. As variedades celulolíticas são classificadas como fungos, bactérias, plantas (Fragaria) e animais (moluscos e insetos (LYND et al., 2002). A Tabela 1 apresenta os principais representantes das bactérias celulolíticas (PERSON et al., 1991; PALMER et al., 2004).
Tabela 1 – Principais bactérias produtoras de celulases.
Bactérias celulolíticas aeróbicas Bactérias celulolíticas anaeróbicas
Acidothermus Acetovibrio Eubacterium Bacillus Bacteróides Pseudonocardia Celvibrio Butyrivibrio Ruminococcus Pseudomonas Caldocellum Thermoanaerobacter Staphylococcus Clostridium
Streptomyces Cellulomonas
Xanthomonas Erwinia
Os microrganismos pertencentes à espécie do Clostridium são os melhores produtores de enzimas celulolíticas entre as bactérias. Comparado com os fungos, as bactérias celulolíticas não possuem a mesma eficiência (PERSON et al., 1991; PALMER et al., 2004).
Fungos, em geral, são bem sucedidos na sobrevivência, ocupando habitats diversos, como solo, patógeno humano, patógeno de insetos e endofíticos. Os que decompõem substâncias celulósicas ocorrem no solo, colonizando vegetais, suas raízes e resíduos, com importante função de reciclagem de nutrientes. A atividade fúngica depende do conteúdo de matéria orgânica no solo, a qual determina, sobremaneira, a ocorrência e a distribuição desses organismos. Dentre as espécies de fungo capazes de produzir as celulases incluem-se as espécies de Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, Chaetomium, Fusarium, Phoma e
Phanerochaete chrysosporium (anteriormente Sporotrichum pulverulentum) (BAYER;
LAMED, 1986; SUBASCH, 2005; ZHANG et al., 2006).
No que diz respeito à atividade celulolítica em plantas, BY e seus colaboradores verificaram a relação entre a atividade de celulase e o estágio de maturação de morangos, havendo aumento de sua atividade à medida que os frutos amadurecem (BY et al., 2006). Em
outro trabalho, os autores averiguaram que a atividade de celulase em maçãs diminuiu em frutas amadurecidas na árvore (ABELER; TAKEDA, 1990).
Alguns estudos demonstraram os mecanismos pelos quais algumas espécies animais, incluindo cupins e lagostins e seus simbiontes microbianos, digerem celulose. Graças aos desenvolvimentos recentes em biologia molecular, a existência de celulases de origem animal tem sido firmemente estabelecida. Até à data, os genes de celulase foram relatados de artrópodes (insetos e crustáceo) e nematoides (WATANBEL; TOKUDA, 2010).
O emprego dessas enzimas em processos biotecnológicos tem sido à base de muitos estudos (SUBASCH, 2005), principalmente com relação ao uso de celulase e hemicelulase (FUJII et al., 2015). Enzimas celulolíticas derivadas de linhagens fúngicas industriais do gênero Trichoderma, Talaromyces e Crysosporuim são largamente usadas para a hidrólise de biomassa pré-tratada (GUSAKOV, 2011). Sendo que a espécie Acremonium cellulolyticus (também conhecido como Talaromyces cellulolyticus) recebe grande destaque entre os fungos produtores de enzimas celulolíticas. As enzimas produzidas pelo gênero Aspergillus são proteínas altamente glicosiladas (DE VRIES; VISSER, 2001). Contudo, a espécie
Trichoderma reesei é o fungo celulolítico melhor caracterizado e o mais utilizado
industrialmente para a produção de celulases e hemicelulases (BÉGUIN; AUBERT, 1994; KING et al.; 2009; ROCHA, 2010).
Em alguns fungos filamentosos, sequências gênicas foram identificadas como reguladoras da expressão da celulase e hemicelulase. Diferentes substratos lignocelulósicos induzem a produção de diferentes complexos enzimáticos, já que os substratos apresentam diferenças quanto ao conteúdo de celulose, hemicelulose e lignina (SANCHEZ, 2009). Em
Aspergillus niger e Hypocrea jecorina foram verificados indutores de celulase e hemicelulase
(STRICKER, 2006; Van PEIJ et al., 1998). Brink e Vries (2011) verificaram a produção de enzimas de degradação de celulose e xilano por fungos filamentosos. Acremonium
cellulolyticus isolado por Yamanobe e colaboradores é um potencial fungo produtor de
enzima celulolítica (YAMANOBE et al. 1987). Aro e colaboradores verificaram a presença de genes repressores de celulase em H. jecorina (ARO et al., 2001; ARO et al., 2003). Indutor do gene β-glicosidase foi averiguado em H. jecorina (NITTA et al., 2012). Genes indutores de celulase foram verificados em Aspergillus nidulans, Aspergillus aculeatus,
Neurospora crassa (KUNITAKE et al., 2012; CORADETTI et al., 2012; YAMAKAWA et
al., 2013). Fujii e colaboradores relataram que o sobrenadante de cultura de A. cellulolyticus tem uma atividade específica mais elevada de celulase e produz mais glicose a partir de
materiais lenhocelulósicos que o sobrenadante da cultura a partir de Trichoderma reesei (FUJII et al. 2015). Sabugo de milho (SM), palha de arroz (PA), bagaço de cana-de-açúcar (BCA), farelo de trigo (FT) e outros substratos lignocelulósicos são eficientes para a indução da produção de enzimas celulolíticas por fungos, como Aspergillus awamori, T. reesei, A.
niger, Penicíllium prupurogenum, Humicola grisea e outros (HALTRICH et al., 1996 DE
PAULA et al., 1998; CARVALHO 2003; SANCHEZ, 2009).
Ramani et al.(2012) descreveram que resíduos da fábrica de papel foram bons indutores da produção de β-glicosidase pelo fungo Penicillium funiculosum NCL1. Posteriormente os autores demostraram que na faixa de pH entre 4 e 5 e temperatura de 60ºC, houve aumento na atividade enzimática quando adicionado os íons Mn2+, NH4, K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+, Al3+, Na+ e Co2+.
A exploração da biodiversidade na busca de novos microrganismos produtores de insumos para a indústria representa uma estratégia viável, pois, além de permitir o levantamento taxonômico das populações que ali se encontram, pode levar ao descobrimento de processos metabólicos utilizados por estes organismos e, tais informações podem melhorar de produção industrial, substituindo, por exemplo, processos químicos por processos enzimáticos, que apresenta diversas vantagens. Um exemplo bem conhecido na indústria é a substituição de hidrólise ácida para a hidrólise enzimática, tal como é bem conhecido na indústria (PEIXOTO, 2006; ROCHA, 2010). Nesse sentido, o Brasil se destaca em função da ampla biodiversidade, proporcionando um vasto campo a ser explorado na busca desses novos microrganismos (PIROTA et al., 2015).
3.4. Histórico da produção de etanol no Brasil
No Brasil, o etanol surgiu basicamente por duas razões: a necessidade de amenizar as sucessivas crises do setor açucareiro e a tentativa de reduzir a dependência dos combustíveis fósseis. A utilização da cana-de-açúcar como matéria prima para a produção desse biocombustível elevou o Brasil ao atual segundo maior produtor mundial, e desde início do século XX iniciaram-se as primeiras ações de introdução do etanol na matriz energética brasileira. A inserção dos biocombustíveis na matriz veicular brasileira teve origem em 1925, quando datam os primeiros testes para utilização do álcool anidro como combustível no Brasil. Em 1933, o governo de Getúlio Vargas criou o Instituto do Açúcar e do Álcool – IAA e, pela Lei nº 737, tornando obrigatória a mistura de etanol na gasolina. Em resposta às crises do petróleo nos anos 70 e 80 o programa Proálcool foi criado e com ele uma intensificação da
pesquisa nos setores agrícolas e tecnológicos, levando o Brasil a uma posição muito favorável em termos de segurança energética (SOCCOL et al., 2010). Apesar da experiência acumulada acerca da produção do etanol e de sua vantagem competitiva, o Brasil não conseguiu elevar sua capacidade máxima, e ainda não é capaz de atender a demanda do mercado interno e mercado mundial, agravado por políticas desfavoráveis e pouco investimento nesse setor (JUTTEL, 2009; MEDEIROS, 2011; CONAB, 2016).
O aumento de consumo de álcool combustível ganhou força com o lançamento na indústria brasileira, em março de 2003, do primeiro veículo bi-combustível (flex fuel) movido a álcool e gasolina, puros ou misturados em qualquer proporção (ATALA, 2004; HIRA; OLIVEIRA, 2009). A participação de veículos flex continua crescendo a alcançou, em 2015, 57,2% da frota total, e os veículos a gasolina 31,7%. Segundo a Petrobrás Biocombustíveis, a produção de bioetanol do Brasil pode triplicar até 2020, passando dos atuais 27,5 bilhões de litros para 70 bilhões de litros (SOCCOL et al., 2010; SINDIPEÇAS e ABIPEÇAS, 2016).
Em resposta às investidas no setor, a produção de cana-de-açúcar passou por um significativo incremento na última década, fundamentalmente no período compreendido entre os ciclos de 2001/2002 e 2008/2009, ano da crise econômica mundial, ver Figura 4. Nesse intervalo, a safra cresceu a um ritmo de 10,6% ao ano, atingindo 573 milhões de toneladas. A partir de 2009/2010, houve não só uma ruptura com o ritmo apresentado até então, mas a produção passou a variar negativamente, a Conab estima uma redução de 8,5% na produção de etanol para a safra 2016/2017 em relação a safra anterior (CONAB, 2016). Contudo esse cenário pode se reverter em função da continuidade do crescimento das vendas de carros Flex Fuel e para atender o crescimento do consumo e das exportações de açúcar e etanol.
Boa parte do etanol industrial é feita por meio da fermentação, embora uma pequena quantidade também seja feito a partir do petróleo. O novo conceito de etanol, ou bioetanol, corresponde na utilização de material lignocelulósico para sua fabricação, e contribui para a expressiva ampliação pretendida da produção de etanol (BASTOS, 2007). A utilização de resíduos lignocelulósicos como substrato para a fermentação é um evento recente no Brasil. A primeira planta industrial para a fabricação desse biocombustível em escala comercial foi implantada em 2014. Atualmente existem apenas duas empresas com usinas de etanol celulósico em funcionamento no Brasil (GUADAGNIN, 2016).
Todavia, a demanda por etanol de cana-de-açúcar tende a crescer no mercado mundial, se mantida o atual modelo do mandato norte-americano para biocombustíveis. Além dos EUA, outros países colocam em prática o uso de etanol na matriz energética, e o déficit entre a oferta e a demanda mundial desse produto tende a manter o Brasil como seu principal fornecedor (FIESP, 2013).
3.5. Produção de bioetanol
Uma preocupação crescente cerca a produção de combustíveis a partir de fontes fósseis, por conta da elevada emissão de gases que provocam o efeito estufa, do esgotamento dos recursos naturais, da poluição ambiental, por sua não renovabilidade, pelas mudanças climáticas. Paralelamente tem ocorrido um elevado nível de interesse por combustíveis produzidos a partir de fontes renováveis, incluindo açúcares, amidos e materiais lignocelulósicos (PEREIRA Jr. et al., 2008; SILVA, 2010; SHEEHAN et al., 2006).
No Brasil, com as atuais tecnologias, o etanol produzido a partir de cana de açúcar emite 80% menos de gases causadores do efeito estufa, em comparação com a gasolina (BRANDT et al., 2013). Outras vantagens atribuídas ao etanol é função da maior inflamabilidade, alta velocidade de chama e alto calor de vaporização (SAXENA et al., 2009; SZULCZYK et al., 2010).
A produção de bioetanol a partir de fontes lignocelulósicas representa uma promissora vantagem em função da sua origem renovável, e pelo fato da sua produção não competir com a produção de alimentos e de ração animal. Portanto, representam uma solução para o não uso de alimentos como matérias-primas para a produção de combustível, como ocorreu nos EUA nos últimos anos, o milho tornou-se uma das principais matérias-primas para a produção de bioetanol, e isso levantou questionamentos sobre a utilização de alimentos como matérias-primas para a produção de combustível. Outra vantagem associada ao uso de
