Expressão heteróloga de celulase em Saccharomyces ceresisae

O melhoramento da S. cerevisiae é interessante, pois a fermentação dessa levedura se restringe a hexoses tais como glicose, sendo incapaz de co-fermentar a glicose e a celulose, ou de fermentar pentoses (SHI; JEFFRIES, 1998; GALBE; ZACCHI, 2002; TIAN et al., 2008). Logo, a modificação genética dessa levedura com o propósito de torná-la capaz de utilizar eficientemente celulose e pentose é a chave para uma tecnologia promissora para a produção de etanol lignocelulósico (HONG et al., 2014). Kötter e Ciriacy (1993) verificaram a utilização de xilose e a formação de produtos por linhagens de S. cerevisiae transformadas com XYL1/XYL2 sob várias condições. Öhgren e colaboradores avaliaram o comportamento de uma linhagem de S. cerevisiae transformada com genes XYL1 e XYL2 que codificam a xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH), em combinação com o gene endógeno XKS1 que codifica xilulocinase (XK), foi capaz de utilizar xilose para crescimento e produção de etanol. Os autores verificaram que a produtividade de etanol aumentou com o aumento da concentração de hidrolisado no meio de produção empregando o sistema SSF alimentado por lotes (ÖHGREN et al., 2006)

A incapacidade da levedura em fermentar a celulose está em sua incapacidade de assimilar essa molécula de alto peso molecular ou de expressar naturalmente enzimas que convertam esse polímero em açúcares fermentáveis. Diante disso, o emprego da tecnologia do DNA recombinante tem proporcionado, tanto à levedura S. cerevisiae como a leveduras relacionadas a produção de várias proteínas heterólogas (WALKER, 1998). Estudos demonstram que através de uma manipulação genética, a levedura S. cerevisiae pode ser capaz de expressar enzimas heterólogas, como a celulolase e hemicelulase (NAVARRO, 2008; GOLDBECK et al., 2013).

Leveduras apresentam facilidades no que se refere à produção de proteínas heterólogas de origem eucarionte devido ao seu ambiente intracelular favorável à correta formação dessas proteínas (VALENSUELA et al., 1982). Possuem mecanismo de transcrição, tradução e processamento pós-transcricional semelhantes àqueles observados em células eucariontes superiores (KINGSMAN; KINDSMAN, 1987) além da capacidade de processar modificações pós-traducionais para produção de proteínas heterólogas (MIYAMOTO et al., 1985; KUKURINSKA et al., 1987; TOWLER et al., 1988). Esses fatores contribuem para a manutenção da integridade estrutural, solubilidade, atividade biológica e localização celular das proteínas, bem como a capacidade de secreção eficiente, o

que facilita a separação dos produtos recombinantes a partir do meio de cultura (NAVARRO, 2008).

De acordo com Walker (1998), as principais etapas na expressão de genes heterólogos em células de levedura incluem o isolamento do gene, o processo de clonagem, que pode ser manipulado in vitro ou in vivo (recombinação homóloga). O processo de clonagem se caracteriza pela inserção do gene num vetor de expressão, o qual contém um cassete de expressão formado por uma sequência promotora, o gene estrutural e sequência terminadora. O vetor pode ser introduzido nas células de levedura utilizando o método de acetato de lítio (ITO et al., 1983) ou eletroporação (BECKER; GUARANTE, 1991) ou esferoblastos, como descritos primeiramente por Beggs (1978) e Hinnen et al. (1978). A seleção dos microrganismos transformados é facilitada pela presença das marcas genéticas seletivas contidas nos vetores. A expressão heteróloga dos genes envolve o processo de transcrição, terminação da transcrição, transporte do mRNA, início da tradução, alongamento da cadeia polipeptídica, que podem estar sujeitas às modificações pós-traducionais (glicosilação, acetilação, etc.) e, por fim, a secreção (para o espaço periplasmático) e excreção (para o meio extracelular) da proteína.

Para esse processo foram desenvolvidos diferentes vetores de transformação genética. Geralmente são empregados vetores bifuncionais, ou seja, contém uma origem de replicação para E. coli e outra para S. cerevisiae, além de apresentarem marcador de seleção para bactérias, como genes que conferem resistência a antibióticos, tornando as células bacterianas resistentes ao antibiótico e marcador de seleção para levedura como: leucinas (leu2), uracila (ura3), triptofano (trp1) e histidina (his3), que complementam uma mutação auxotrófica em linhagens de S. cerevisiae, permitindo a seleção das células de leveduras transformadas por complementação gênica em meio carente do aminoácido em questão. Também é possível selecionar transformantes de leveduras que receberam vetores de transformação contendo genes que conferem resistência a antibióticos como higromicina ou geneticina (G418). A utilização de qualquer um dos plasmídeos descritos impõe, entretanto, que se empregue uma cepa hospedeira com marcador de auxotrofia adequado para que se possam selecionar os transformantes em meio mínimo por complementação gênica (ROMANOS et al., 1992; CAMARGO, 2000; KIM et al., 2001; RUBIO, 2001; SAMBROOK; RUSSEL, 2001 GUERRA, 2002).

A integração de múltiplas cópias de genes heterólogos em Saccharomyces cerevisiae geralmente emprega integração em sequências de DNA (KUDLA; NICOLAS, 1992; SAKAI,

1991; LOPES et al., 1989), podendo estar presentes de 20 a 30 cópias até 140 repetições por genoma haplóide de DNA ribossomal. Após a transformação, o DNA clonado tem como alvo as repetições genômicas para a integração por recombinação homóloga. Praticamente, todos os locais de acolhimento podem ser alvos para a integração. Uma extensão valiosa deste trabalho poderia ser a integração estável de múltipla cópia de genes na mesma célula, potencialmente permitindo a síntese de complexos de proteína de múltiplas subunidades, ou vias de enzima em multi-passo (BUCKHOLS, 1993).

Em geral, existem três tipos de estratégias para introduzir um fragmento de DNA numa célula: biológica, química, e física. O método biológico produz elevadas eficiências de transformação e utiliza um vetor de vírus. No entanto, a inserção de um vetor viral num hospedeiro com seletividade para o vírus incitará o sistema de defesa da célula, que destruirá o vetor não efetivando a transformação. O método químico que, geralmente, utiliza um polímero policatiônico, é fácil de realizar. No entanto, o polímero pode ser reconhecido como uma substância estranha e pode ser digerido nos endossomos, juntamente com o vetor de transformação. É possível fazer o polímero escapar dessa via de digestão, mas a estratégia não é geralmente muito eficiente (COLOSIMO et al., 2000). Os métodos físicos, tais como micro injeção e eletroporação, são relativamente versáteis e mais frequentemente utilizados na transformação de células alvo do gene (NIIDOME et al., 2002).