Transformação em S cerevisiae (linhagem industrial FGY050, derivada PE,

A linhagem S. cerevisiae FGY050 (derivada PE, diploide) foi selecionada para a expressão heteróloga dos genes da endoglucanase e β-glicosidase isolados do fungo

Acremonium strictum. O p426>TEF1>g006>CYC1>PGK1>g249>IDP1 (endoglucanase + β-

glicosidase) foi transformado nessa linhagem industrial e auxotrófica para uracila.

A montagem do vetor, contendo as duas enzimas, via recombinação homóloga pela linhagem S. cerevisiae laboratorial BY4147, ocorreu eficientemente, e duas colônias de E.

coli transformadas foram identificadas e isoladas. Os vetores foram extraídos e digeridos por

enzimas de restrição para efetivar a montagem correta dos vetores, conforme apresentado no item 5.1.2. Esses dois vetores, P3C2 (plasmídeo 3/ colônia 2) e P3C11 (plasmídeo 3/ colônia 11) foram transformados na linhagem S. cerevisiae FGY050. Para a realização dos testes de sacarificação e fermentação simultânea apenas um dos dois vetores identificados foi selecionado. A fim de selecionar o vetor com o melhor fenótipo de expressão das enzimas, leveduras transformadas com os vetores foram inoculadas em meio YNB (Yeast Nitrogen

Base) URA-, empregando diferentes fontes de carbono glicose 2%, glicose 2% + celobiose

2% e glicose 2% + CMC 0,5%, sob condições aeróbicas, à 37 ˚C. Ao final de 120 horas foram realizados testes enzimáticos para verificar o teor de endoglucanase e β-glicosidase. As Figuras 22 e 23 apresentam os gráficos das atividades enzimáticas das fermentações cujas atividades foram constatadas.

Figura 22 – Atividade de endoglucanase para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando meio YNB (URA-) empregando Glicose 2% + Celobiose 2% como fontes de carbono em experimentos distintos. P3C2 = plasmídeo 3/ colônia 2; P3C11 = plasmídeo 3/ colônia 11. P3 = p426>TEF1>g006>CYC1>PGK1>g249>IDP1, Pvazio = p426 sem enzima.

A atividade da enzima endoglucanase na presença apenas de glicose obteve baixo desempenho, praticamente zero de atividade, para ambos os vetores, e apresentaram comportamento similar ao vetor pRS426 vazio, que representou o controle para a verificação da eficiência da expressão das enzimas. A glicose é um açúcar rapidamente fermentável. Quando a levedura é cultivada em meios contendo esse tipo de açúcar, a transcrição de um conjunto amplo de genes é reprimida (GRANCEDO, 1992; RONNE, 1995). Neste processo de regulação, denominada repressão catabólica, a expressão dos genes envolvidos em diferentes funções celulares é alterada pelos mecanismos de sinalização celular induzido pela glicose (SCHNEPER et al., 2004). Tendo em vista que a presença de glicose pode desencadear esse processo de repressão, a expressão das enzimas celulolíticas pode ter sido negativamente influenciada, em função da baixa atividade das mesmas.

A atividade enzimática empregando carboximetilcelulose (CMC), complementando a glicose, em fermentações distintas, tampouco favoreceram o aparecimento de alguma atividade da endoglucanase. Usando a celobiose como fonte de carbono complementando com glicose, pode-se observar que a linhagem S. cerevisiae P3C11 apresentou o melhor desempenho em todos os ensaios, produzindo 0.284 U/mL, 574% superior ao controle, nas fermentações em meio YNB empregando como fonte de carbono glicose (20 g/L) + celobiose

(20 g/L). A atividade da endoglucanase na presença de celobiose foi superior aos resultados encontrados por Ruegger e Tauk-Tornisiel (2004) que encontraram uma atividade de 0.034 U/mL para endoglucanase para o microrganismo Pinicillium purpurogenum e 0.036 U/mL para o Chloridium virescens após 14 dias de cultivo a 28 °C. O fungo Acremonium strictum, cujos genes de celulase foram extraídos e clonados nas linhagens de S. cerevisiae do presente trabalho apresentaram atividade similar de endoglucanase 0.33 U/mL (GOLDBECK et al., 2012).

A atividade da enzima β-glicosidase na presença apenas de glicose apresentou expressão reduzida, similar à expressão da endoglucanase na presença de glicose. De forma similar a expressão dessas enzimas pode ter sido negativamente influenciada, sendo ainda que sua atividade é inibida pela glicose (PHILIPPIDIS, 1993; PALMQVIST; HAHN- HAGERDAL, 2000).

A utilização de carboximetilcelulose (CMC) e celobiose como fontes de carbono, complementando com glicose, favoreceu a atividade da β-glicosidase. A linhagem S.

cerevisiae P3C11 apresentou o melhor desempenho em todos os ensaios, produzindo altas

atividades de β-glicosidase, 0.169 U/mL, 176% superior ao controle, e 0.133 U/mL, 198% superior ao controle, respectivamente, nas fermentações em meio YNB empregando como fonte de carbono glicose (20 g/L) + celobiose (20 g/L) e glicose (20 g/L) + CMC (5 g/L), respectivamente. Esses resultados são superiores aos encontrados por Goldbeck e seus colaboradores que encontraram uma atividade de 0.039 U/mL para β-glicosidase para o microrganismo Acremonium strictum (GOLDBECK et al., 2012). A atividade de endoglucanase foi similar a atividade expressada por Aspergillus niger nos experimentos conduzidos por Cavka e colaboradores quando cultivada em SFSH (spent fiber sludge hydrolysates) (CAVKA et al., 2014).

Para verificar a influência da glicose na inibição das enzimas envolvidas no metabolismo de respiração e favorecimento da via fermentativa, mesmo em presença de oxigênio (efeito Crabtree), foram realizadas fermentações em shaker, utilizando meio líquido YNB (Yeast Nitrogen Base) URA-, em regime aeróbico, empregando como fonte de carbono diferentes substratos. O teor de glicose ao final do pré-inóculo não foi quantificado, mas, tendo em vista o aumento da concentração de células ao longo da fermentação (Figuras 23(A), 23(B) e 23(C)) demonstra que havia presença de açúcar metabolizável no meio, possivelmente oriunda da hidrólise enzimática dos açúcares complexos.

Figura 23 – Atividade de β-glicosidase para as fermentações realizadas com a S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada quando cultivada em aerobiose utilizando meio YNB (URA-) e Glicose 2% + CMC 0,5% (A), Glicose 2% + Celobiose 2% (B) como fontes de carbono em experimentos distintos. P3C2 = plasmídeo 3/ colônia 2; P3C11 = plasmídeo 3/ colônia 11. P3 = p426>TEF1>g006>CYC1>PGK1>g249>IDP1, Pvazio = p426 sem enzima.

A importância desse teste é validar o Efeito Crabtree, posto que em estudos anteriores percebemos a importância da glicose somada a outra fonte de carbono para a ativação das enzimas de interesse. As amostras foram coletadas a cada 12 horas até completarem 72 horas de fermentação e submetidas à análise espectrofotométrica em comprimento de onda de 600 nm. Os dados obtidos estão expressos na Figura 24.

Figura 24 – Valores de concentração de células ao longo das 170 horas de fermentação em meio líquido YNB (Yeast Nitrogen Base) 0,67% sem a presença do aminoácido uracila (URA), em regime aeróbico, empregando como fonte de carbono: (A) CMC 0,5 % + glicose e CMC 0,5%, %; (B) celobiose 2% + glicose e celobiose 2%; (C) CMC 0,5 % + celobiose 2% + glicose e CMC 0,5% + celobiose 2%; (D) Glicose 2%, em experimentos distintos;

Os gráficos da Figura 24(A), 24(B) e 24(C) indicam que nas fermentações conduzidas a partir das amostras não lavadas do pré-inóculo a levedura obteve excelente crescimento em relação às fermentações iniciadas com células lavadas e, portanto, sem resquícios do pré- inóculo. Esses dados sugerem que houve atividade enzimática induzida pela glicose oriunda do pré-inóculo. Mas vale ressaltar que a atividade das enzimas endoglucanase e β-glicosidase foi inibida nas fermentações empregando glicose como única fonte de carbono. Nesse sentido, pode-se verificar a importância da presença da glicose complementando a outra fonte de carbono disponível, para “iniciar” a expressão das enzimas.

Tendo em vista que os promotores usados para a construção dos vetores carreadores das enzimas são constitutivos, as expressões das enzimas não necessitam de regulação, são sempre expressos (MUMBERG et al., 1995). Contudo, na ausência de glicose não houve

sacarificação dos substratos complexos e disponibilização de açúcares fermentescíveis à levedura.

Segundo Pronk et al. (1996) e Sarris et al. (2013) a levedura S. cerevisiae é um microrganismo Crabtree-positivo. Esse efeito é caracterizado pelo deslocamento da via metabólica e o microrganismo metaboliza os açúcares pela via fermentativa, a respiração é impossível, na presença de altas concentrações de glicose (WIN et al., 1996; PRONK et al., 1996; DIAZ-RUIZ et al., 2011). Portanto a levedura S. cerevisiae é capaz de fermentar mesmo na presença de oxigênio, quando inoculada num meio rico em glicose, assim uma forma de comprovar o efeito Crabtree seria verificando os níveis de etanol, contudo, as amostras colhidas nesse teste não foram analisadas quanto ao teor de etanol, posto que o propósito desse teste foi apenas verificar se haveria ou não crescimento de células num meio provido ou não de glicose.

Os testes realizados até este momento foram importantes para ajustar as melhores condições à realização da sacarificação e fermentações simultâneas, que ocorreram primeiramente em condição de micro-oxigenação e em seguida em condição anaeróbica, itens 5.2.1. e 5.2.2.. Reafirmando que a SSF representa uma estratégia promissora para superar o processo convencional de produção de etanol lignocelulósico, cujas etapas incluem, pré- tratamento, produção de enzimas e hidrólise, fermentação e destilação. Lynd et al. (2002) destaca que o “bioprocessamento consolidado” (CBP) oferece reduções de custo muito grandes se os microrganismos forem capazes de se desenvolver na presença de material celulósico.

O emprego da condição de micro-oxigenação teve como justificativa a maior facilidade de manuseio e execução da fermentação, além de menor custo. E, caso a produção de etanol nas fermentações empregando fonte complexa de carbono fosse superior à fermentação utilizando unicamente glicose seria suficiente para justificar o trabalho. No entanto a produção de etanol nessa condição não foi suficiente para confirmar a sacarificação e fermentação simultânea, sendo assim a condição anaeróbica foi empregada, visto que a presença de oxigênio não favorece a fermentação.

A montagem das linhagens S. cerevisiae FGY050 geneticamente modificada apresentou-se satisfatória, posto que foi possível selecionar uma linhagem com considerável capacidade de expressão das enzimas endoglucanase e β-glicosidase. A sua capacidade em converter material celulósico a etanol confere diversas vantagens ao processo industrial, as

quais, anteriormente citadas, incluem redução do tempo de processo de obtenção de etanol lignocelulósico,