UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
ÁLVARO JOSÉ HERNÁNDEZ TASCO
INVESTIGAÇÃO MICROBIOLÓGICA, CONDIÇÕES DE
CRESCIMENTO E POTENCIAL METABÓLICO PARA A
BUSCA DE PRODUTOS NATURAIS BIOATIVOS NO
FUNGO ENDOFÍTICO Cladosporium spp. (AC-1)
ISOLADO DE Annona cacans (Annonaceae)
CAMPINAS 2016
ÁLVARO JOSÉ HERNÁNDEZ TASCO
INVESTIGAÇÃO MICROBIOLÓGICA, CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO E POTENCIAL METABÓLICO PARA A BUSCA DE PRODUTOS NATURAIS BIOATIVOS NO FUNGO ENDOFÍTICO Cladosporium spp. (AC-1) ISOLADO
DE Annona cacans (Annonaceae)
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção
do Título de Mestre em Ciências na
área de concentração de fármacos, medicamentos e insumos para a saúde.
Orientador: Prof. Dr. Marcos José Salvador
CAMPINAS
2016
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO ÁLVARO JOSÉ HERNÁANDEZ TASCO E ORIENTADA PELO
PROFESSOR DOUTOR MARCOS JOSÉ
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2014/17436-9
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Microbiological investigation, growth condition, and metabolic potential for research of biactive natural products on endophytic fungi Cladosporium sp. (AC-1) isolated of Annona cacans (Annonaceae)
Palavras-chave em inglês: Endophytic fungi Annona cacans Metabolites Cladosporium cladosporioides Natural products
Área de concentração: Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Titulação: Mestre em Ciências
Banca examinadora:
Marcos José Salvador [Orientador] Elaine Minatel
Maria Silvana Alves
Data de defesa: 18-02-2016
Programa de Pós-Graduação: Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos Hernández Tasco, Álvaro José, 1991-
H43i Investigação microbiológica, condições de crescimento e potencial
metabólico para a busca de produtos naturais bioativos no fungo endofítico Cladosporium sp. (AC-1) isolado de Annona cacans (Annonaceae) / Álvaro José Hernández Tasco. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
Orientador: Marcos José Salvador.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
1. Fungo endofítico. 2. Annona cacans. 3. Metabolitos. 4. Cladosporium cladosporioides. 5. Produtos naturais. I. Salvador, Marcos José,1971-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Campinas, 18 de fevereiro de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
1. Prof. Dr. Marcos José Salvador (Orientador, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP) 2. Profa. Dra. Maria Silvana Alves (Universidade Federal de Juiz de Fora – UFJF)
3. Profa. Dra. Elaine Minatel (Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP)
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Marcos José Salvador e meus colegas do grupo de pesquisa, Alexandra, Carolina, Jane, Natalia, indira e Ricardo, pelo apoio suministrado na execução do trabalho. Á CAPES, CNPq, FAEPEX-UNICAMP e FAPESP pelo suporte financeiro e bolsa de estudo, ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fotônica Aplicada á Biologia Celular (INFABIC), aos laboratórios do Centro Nacional de Pesquisas em Energia e Materiais (CNPEM) pelo apoio e por possibilitar a utilização de seus equipamentos. A todos que de alguma forma colaboraram para a execução deste trabalho.
DEDICATÓRIA
Este trabajo va dedicado a todos mis seres queridos, personas que son muy especiales y hacen parte de mi corazón, que con paciencia y un amor incondicional me dieron fuerza para hacer todo este proyecto de maestría posible, deseándome así lo mejor.
Para mis padres Alvaro Hernández y Marilse Tasco, mis hermanas Aleidys, Lizeth y María José, que son la fuerza que me impulsa a seguir los caminos difíciles de la vida. Mi compañera y amiga de laboratorio Jane Marinho y mi orientador Marcos José Salvador, que con su gran carisma y confianza creyeron en mí. Y finalmente para una persona no menos importante, y si con una gran influencia en mi vida, siendo mi compañía incondicional, mi querida Vanessa Ortega.
Indice
Lista de Figuras ... 10
Lista de Tabelas ... 13
Lista de Anexos ... 14
Lista de Abreviaturas e Siglas ... 15
Resumo ... 17
Abstract ... 18
1. Introdução ... 19
1.1. Considerações sobre fungos endofíticos ... 19
1.1.1. Considerações gerais sobre fungos endofíticos do gênero Cladosporium spp., metabólitos secundários e suas aplicações biotecnológicas ... 21
1.1.1.1. As principais aplicações do Cladosporium spp na biorremediação ambiental ... 23
1.1.1.2. A aplicação das espécies de Cladosporium na Indústria de alimentos ... 24
1.1.1.3. A aplicação das espécies de Cladosporium na Indústria Farmacêutica ... 26
1.1.1.4. A aplicação das espécies de Cladosporium na Biotecnologia aplicada à agricultura ... 30
1.2. Considerações sobre a família Annonaceae ... 32
1.3. Considerações sobre Annona cacans ... 33
2. Objetivos ... 35
2.1. Objetivo geral ... 35
2.2. Objetivos específicos ... 35
3. Material e métodos ... 36
3.1. Instrumentação e materiais utilizados ... 36
3.2. Seleção da espécie vegetal ... 39
3.3. Coleta e classificação do material vegetal ... 39
3.4. Obtenção da cepa fúngica ... 39
3.5. Identificação do Microorganismo ... 39
3.5.1. Caracterização macroscópica e microscópica ... 40
3.5.2. Caracterização genética ... 40
3.6. Cinética de crescimento do fungo AC-1 ... 41
3.7. Obtenção dos extratos brutos e análise do perfil químico por CG-MS, CLAE-UV-DAD, UHPLC-MS e ESI-MS/MS ... 42
3.7.1. Pequena escala ... 42
3.7.2. Escala ampliada ... 42
3.7.3. Análise Qualitativa por CG e CLAE ... 44
3.7.3.1. Preparo das amostras (clean-up) para as analises. ... 44
3.7.3.3. Analises dos extratos por CLAE-UV-DAD. ... 44
3.7.3.4. Análises dos extratos por UHPLC-ESI-MS ... 45
3.8. Fracionamento dos extratos brutos ativos, isolamento e purificação dos constituintes químicos 46 3.9. Identificação dos constituintes químicos ... 47
3.10. Ensaios para avaliação da atividade antioxidante. ... 48
3.10.1. Ensaio DPPH ... 48
3.10.2. Ensaio ORAC-FL ... 48
3.11. Ensaio para avaliar atividade antimicrobiana:... 49
3.11.1. Técnica de poço em camada dupla ... 49
3.11.2. Técnica sensidisco ... 50
3.11.3. Método de microdiluição ... 51
3.12. Análise estatística ... 51
4. Resultados ... 52
4.1. Isolamento, identificação e caracterização macroscópica, microscópica e genetica do fungo endofitico AC-1 ... 52
4.2. Condições de crescimento, preparo e perfil químico em termos de metabolitos secundários dos extratos brutos do fungo AC-1 cultivado em pequena escala ... 56
4.2.1. Cinética de crescimento do fungo AC-1 ... 56
4.2.2. Potencial metabólico do fungo endofítico AC1 ... 59
4.2.3. Avaliação das atividades antioxidante e antimicrobiana ... 69
4.2.3.1. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio ORAC-FL dos extratos brutos do fungo AC-1 cultivado em diferentes meios de cultura ... 69
4.2.3.2. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio DPPH dos extratos brutos do fungo AC-1 cultivado em diferentes meios de cultura ... 71
4.2.4. Atividade antimicrobiana dos extratos brutos do fungo AC-1 ... 72
4.3. Fracionamento, isolamento e perfil químico dos metabolitos secundários do extrato bruto em AcOEt do fungo AC-1 cultivado em escala ampliada no meio YM. ... 74
4.3.1. Identificação estrutural das substâncias detectadas e isoladas no extrato bruto em AcOEt do fungo AC-1 cultivado no meio YM em escala ampliada. ... 75
4.3.1.1. Identificação estrutural da substância 1 ... 77
4.3.1.1.1. Substância 1: Ácido trans-cinâmico (C9H8O2), massa molecular 148,17 g/mol ... 77
4.3.1.2. Identificação estrutural da substância 2 ... 82
4.3.1.2.1. Substância 2: Dicetopiperazina formada pelas unidades Prolina (Pro) e Isoleucina (Ile) denominada Rel.ciclo(Pro-Ile), C11H18O2N2, massa molecular 210 g/mol. ... 82
4.3.1.3.1. Substância 3: Dicetopiperazina formada pelas unidades Prolina (Pro) e Fenilalanina
(Phe) denominada Rel.ciclo(Pro-Phe), C14H16O2N2. massa molecular 244 g/mol. ... 85
4.4. Atividade antioxidante do extrato bruto em acetato de etila produzido pelo fungo endofítico AC-1 cultivado em escala ampliada no meio YM e de suas frações ... 93
4.5. Atividade antimicrobiana do extrato bruto em AcOEt produzido pelo fungo endofítico AC-1 cultivado em escala ampliada no meio YM e de suas frações ... 95
5. Discussão ... 96
5.1. Isolamento, identificação e caracterização macroscópica, microscópica e molecular do fungo endofitico AC-1. ... 96
5.2. Condições de crescimento, preparo, perfil químico e atividade biológica em termos de metabolitos secundários dos extratos brutos do fungo AC-1 cultivado em pequena escala ... 97
5.2.1. Cinética de crescimento do fungo endofítico AC-1 ... 97
5.2.2. Preparo dos extratos e analise da produção de metabolitos secundários pelo fungo endofítico AC-1. ... 99
5.2.3. Atividade antioxidante (ensaio ORAC-FL) dos extratos brutos do fungo AC-1 cultivado em diferentes meios de cultura em pequena escala. ... 101
5.2.4. Atividade antioxidante (ensaio DPPH) dos extratos brutos do fungo AC-1 cultivado em diferentes meios de cultura em pequena escala. ... 101
5.2.5. Atividade antimicrobiana dos extratos brutos de AC-1 cultivado em diferentes meios de cultura em pequena escala. ... 102
5.3. Fracionamento, isolamento e perfil químico dos metabolitos secundários do extrato bruto AcOEt do fungo AC-1 cultivado no meio YM em escala ampliada. ... 104
5.3.1. Atividade antioxidante e antimicrobiana das frações e extrato bruto do fungo AC-1 cultivado em escala ampliada. ... 106
6. Conclusões ... 107
7. Perspectivas ... 108
8. Referências ... 110
10
Lista de Figuras Pagina
Figura 1. Autofluorescência do conidióforo do Cladosporium spp. (AC-1).. 22
Figura 2. Esquema da via degradadora do cloropirifo 24
Figura 3. Estrutura dos fructooligosacarideos produzidas por Cladosporium
cladosporioide 26
Figura 4. Estruturas de substancias isoladas de espécies de Cladosporium spp. 29
Figura 5. Substâncias isoladas de Cladosporium cladosporioides com atividade
antifúngica. 31
Figura 6. Exemplar de Annona cacans cultivado no IB-UNICAMP e utilizado nestes
estudo. 34
Figura 7. Substâncias previamente isoladas de Annona cacans. 34
Figura 8. Fluxograma da extração e analises do extrato bruto em escala ampliada. 43
Figura 9. Fluxograma do fracionamento do extrato bruto em acetato de etila do fungo
endofítico AC-1 cultivado no meio YM em escala ampliada. 47
Figura 10. Características macroscópicas do fungo AC-1 a 25±2°C/7dias de
crescimento, mostrando o lado superior e inferior da colônia. 52
Figura 11. Características microscópicas do fungo AC-1 com um tamanho de barra
de 10µm. 54
Figura 12. Cladograma com os fungos da Base de dados mais próximos ao fungo
AC-1 mediante o método de Neighbor-Joining. 56
Figura 13. Cladograma feito pelo método de Neighbor-Joining com função outgroup. 55
Figura 14. Cinética de crescimento do fungo endofítico AC-1 cultivado em diferentes
meios de cultura. 58
Figura 15. Time-lapse do conidio do fungo endofitico AC-1 no meio YM. Spinning
Disk do ANDOR Tecnhology. 58
Figura 16. Espectros de massas (ESI-MS), modo positivo (ES+), dos extratos brutos
em acetato de etila do fungo AC-1 em diferentes meios de cultura.
61
Figura 17. Espectros de massas (ESI-MS), modo negativo (ES-), dos extratos brutos
11
Figura 18. Dendograma das analises de agrupamento hierárquicos (HCA) dos
espectros de massas (ESI-MS), no modo positivo, dos diferentes extratos, Extrato de malta (ME), Extrato de levedura e malta (YM), Caldo nutritivo (CN), Czapek (Cz), Sabouraud-Dextrose (SD), Extrato das folhas de Annona cacans (AC), usando o método de single-linkage com distancia Euclidiana.
63
Figura 19. Dendograma das analises de agrupamento hierárquicos (HCA) dos
espectros de massas (ESI-MS) no modo negativo dos diferentes extratos, Extrato de malta (ME), Extrato de levedura e malta (YM), Caldo nutritivo (CN), Czapek (Cz), Sabouraud-Dextrose (SD), Extrato das folhas de Annona cacans (AC), usando o método de single-linkage com distância Euclidiana.
63
Figura 20. Representação gráfica dos escores das analises pelo PCA dos extratos
avaliados por ESI-MS no modo positivo. Extrato de malta (ME), Extrato de levedura e malta (YM), Caldo nutritivo (CN), Czapek (Cz), Sabouraud-Dextrose (SD), Extrato das folhas de Annona cacans (AC).
64
Figura 21. Representação gráfica dos escores do analises pelo PCA dos extratos
avaliados pó ESI-MS no modo negativo, Extrato de malta (ME), Extrato de levedura e malta (YM), Caldo nutritivo (CN), Czapek (Cz), Sabouraud-Dextrose (SD), Extrato das folhas de Annona cacans (AC).
64
Figura 22. Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína em função do
tempo para os extratos brutos em acetato de etila do fungo endofitico AC-1 cultivado nos diferentes meios de cultura: Extrato de malta (ME), Extrato de levedura e malta (YM), Caldo nutritivo (CN), Czapek (Cz) e Sabouraud-Dextrosa (SD) e dos controles experimentais Trolox (amostra de referência com comprovada atividade antioxidante) e diluente (tampão fosfato, controle negativo).
71
Figura 23. Atividade antimicrobiana dos extratos brutos do fungo AC-1 pelas técnicas
de difusão em placa. 73
Figura 24. Esquema com informações quanto ao fracionamento, isolamento e
purificação das substâncias isoladas e identificadas no extrato em acetato de etila do fungo endofitico AC-1 isolado das folhas de Annona cacans..
76
Figura 25. Estrutura da substância 1 (ácido trans-cinâmico) 77
Figura 26. Correlações de gHMBC da substância 1. 78
Figura 27. Espectro de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6, com pré-saturação do pico
de água) da substância 1 79
Figura 28. Espectro de RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) da substância 1 79
Figura 29. Mapa de contorno gHSQC da substância 1 (400 MHz para 1H e 100 MHz
para 13C, DMSO-d6).
80
Figura 30. Ampliação da região aromática do Mapa de contorno gHSQC da
substância 1 (400 MHz para 1H e 100 MHz para 13C, DMSO-d6).
12
Figura 31. Mapa de contorno gHSBC da substância 1 (400 MHz para 1H e 100 MHz
para 13C, DMSO-d6). 81
Figura 32. Cromatograma HPLC-UV-DAD e curva de UV (A) e cromatograma
UHPLC-MS e espectro ESI-MS, modo negativo, 30 V, em metanol (B) da substancia 1 81
Figura 33. Espectro de massa ESI-MS, modo negativo (A), energia de colisão 30V,
em metanol da substância 1. Espectro MS/MS do m/z 147, modo negativo, energia de colisão 30V, em metanol da substância 1 (B).
82
Figura 34. Estrutura da substância 2 [Rel.ciclo(Pro-Ile)] 82
Figura 35. Cromatograma UHPLC-MS, espectro de massa ESI-MS e espectro
MS/MS do m/z 211, modo positivo, energia de colisão 30V, da fração Fr-G, em metanol.
84
Figura 36. Estrutura da substância 3 (Rel.ciclo(Pro-Phe)). 85
Figura 37. Cromatograma UHPLC-MS, espectro de massa ESI-MS e espectro
MS/MS do m/z 211 e m/z 245, modo positivo, energia de colisão 30V, da fração Fr-H em metanol.
87
Figura 38. Espectro de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) da fração Fr-G. 88
Figura 39. Espectro de RMN de 1H (200 MHz, DMSO-d6) da fração Fr-H. 88
Figura 40. Espectro de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) Fr-G - ampliação. 89
Figura 41. Espectro HSQC (400 MHz para 1H e 100MHZ para 13C, DMSO-d6) da
fração Fr-G. 90
Figura 42. Espectro HSBC (400 MHz para 1H e 100MHZ para 13C, DMSO-d6) da
fração Fr-G. 90
Figura 43. Mapa de contorno de gCOSY (DMSO-d6, 400 MHz) da fração Fr-G. 91
Figura 44. Espectro de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) da replicação da ampliação
de escala da fração Fr-G.
91
Figura 45. Mapa de contorno HSQC a replicação da ampliação de escala da fração
Fr-G. (500 MHz para 1H e 125 MHz para 13C, DMSO-d6)
92
Figura 46. Mapa de contorno HSBC a replicação da ampliação de escala da fração
Fr-G. (500 MHz para 1H e 125 MHz para 13C, DMSO-d6)
92
Figura 47. Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína em função do
tempo para as frações do extrato bruto YM produzida pelo fungo endofitico AC-1 e dos controles experimentais Trolox (amostra de referência com comprovada atividade antioxidante) e diluente (tampão fosfato, controle negativo).
13
Lista de Tabelas Pagina
Tabela 1. Biomassa produzida pelo fungo AC-1 em diferentes meios de cultura e em
diferentes tempos de cultura em estudo de cinética de crescimento. 57
Tabela 2. Rendimento em massa de extratos brutos em acetato de etila obtidos das
culturas de AC-1 em diferentes meios de cultura líquidos em pequena escala (300 mL).
59
Tabela 3. Possíveis substâncias detectadas em função de suas m/z nos extratos
brutos do Fungo AC-1 e da planta Annona cacans (AC) analisados por ESI-MS,
UHPLC-MS e MS-MS.
66
Tabela 4. Possíveis substâncias detectadas em função de suas m/z nos extratos
brutos do Fungo AC-1 e da planta Annona cacans (AC) analisados por ESI-MS,
UHPLC-MS e MS-MS.
68
Tabela 5. Resultados da atividade antioxidante no ensaio ORAC-FL dos extratos
brutos do fungo endofitico AC-1 cultivado em diferentes meios de cultura. 70
Tabela 6. Resultados da atividade antioxidante no ensaio DPPH dos extratos brutos
do fungo endofítico AC-1 cultivado em diferentes meios de cultura. 72
Tabela 7. Atividade antimicrobiana dos extratos brutos de AC-1 cultivado em
diferentes meios de cultura. 74
Tabela 8. Dados de RMN de 1H e 13 C (400 MHz, DMSO-d6) da substância 1 (δ em
ppm e J em Hz). 78
Tabela 9. Dados de RMN de 1H e 13 C (400 MHz, DMSO-d6) da substância 1 (δ em
ppm e J em Hz). 84
Tabela 10. Dados de RMN de 1H e 13 C (400 MHz, DMSO-d6) da substância 3 (δ em
ppm e J em Hz). 86
Tabela 11. Resultados do ensaio da atividade antioxidante ORAC-FL das frações do
extrato bruto YM em escala ampliada. 93
Tabela 12. Atividade antimicrobiana das frações e do extrato YM em ampliação de
14
Lista de Anexos Pagina
Anexo 1. Tabela com a composição dos meios de cultura utilizados neste estudo 122
Anexo 2. Esquema de cultivo do fungo endofítico AC-1 cultivado em pequena escala
em diferentes meios de cultura líquidos e procedimentos para a obtenção de extratos brutos.
123
Anexo 3. Esquema de cinética de crescimento do fungo endofítico AC-1 cultivado em
diferentes meios de cultura líquidos. 124
Anexo 4. Dados de analise CG-MS do cleanup em C-18 da fase diclorometânica do
extrato em acetato de etila do fungo endofitico AC-1 e do extrato metanolico das folhas da planta Annona cacans.
125
Anexo 5. Cromatogramas de analise HPLC-UV-DAD de extratos em acetato de etila
do fungo endofitico AC-1 e do extrato metanolico das folhas da planta Annona cacans 141
Anexo 6. Dados de analises ESI-MS de extratos em acetato de etila do fungo
endofitico AC-1 e do extrato metanolico das folhas da planta Annona cacans 150
Anexo 7. Dados de analise UHPLC-MS de extratos em acetato de etila do fungo
endofitico AC-1 e do extrato metanolico das folhas da planta Annona cacans. 153
Anexo 8. Espectros de RMN 1 D e 2 D das frações purificadas que ainda estão sendo
trabalhados visando a identificação estrutural e para as quais serão obtidos outros dados espectrais incluindo o ESI-MS/MS
183
Anexo 9. Produção bibliográfica de Alvaro José Hernández-Tasco no período do
mestrado 186
Anexo 10. Artigo completo publicado no periodo do mestrado 187
Anexo 11. Declaração de bioética e biossegurança 192
15
Lista de Abreviaturas e Siglas
ACN Acetonitrila
AcOEt Acetato de etila
C-18 Fase estacionária de sílica tipo octadesil silano para
cromatografia
CCC Cromatografia em Coluna Convencional ou aberta
CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica
CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
CD3OD Metanol deuterado
CDCl3 Clorofórmio deuterado
CF Cromatografia em Coluna Flash
CHCl3 Clorofórmio
CIM Concentração Inibitória Mínima
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado
DPBF 1,3-diphenylisobenzofuram
DKPS Dicetopiperazinas
EM Espectrometria de Massas
ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectrometry
FE Fase estacionária
FM Fase móvel
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation.
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
HPLC High Performance Liquid Chromatography
Hz Hertz
16 m/z Relação massa/carga MeOH Metanol MHz MegaHertz Mg Miligrama mL Mililitro
P.A Padrão analítico
Rf Fator de retenção
RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono treze
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
TMS Tetrametilsilano
TR Tempo de retenção
UV-vis Ultravioleta-visível
UFC/mL Unidades formadoras de colônias por mililitro
17
Resumo
Este trabalho teve por objetivo investigar parâmetros microbiológicos, condições de crescimento e o potencial metabólico, vizando a busca de produtos naturais bioativos do fungo endofítico AC-1 isolado de Annona Cacans (Annonaceae). O isolamento e a identificação do fungo AC-1 foram realizados empregando analises microbiológicas convencionais incluindo morfologia macroscópica e microscopica e análise da região do ITS do DNA ribosomal, sendo os resultados sugestivos que o fungo endofítico AC-1 pertence ao gênero Cladosporium spp., especificamente C. cladosporioides. Para a extração dos metabolitos secundários foram usadas diferentes fontes nutricionais e como solvente extrator o acetato de etila (AcOEt). A produção de metabólitos micromoleculares destes extratos foi investigada por CG-MS, CLAE-UV/DAD-MS, ESI-MS/MS e UHPLC-MS e bem como foi avaliada sua potencialidade em relação atividade antimicrobiana (frente a bactérias e espécies de Candida spp) e antioxidante (métodos DPPH e ORAC-FL). Para a ampliação da escala, fracionamiento, isolamento e identificação de substâncias bioativas foi selecionado o extrato proveniente do meio de YM (extrato com melhores resultados em termos de atividade e de rendimento em massa). As etapas de isolamento e identificação resultaram em uma substância pura o ácido trans-cinâmico (substância 1), de duas substâncias identificadas em mistura, as dicetopiperazinas Rel.ciclo(Pro-Ile) (substância 2) e Rel.ciclo(Pro-Phe) (substância 3) e a substância 3 sozinha, sendo que outras frações purificadas ainda se encontram em analise por RMN. Ainda foram identificadas m/z que sugerem a possibilidade da presença de substâncias como a asimilobina, anonaina, liriodenina, ácido cumárico e o ácido cinâmico já reportadas em espécies de Annona spp. e cladosporol B, cladosporol D, cladosporina, recifeiolide e ácidos graxos já documentadas em fungos do gênero Cladosporium. Os extratos brutos e as frações apresentaram resultados promissores nos ensaios antimicrobiano e antioxidante, sendo identificadas substâncias com comprovada atividade antimicrobiana e antioxidante, incluindo a anonaina, asimilobina, o ácido trans-cinâmico e as dicetopiperazinas 2 e 3. A continuidade das investigações químicas e biológicas se faz necessária para se confirmar os resultados obtidos e melhor avaliar o potencial biotecnológico deste microorganismo endofítico.
18
Abstract
This study aimed to investigate microbiological parameters, growth conditions and the metabolic potential, aiming the search for bioactive natural products of endophytic fungus AC-1 isolated from Annona Cacans (Annonaceae). The isolation and identification of fungus AC-1 were performed using conventional microbiological analysis including macroscopic and microscopic morphology and analysis of ITS region of the ribosomal DNA, being suggestive results that the fungus endophyte AC-1 belongs to the genus Cladosporium sp., specifically C. cladosporioides. For the extraction of secondary metabolites were used sources nutricionales different and as extracting solvent is ethyl acetate (EtOAc). The production micromolecular metabolites of these extracts was investigated by GC-MS, HPLC-UV/DAD, ESI-MS/MS and UHPLC-MS and evaluated their potential as the antimicrobial activity (against bacteria and species Candida spp) and antioxidant (DPPH methods and ORAC-FL) for the expansion of the scale, fraccionamiento, isolation and identification of bioactive substances is selected from the extract through YM medium (extract with the best results in terms of activity and in mass yielded). The steps of isolation and identification resulted in a pure substance trans-cinnamic acid (substance 1), identified two substances in a mixture, the Rel.cyclediketopiperazine (Pro-Ile) (substance 2) and Rel.cycle (Pro-Phe) (substance 3) and the third substance alone, with other purified fractions are still being analyzed by NMR. Still were identified m/z suggesting the possibility of the presence of substances such as asimilobina, anonaina, liriodenine, coumaric acid and cinnamic acid have been reported in species of Annona spp. and cladosporol B, cladosporol D, cladosporina, recifeiolide and fatty acids already in fungi species of the genus Cladosporium. The extracts and fractions showed promising results in the antimicrobial and antioxidant assays, identified substances with proven antimicrobial and antioxidant activity, including anonaina, asimilobina, trans-cinnamic acid and diketopiperazine 2 and 3. The continuity of chemical and biological research is necessary aiming to confirm these results and evaluate the best biotechnological potential of this endophytic microorganism.
19
1. Introdução
A flora brasileira é considerada uma das mais ricas, com mais de 56.000 espécies, representando perto de 19% da flora mundial (Brasil, 1998). Apesar da importante biodiversidade vegetal e de sua riqueza biológica, ainda não se sabe muito de microorganismos associados aos táxons vegetais e suas interações com outros seres vivos (Souza et al., 2004). Uma grande variedade de microorganismos pode interagir com as plantas, entre os quais se encontram os fungos (Hallmann e SIkora, 1996). Os fungos são um grupo grande e diversificado de organismos que inclui fungos filamentosos, cogumelos e leveduras, sendo que aproximadamente 100.000 espécies de fungos já foram descritas. Alguns fungos formam associações simbióticas com plantas, o que pode facilitar a aquisição de minerais do solo para a planta e também podem ser benéficos os fungos em termos biotecnológicos na indústria pela sua capacidade de fermentação, por exemplo, para a síntese de antibióticos, de metabólitos bioativos e com fins alimentícios (Madigan et al., 2010).
O desenvolvimento tecnológico recente, especialmente com relação às novas técnicas biotecnológicas, abriu inúmeras oportunidades para investimento no aproveitamento sustentável dos recursos genéticos e da diversidade biológica em áreas de interesse ambiental, químico, alimentício e farmacêutico (Odalia-Rímoli et al., 2000). A valorização dessa diversidade é essencial para a preservação dos ecossistemas e espécies, mas também como fonte natural de produtos para exploração sustentada e para o consumo humano (Odalia-Rímoli et al., 2000). Assim, pesquisas multidisciplinares têm permitido a obtenção de progressos significativos na produção de metabólitos secundários derivados de plantas e microorganismos, com alto valor agregado para aplicações biotecnológicas e nas indústrias alimentícia e farmacêutica (Kolewe et al., 2008; Georgiev et al., 2007).
1.1. Considerações sobre fungos endofíticos
A palavra endófito foi mencionada por primeira vez por Heinrich Anton de Bary em 1884 para descrever organismo que habite no interior dos tecidos vegetais, entre estes são incluídos: bactérias, fungos, algas, insetos, vírus e outras plantas (Venugopalan e Srivastava, 2015). Microorganismos endofíticos são principalmente fungos e bactérias que habitam no interior das plantas sem causar aparentemente nenhum dano a seus hospedeiros (Saikkonen, 2007). Diferenciam-se dos microorganismos fitopatogênicos, que são prejudiciais para as plantas hospedeiras, causando-lhes doença e distinguem-se também dos microorganismos epifíticos,
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que vivem na superfície dos órgãos e tecidos vegetais (Saikkonen, 2007). Geralmente os microorganismos endofíticos estão associados com a sanidade da planta que os hospeda através da produção ou inibição de metabólitos primários e/ou secundários como mecanismos de defesa, conferindo diversas vantagens tais como a diminuição herbivoria e do ataque de insetos, o aumento da tolerância a estresses abióticos e o biocontrole de outros microorganismos (Souza et al., 2004). Sabe-se também que podem produzir toxinas, antibióticos e outros fármacos, fatores de crescimento e muitos produtos de interesse e com potencial biotecnológico, além de exercer outras funções para a sobrevivência do organismo a que são associados (Hallmann e Sikora, 1996).
Os fungos endofíticos são microorganismos eucarióticos, ubíquos e diversos (Saikkonen, 2007), estão associados a órgãos vegetais como folhas, caule, frutos, sementes e raízes. A transmissão dos fungos endofíticos para futuras gerações pode ocorrer através da semente do hospedeiro, perpetuando sua associação com o hospedeiro (Knoch et al., 1993). Os primeiros indícios da presencia de fungos endofíticos datam de 400 milhões de anos no período do Devônico, demostrando a estreita relação evolutiva que apresentam os fungos endofíticos e as plantas (Krings, et al., 2007). Os fungos endofíticos durante sua simbiose geram metabólitos primários e secundários, o que pode, inclusive, conferir vantagens para a planta em que está associado (Hallmann e Sikora, 1996). Além disso, os microorganismos endofíticos são de interesse industrial e agrícola, sendo fontes de novos agentes bioativos, com potencial uso na indústria farmacológica e como controles de pragas e também podem ser utilizados como vetores para a introdução de genes de importância para a planta (Souza et al., 2004; Murray et al., 1992).
Desde a descoberta da produção do fármaco anticâncer paclitaxel (Taxol) por Pestalotiopsis microspora, um fungo endofítico associado a planta Taxus wallichiana, sem causar danos aparentes para a planta hospedeira, o interesse pela busca de agentes ativos em fungos endofíticos vem crescendo (Strobel et al., 1996). Assim, por causa do papel em conferir à planta a capacidade de se adaptar a condições de estresse e porque são comprovadamente fontes de metabólitos secundários com importância biotecnológica, o estudo de fungos endofíticos tem sido encorajado visando a busca de novas substâncias e produtos bioativos.
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1.1.1. Considerações gerais sobre fungos endofíticos do gênero Cladosporium spp., metabólitos secundários e suas aplicações biotecnológicas
Durante a história da humanidade há conhecimento de relatos de microorganismos que fazem parte de processos de transformação de matérias-primas usados pelo ser humano para adquirir produtos. No entanto, a descoberta destas diminutas criaturas só ocorreu no final do século XIX, quando Louis Pasteur (1822-1895), estudou o processo da fermentação e achou o papel dos microorganismos na transformação da matéria-prima. Inicialmente os microorganismos foram utilizados para fins alimentícios (Constable et al., 2007), mas nos últimos séculos, os usos dos metabolitos microbianos foram ampliados, envolvendo diferentes campos de aplicação, principalmente na indústria farmacêutica (Underwood, 2004).
É sabido que os microorganismos são um grupo variado que compõem distintos reinos como: bactéria, archaea e eucarya, em este último, se destaca um grupo de microorganismos em especifico, os fungos que compõem três formas distintas: mofos, leveduras e cogumelos. Os mofos ou fungos filamentosos tem um bom potencial no caso da produção de moléculas com interesse industrial (Herrero, et al. 2014). Dentre toda biodiversidade dos fungos, um gênero se destaca, o gênero Cladosporium (Bensch, et al. 2010) que apresenta importância dado o seu potencial metabólico para a biossintese de substâncias com aplicações na indústria.
O gênero Cladosporium é um grupo de organismos celulares eucarióticos pertencentes ao reino dos fungos, filo Ascomicota, classe Dothideomycetes, subclasse Dothideomycetidae, ordem Capnodiales, e á família Cladosporiaceae. Segundo os estudos realizados por Bensch, et al., 2012, o gênero Cladosporium tem 993 nomes que inclui ao gênero Heterosporium, dos quais 854 pertencem ao Cladosporium e 139 ao Heterosporium. Entretanto, dos 993 são somente reconhecidos 169 como Cladosporium spp (Figura 3). Essa classificação e identificação das espécies de Cladosporium têm sido baseados em caráteres fenotípicos, mas nas últimas décadas foi fortemente influenciado pela caracterização molecular e filogenética (Bensch et al., 2012).
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Figura 1. Autofluorescência do conidióforo do Cladosporium cladosporioides (AC-1), observada
em analise por microscopia confocal de fluorescência.
O fungo Cladosporium tem um alto impacto econômico e social. As espécies se encontram dispersas em multiplos ambientes no mundo como no ar, na terra, na agua, nas plantas e nos animais. Além disso, pode-se encontrar em zonas inóspitas como desertos, terras altamente salgadas e radiativas (Hassegawa et al., 2008; Huyan et al., 2012; Martins et al., 2009; Sterflinger et al., 2012). Algumas dessas espécies são produtores de micotoxinas que atuam como patógenos em humanos e animais (Bensch et al., 2012; Fuentes e Bosch, 1960). Por tanto, muitas espécies são estudadas com interesse biotecnológico para a produção de metabolitos tales como, antibióticos, ácidos orgânicos e enzimas (Ai et al., 2014).
A espécie de Cladosporium tem sido isolada de plantas como: Paspalum ligulare Nees, Bothriochloa pertusa (L.) A. Camus, Chloris inflata, Rosa hybrida, Pinus ponderosa, entre outras (Loro et al., 2012; Salazar e García, 2005; Schubert et al., 2009), tornando-se como possíveis maquinarias metabólicas utilizáveis que reiteram a importância do uso desse fungo. A seguir, se apresenta as aplicações da espécie de Cladosporium na indústria que foram encontradas na literatura. Ressalte-se que as principais aplicações deste fungo incluem a biorremediação; indústria de alimentos, a indústria farmacêutica e a biotecnologia aplicada á agricultura.
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1.1.1.1. As principais aplicações do Cladosporium spp na biorremediação ambiental
A contaminação do ambiente é uma questão de interesse global, pois dependemos dele para sobreviver neste planeta. Existem vários métodos de remediação para o meio ambiente, dentre eles tem-se a biorremediação.
A biorremediação é uma alternativa tecnológica que utiliza o potencial metabólico dos microorganismos para converter os contaminantes em compostos pouco ou nada contaminantes (Sanchez e Rodríguez, 2003). Diversos estudos classificam as espécies de Cladosporium como um microorganismo com atividade biorremediadora (Bensch et al., 2012; Larran, et al., 2015). Um exemplo claro de um fungo modelo de biorremediação é o caso do Cladosporium sphaerospermum, que assimila o tolueno (hidrocarboneto aromático altamente contaminante), segundo os estudos de Luykx et al., 2003; Weber et al., 1995, descrevem que Cladosporium sphaerospermum modifica o tolueno a uma forma menos toxica mediante a enzima tolueno monooxigenase (TOMO) e em seguida o assimila. Por outro lado, as espécies do gênero Cladosporium encontradas no compostagem mostram capacidade para degradar uma ampla gama de resíduos orgânicos devido a sua termotolerância (Jurado et al., 2014). Do mesmo modo, algumas cepas de Cladosporium spp., obtidas de áreas contendo água contaminada, são capazes de absorber metais pesados como ouro, prata cobre e cadmio liberadas por algumas industrias no meio ambiente (Pethkar et al, 2001).
Um problema em torno da agricultura é a contaminação pelos resíduos dos inseticidas, estas substâncias químicas são potencialmente tóxicas e perigosas para os seres vivos principalmente quando ficam depositadas no meio ambiente, correndo o risco de dispersar-se, por exemplo, pelas chuvas. Uma solução para esse problema é o uso do microorganismos, como por exemplo, espécies do gênero Cladosporium que possuem o potencial para ser utilizado na biorremediação em ambientes contaminados por piretroides e por organofosforados (Chen et al., 2011). No caso da espécie Cladosporium cladosporioides que degrada o clorpirifo formando como produtos o 3,5,6-tricloro-2-piridinol (TCP) e o ácido dietiltiofosfato (DETP), levando á degradação do TCP, o qual sofre ruptura do anel contendo o nitrogênio e formando um produto de degradação menos tóxico e que é finalmente metabolizado, como mostrado na figura 4 (Chen et al., 2012). Assim como o gênero Cladoporium spp degrada os inseticidas também estes fungos apresentam também o potencial para degradar herbicidas como sulfentrazona e o 2,4-diclorofenol (Martinez et al., 2008; Vroumsia et al., 2005).
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Figura 2. Esquema da via degradadora do cloropirifo proposta por Chen et al., 2012.
Em estudos da biorremediação dos corantes contaminantes encontrou-se que Cladosporium cladosporioides produz a enzima lacasa a uma concentração de 4160 U/L com
0,05 mM de CuSO4, 4% (p/v) de glicose e 0,04% (p/v) de lignina. Essa lacasa purificada é uma
enzima eficaz na biotransformação de substâncias aromáticas, assim como na descoloração de vários corantes. (Halaburgi et al., 2011). Além disso, Cladosporium spp. apresenta atividade para a enzima fitase (myo-inositol hexaquisfosfato fosfohidrolasas) aproximadamente entre 50 e 100 vezes maior que o fungo Aspergillus ficuum NRRL 3135 reconhecido como um alto produtor da enzima fitase que é considerada como um tipo único de fosfatasse, sendo capaz de liberar fosfato a partir de fitato, além, de outros compostos fosforizados, que normalmente contaminam os ambientes (Quan et al., 2004).
Uma possível solução frente aos resíduos agroindústriais, como a palha e farelo de trigo e do arroz, é economicamente atrativo, pois é uma matéria-prima econômica e facilmente
disponível, as espécies de Cladosporium spp produz a enzima L-asparaginase que fermenta em
estado sólido (SSF) estes tipos de resíduos agroindustriais (Mohan Kumar et al., 2013).
1.1.1.2. A aplicação das espécies de Cladosporium na Indústria de alimentos
A indústria de alimentos é a encarregada do processo dos alimentos compreendido da matéria-prima até a elaboração do produto final. A inovação é fundamental nessa indústria como nas demais, por isso a constate pesquisa para o melhoramento da mesma, utilizando diversas metodologias inclusive a relacionada com os microorganismos. O gênero Cladosporium spp é
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um possível candidato para aplicar seus metabólitos de interesse para o desenvolvimento dessa indústria (Santamaria, 2010).
Em estudos da composição bioquímica proveniente de Cladosporium spp. foi reportado que as espécies deste gênero acumulam na ordem de 27,3% p/p de lipídios e de 50% de proteínas. Se cultivados em condições especificas espécies de Cladosporium spp., acumulam até 73,7% de lipídios, estes lipídios contêm ácidos graxos como ácido oleico, ácido palmítico e ácido linoleico (De e Verma, 2011). Os ácidos linoleico e oleico são parte essencial dos óleos considerados benéficos para a saúde humana, sendo importante para a indústria de alimentos. Apesar disso, Cladosporium spp também pode degradar os ácidos graxos livres e triglicerídeos, para proporcionar uma fonte de carbono e energia. Estes lipídios se encontram nos três óleos de importância comercial como, no óleo de coco, de amêndoa de palma e na manteiga, sendo útil na parte dos resíduos da indústria dos alimentos (Kinderlerer, 1993).
Algumas espécies do gênero Cladosporium produzem acido benzóico como é o caso do C. cladosporoides, esse acido é amplamente usado na indústria dos alimentos, permitindo baixar o pH do meio da conserva. Segundo estudos de Waqas et al. (2013), o acido benzoico proveniente deste fungo, pode ser utilizado como herbicida sendo mais amigável com o ambiente, inibindo a germinação das sementes. A espécie C. cladosporoides também produz
alguns fructooligosacáridos, também chamados às vezes oligofrutose ou oligofrutanos ou
abreviados como FOS, muitas vezes usado como um substituto para o açúcar. Estes
polissacarídeos apresentam uma capacidade edulcorante, que para o mesmo peso, varia entre 30 e 50 por cento do poder adoçante de açúcar comum em preparações comerciais xaropes.
São exemplos: 1-cestosa, blastosa, 6-cestosa, nistosa, neocestosa, f-fructosilnistosa e neonistos
(Figura 5). Estes fructooligosacarideos são também utilizados na indústria dos alimentos como ingrediente, devido ás suas propriedades, como a ação prebiótico, que favorece o desenvolvimento das bifidobacterias e os lactobacilos, a baixa ingesta calórica, a diminuição de lipídios no sangue, a redução de câncer de cólon, entre outras vantagens (Zambelli et al., 2014).
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Figura 3. Estrutura dos fructooligosacarideos produzidas por Cladosporium cladosporoides
(Zambelli et al., 2014)
1.1.1.3. A aplicação das espécies de Cladosporium na Indústria Farmacêutica
A indústria farmacêutica dedica-se á produção de medicamentos, embora tenha também uma atividade de desenvolvimento, pesquisa, comercialização e distribuição de fármacos e medicamentos. Os fármacos são substâncias isoladas e quimicamente caracterizadas em termos estruturais, que encontram-se em estado de pureza que atendam a adequação ao uso, podendo ser de origem natural ou sintética, com atividade biológica e capacidade de interagir com um organismo vivo (Pérez, 2004). Os fungos são organismos capazes de produzir substâncias bioativas e úteis em termos terapêuticos, como, por exemplo, os antibióticos. Estudos em epigenética revelam que os fungos filamentosos possuem genes com características interessantes em níveis de atividade antimicrobiana, só que ainda não têm sido estimulado tais genes em pesquisas laboratoriais (Liu et al., 2014).
Os fungos de origem marinha são amplamente estudados principalmente por seus metabólitos bioativos demostrando ser uma fonte importante de moléculas com atividade anticâncer, antibacteriana, antifúngica, antiparasitária antiviral, antioxidante e anti-inflamatória. As espécies de Cladosporium de origem marinha produzem moléculas de interesse farmacêuticos como a metanefrina, a cis-1-Cloro-9-octadeceno, a Morfina-2,4-diol-6-one-N-formil, entre outros (Xiong et al., 2009). Substâncias pertencentes a classe dos macrolideos a partir de microorganismos tornaram-se uma importante fonte de moléculas com efeito antibiótico para a clínica (Wuringege et al., 2013). São exemplos os destes macrolideos os de 12 membros
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(metimicina) e de 14 membros (eritromicina) a partir de actinomicetos. Macrolídeos também foram produzidos a partir de fungos e algas (por exemplo Lyngbya sp., Amphidinium sp., Penicillium verrucosum, Pseudomonas sp. e Rhizopus microsporus). Espécies de Cladosporium sp. apresentam relatado de serem capazes de produzir uma série de macrolídeos de 12 membros, incluindo cladospolides A-C a partir de C. cladosporioides, C. tenuissimum; pandangolides 2-4 de C. herbarum e patulolide 1 de Cladosporium sp (Figura 6). Cladospolides A e B demonstraram ser fitotóxicos, enquanto que patulolides 1 e 2 demostraram forte atividade antifúngica e ligeira atividade antibacteriana (Gu et al., 2015; Wuringege et al., 2013; Qi et al., 2009).
A rapamicina é um antibiótico isolado das espécies de Cladosporium spp sendo um potente indutor da diferenciação das células da leucemia mielóide. Segundo Kasukabe et al., (2008), a rapamicina inibem efetivamente a proliferação de várias linhas celulares do câncer de mama. O taxol, um medicamento anticancerígeno, inicialmente foi isolado da planta Taxus brevifolia, mas depois foi descoberto que um fungo endófito da planta o produzia, sem embargo, com o tempo foi descoberto o taxol em outras espécies de fungos entre esses o fungo Cladosporium cladosporoides, ele possui o gene DBAT que codifica para o taxol, permitindo abrir uma ampla gama de possibilidades ante os fungos endófitos (Kusari et al., 2014). Do mesmo modo, foi isolado o alcaloide Aspernigrina A, a partir de Cladosporium herbarum, que normalmente é pertencente à espécie Aspergillus niger (Ye et al., 2005). Foi reportado por Ai et al., (2014) que um fungo endofítico pertencente ao gênero Cladosporium spp., isolado da planta Kandelia candel produz a substância cladosporona A .
O estudo químico do extrato em acetato de etila do fungo endofítico Cladosporium sp. (cepa no. IFB3lp-2), isolado a partir da planta Rhizophora stylosa, resultou no isolamento e
identificação de três novos policetideos, denominados policetideo 1 (C12H20O5, PM=244,12
g/mol), policetideo 2 (C15H24O6S, PM=332,12 g/mol) e policetideo 3 (C24H40O8, PM=456,26
g/mol), entre os quais os constituintes 2 e 3 foram macrolideos de 12 membros, além do isolamento de nove substâncias conhecidas, incluindo cladospolideo B, cladospolideo A, cladospolideo A II, iso-cladospolideo B, seco-patulolideo e pandangolideo 1, pandangolideo 1a, pandangolideo 2, e pandangolideo 3 que também foram obtidos a partir deste fungo. Todas as estruturas foram elucidadas com base em métodos espectroscópicos. As substâncias isoladas policetideos 1, 2 e 3 foram submetidas à avaliação das atividades citotóxica, antiviral, inibidora de acetilcolinesterase e nenhuma das substâncias avaliadas mostrou atividade significativa nestes ensaios. Portanto foi reportado neste trabalho multidisciplinar o estudo quanto ao
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processo de fermentação, isolamento, elucidação da estrutura e avaliação das atividades biológicas das substancias isoladas (Wuringege et al., 2013).
De acordo com Gesner et al. (2005), o fracionamento do extrato acetato de etila de uma espécie de Cladosporium sp. Isolado da esponja Niphates rowi, produziu uma nova lactona hexaketideo, denominada pandangolideo 1a, juntamente com o seu pandangolideo diastereoisomero pandangolideo 1 e o também já conhecido iso-cladospolideo B.
Hirota et al., (1981) documentaram o isolamento e a elucidação estrutural de um novo macrolideo Cladospolideo A, juntamente com o macrolideo conhecido como Recifeiolideo. Este
metabolito foi isolado a partir de cultura de Cladosporium fulvum FI-113, cultivado a 30oC por 4
dias em meio Czapek-Dox fortificado com extrato de levedura. O macrolideoo apresentou atividade inibidora de germinação de sementes de alface.
A partir de 67 fungos endofiticos isolados de Quercus virabilis em estudo guiado pela avaliação da atividade antimicrobiana frente a bactérias e fungos zoopatogenicos foi documentado o isolamento do metabolito bioativo brefeldina A, isolado da cepa I (R) 9-2, Cladoporium sp., cepa esta com maior atividade antifúngica dentre os endofiticos isolados desta planta. Brefeldina A é um metabolito secundário da classe das lactonas com um anel lactonico de 13 membros e para esta substancia várias atividades biológicas já foram descritas incluindo antifúngica, antitumoral, antiviral e citotóxica (Wang et al., 2007).
Um fungo endofitico, cepa denominada LF70, foi isolado a partir das folhas de Huperzia serrata. O fungo foi identificado como C. cladosporioides LF70 de acordo com suas características morfológicas e de análise da sequência ITS de DNA ribosomal nuclear. A cepa foi capaz de produzir Huperzina A. A quantidade de Huperzine A produzida por este fungo endófito foi quantificados a 56,84 μg/L por meio de HPLC, teor este que foi maior do que o produzido por outros fungos endofiticos, tais como Acremonium sp., Blastomyces spp., e Botrytis sp. A atividade de inibição da acetilcolinesterase de Huperzina A produzida in vitro pela cepa LF70 foi semelhante á da Huperzina A amostra autêntica de referencia. O isolamento do fungo endofitico LF70 pode proporcionar uma abordagem alternativa promissora para a produção de Huperzina A, que é usada no tratamento da doença de Alzheimer (Zhang et al., 2011). Num balão de erlenmeyer de 500 mL, o fungo foi inoculado em 120 mL de caldo batata dextrose e cultivado a
120 rpm, 28oC durante 10 dias. Os micélios foram então colhidos por centrifugação a 12000 rpm
por 10 min e secos durante a noite a 60oC. A biomassa do micélio seco foi submetido à extração
em aparelho de Soxhlet com etanol a 75% por 48 h. Os extratos foram filtrados e o solvente evaporado sob pressão reduzida, fornecendo o extrato rico em Huperzina A (Zhang et al., 2011). As estrutras das substâncias isoladas de especies de Cladosporium endofitico citadas no texto estão apresentadas na Figura 6.
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Pandangolideo 1a Pandangolideo 1 iso-Cladospolideo B C12H20O5, PM = 244,1 g/mol) C12H20O5, PM = 244,1 g/mol) C12H20O4, PM = 228,2 g/mol)
Cladospolideo A Cladospolideo B Cladospolideo C Cladospolideo D
C12H20O4, PM = 228,1 g/mol) C12H20O4, PM = 228,1 g/mol) C12H20O4, PM = 228,1 g/mol) C12H18O4, PM = 226,3
g/mol)
Pandangolideo 2 Pandangolideo 3 Pandangolideo 4
(C14H22O6S, PM=318,1 g/mol) (C16H26O7S, PM=362,1 g/mol) (C24H38O8S, PM=486,2 g/mol)
Recifeiolideo Brefeldina A Huperzina A
(C12H20O2, PM=196,0 g/mol) (C16H24O4, PM=280,3 g/mol) (C15H18N2O, PM=242,3 g/mol)
Policetideo 1 Policetideo 2 Policetideo 3
(C12H20O5, PM=244,1 g/mol) (C15H24O6S, PM=332,1 g/mol) (C24H40O8, PM=456,2 g/mol)
Patulolideo C Seco-patulolideo C (C12H20O3, PM= 212,1 g/mol) (C12H22O4, PM=230,3 g/mol)
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1.1.1.4. A aplicação das espécies de Cladosporium na Biotecnologia aplicada à agricultura
A biotecnologia agrícola tem como intuito procurar o melhoramento das plantas, gerando resistências frente a agentes que prejudiquem seu desenvolvimento, como os fitopatógenos, agentes químicos e físicos. Os microrganismos fazem parte dessa tecnologia, no caso dos fungos, são utilizados como agente de biocontrole. Do mesmo modo, foi encontrado que o Cladosporium cladosporioides que melhorou significativamente o crescimento das plântulas do tabaco in vitro quando foram cultivadas em conjunto, com uma possível participação dos compostos orgânicos volateie (COV) que produzia o fungo (Diby e Kyung, 2013).
As espécies de Cladosporium são reconhecidos por produzir distintos cladospolideos (Figura 6), que são metabólitos secundários, responsáveis pelo regulamento do crescimento da planta a que está associado (Si et al., 2011). Os diferentes cladospolideos têm funções específicas, como o cladospolideo A, que inibem o crescimento das plântulas como arroz ou alface, enquanto, ao contrário, o cladospolideo B promove o crescimento destas plantas. O cladospoideo C, também tem função de inibição da germinação das plantas. Alguns autores, como Reddy et al., 2013; Si et al., 2011; Zhang et al., 2001, publicaram que o efeito antifúngico de extratos de Mucor racemosus e Pyricularia oryzae, que são dois fungos fitopatogênicos que acumulam cladospolideos como metabólitos. O cladosporol foi isolado do filtrado de cultivo de C. cladosporioides como um indutor da inibição da formação das hifas em Phytophthora capsici. Sabe-se que o cladosporol é um β-1 inibidor da biossíntese de 3-glucano do patógeno (Sakagamia et al., 1995)
Cladosporium cladosporioides é produtor de cladosporina, isocladosporina, 5-hidroxiasperentina, 6,5´-diacetil cladosporina (Figura 7). Estas moléculas são constituintes químicos isolados, que apresentam atividade antifúngica e propõe-se que essas moléculas servem como possíveis candidatos para o desenvolvimento de produtos agroquímicos antifúngicos contra alguns patógenos de plantas (Wang et al., 2014).
As espécies de Cladosporium endófitos têm atividade entomopatogênica. Os fungos entomopatógenos são os que produzem patogênese em insetos, importante na biotecnologia agrícola sendo uma forma de biocontrole dos insetos, diminuindo o uso de inseticidas mais potencialmente tóxicos, portanto, podendo contribuir para diminuir o risco de contaminação ambiental (Vega et al., 2008).
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Cladosporina Isocladosporina 5-hidroxiasperentina 6,5’-diacetilcladosporina
(C16H20O3, PM= 292,3 g/mol) (C16H20O3, PM= 292,3 g/mol) (C16H20O6, PM= 308,3 g/mol) (C16H20O6, PM= 394,0 g/mol)
Figura 5. Substâncias isoladas de Cladosporium cladosporioides com atividade antifúngica
(Wang et al., 2014).
Assim, é possível observar que pesquisas com produtos naturais têm sido uma estratégia simples e bem sucedida que vêm contribuindo para a descoberta de novos medicamentos. Fármacos oriundos de produtos naturais (moléculas similares, derivados e análogos) ainda consistem na maioria das moléculas aprovadas pelo Food and Drug Administration-FDA (perto de 57,7%) e nos países industrializados, estima-se que 25% dos medicamentos prescritos e registrados contêm constituintes ativos derivados do reino vegetal (Newman et al., 2009). No campo terapêutico a disponibilidade de agentes quimioterápicos efetivos para o tratamento de doenças causadas por micro-organismos é limitada, além disso, estes agentes, normalmente, apresentam uso restrito por vários fatores: baixa potência, baixa solubilidade, elevado potencial tóxico e necessidade de tratamento de longa duração (Soares e Cury, 2001).
O Brasil é um país que tem pelo menos 10-20% do número total de espécies do planeta, com uma fantástica diversidade vegetal (Brasil, 1998). A família Annonaceae está amplamente distribuída no Brasil (Santos, 1993), além de ser um grupo de plantas que tem importância farmacológica crescente (Paulo et al., 1992).
Os fungos endofíticos formam uma interação simbiótica significativa, subministrando vantagens para o desenvolvimento do organismo com o que estão associados e este, por sua vez, permite o desenvolvimento de fungo (Zhang et al., 2006). Devido à elevada relação endófito-planta, é possível que o fungo possa biossintetizar moléculas que são, inicialmente, atribuídos á planta hospedeira (Zhang et al., 2006). Logo é interessante estudar os fungos endofíticos para entender a complexidade da interação endófito-planta e, além disso, seu grande potencial para aplicação na biotecnologia e na indústria farmacêutica.
Portanto, neste trabalho buscou-se realizar estudo para a busca de agentes bioativos potenciais e a implementação de estudos sistemáticos com o fungo endofítico (AC-1), isolado das folhas de A. cacans (Annonaceae), com vistas à obtenção de substâncias bioativas a partir do estudo químico, biológico e biotecnológico do endófito.
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1.2. Considerações sobre a família Annonaceae
A família Annonaceae foi estabelecida por Antoine Laurent De Jussieu em 1789 (Silva, 1982) é uma das maiores famílias da Ordem Magnoliales (Maas et. al., 2001) com perto de 135 gêneros e 2500 espécies (Lobão et al., 2012; Châtrou, et al., 2004). Seus representantes constituem-se de árvores, arbustos e raramente lianas (Chatrou et al., 2004; Di Stasi, 2002). Dos gêneros que compõe esta família, 34 podem ser encontrados na América do Sul. No Brasil as Annonaceae estão representadas por 29 gêneros e 385 espécies. Destes, 7 gêneros e 158 espécies são consideradas endêmicas. No Brasil predominam os gêneros Annona, Duguettia, Guatteria e Xylopia (Lobão et al.,2012; Maas et al., 2010, 2001; Kiill e Costa, 2003; Santos, 1993; Rocha, et al., 1981). Segundo Maas e colaboradores (2001), do total dos 29 gêneros que ocorrem no Brasil, 19 gêneros e aproximadamente 153 espécies foram encontrados na região Central e Leste do Brasil (Maas et al., 2001). Após revisão morfológica, o gênero Annona incorporou às espécies do gênero Rollinia e tornou-se um dos maiores em número de espécies da família Annonaceae (Lopes e Mello-Silva, 2009; Kavati, 1992, apud Scaloppi, 2004).
Economicamente as espécies da família Annonaceae são bastante importantes, sendo conhecidas principalmente por seus frutos comestíveis, tais como a fruta-do-conde ou ata (Annona squamosa L.) e a graviola (A. muricata L.). Além disso, algumas espécies fornecem madeira própria para carpintaria e raízes utilizáveis como cortiça (A. glabra L. e A. crassiflora Mart.) outras são consideradas medicinais (A. spinescens Mart. e A. foetida Mart.) ou ornamentais (A. cacans Warm. e Xylopiasericeae A. St.- Hil) (Corrêa, 1984).
Na medicina tradicional as espécies da família Annonaceae são utilizadas por suas propriedades antiparasitárias, anti-inflamátoria e inseticida (Aciole et al., 2011; Villar e Canavate, 1983). Destaca-se ainda pelo número de espécies utilizadas na medicina tradicional os gêneros Annona, Xylopia, Guatteria (Schultes,1993). Algumas espécies do gênero Unonopsis são utilizadas por índios da Floresta Amazônica no tratamento de demência senil, bem como o seu extrato como veneno para flechas em caçadas. Os índios Huaraoni utilizam a infusão de cascas de Guatteria spp. para a redução de febre, já os Guajá fazem uso de espécie não domesticada de Guatteria em borrifos medicinais (Cormier, 2005). Os principais metabólitos secundários encontrados em Annonaceae são os alcaloides, com destaque para a classe dos isoquinolinicos (Guinaudeau et al., 1994), sobre os quais há muitos estudos sobre atividades famacológicas e biológicas. Também se destacam as acetogeninas que são encontradas exclusivamente em espécies da família Annonaceae e são produtos do metabolismo vegetal que contem algumas moléculas com propriedades farmacológicas marcantes. Até o ano de 2005, já haviam sido
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isoladas 417 acetogeninas em diversos gêneros de Annonaceae. As acetogeninas apresentam atividades biológicas, tais como: citotóxica, antitumoral, antimicrobiana, pesticida, antiparasitária e imunossupressora (Cortes et al.,2005). Ainda outros metabólitos secundários como flavonóides, óleos essênciais, lactonas e cumarinas demonstram relevância em termos de moléculas biologicamente ativas. Estudos de suas atividades já foram descritos frente à microorganismos como bactérias, fungos e protozoários, sendo que para óleos essenciais de algumas espécies de Guatteria há relatos de efeito antitumoral in vitro e in vivo (Siqueira et al., 2015; Siqueira et al., 2011; Costa et al., 2010; Leboeuf et al., 1982).
Estudos para a busca dos microorganismos endofíticos relacionados com a família Annonaceae com vistas a aplicações biotecnológicas e a pesquisa de moléculas bioativas levaram ao isolamento de espécies de fungos endofíticos que vivem em associação com estas plantas: Acremonium spp., Aspergillus spp., Chaetomium spp., Colletotrichum spp., Cylindrocladium spp., Fusarium spp., Glomerella spp., Guignardia spp., Metarrhizum spp., Nigrospora spp., Phomopsis spp., Penicillium spp., Pestalotiopsis spp., Trichoderma spp. e Xylaria spp (Souza et al., 2012; Gama et al., 2008; Silva et al., 2006).
1.3. Considerações sobre Annona cacans
Annona cacans, popularmente chamada de cortição, araticum-cagão, araticum-de-paca, quaresma, corticeira, coração-de-boi, anona-cagona, corticeiro (Lorenzi et al., 2006; Maas et al., 2010), possui também a sinonímia científica de Annona quaresma (Saito, 1990; Lorenziet al., 2006). Annona cacans cresce no Sudoeste e Sul do Brasil, nos estados de Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Angely, 1965; Saito, 1990). São árvores de 10-30 metros de altura (Maas et al., 2010), as folhas são glabras, de 8-17 cm de comprimento por 3-6 cm de largura e o pecíolo com 1,5 cm aproximadamente de comprimento, simples, alternas, lanceoladas, de ápice alongado agudo e de base cuneada (ver figura 1). A margem foliar é lisa e a inervação peninérvea com nervuras secundárias emergindo da principal, que apresenta coloração amarelada. (Hoehne et al., 1941; Lorenzi e Matos, 2002). Os frutos medem de 10-12 cm de diâmetro apresentam, quando maduros, coloração verde amarelada e são providos de casca lisa levemente escamiforme e desenhadas. (Hoehne et al., 1941). A morfologia das sementes revela que estas são de forma orbicular, de superfície lisa e de cor marrom escura, e apresenta em média 11,1 mm de comprimento, 7,5 mm de largura e 4,5 mm de espessura com cerca de 5040 sementes por quilo (Furlan et al., 2002).
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Figura 6. Exemplar de Annona cacans cultivado no IB-UNICAMP e utilizado nestes estudo.
A. árvore, B. folha.
Estudos químicos em partes do tronco, caules finos, folhas, flores e frutos de A. cacans revelam a presença de flavonóides como o eriodictiol 7,3', 4'-trimetil éter; a 4’,5-diidroxi-3’,7-dimetoxiflavanona; a rutina e a 4’,5-diidroxiflavona-7-O-glicosídeo; alcalóides, incluindo: assimilobina, michelalbina e liriodenina; aristolactamas como a aristolactama B-II, aristolactama A-II e estefarina e ácido fenólico como o ácido p-cumárico (Saito, 1990), cujas estruturas estão apresentadas na Figura 2.
Figura 7. Substâncias previamente isoladas de Annona cacans (Saito, 1990).
eriodictiol - 7,3', 4'-trimetil éter rutina 4’,5-diidroxi-3’,7- dimetoxiflavanona 4’,5-diidroxiflavona-7-O-glicosídeo
(C18H18O6, PM = 330,11 g/mol) (C27H30O16, PM = 610,52 g/mol) (C17H14O6, PM = 314,07 g/mol) (C23H23O10, PM = 416,0 g/mol)
Asimilobina Anonaina Michelalbina Liriodenina
(C17H17NO2, PM = 267,32 g/mol) (C17H15NO2, PM = 265,31 g/mol) (C17H15NO3, PM = 281,30 g/mol) (C17H19NO3, PM = 275,25 g/mol)
estefarina aristolactama B-II aristolactama A-II ácido p-cumárico
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2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Investigar parâmetros microbiológicos, condições de crescimento e o potencial metabólico, vizando a busca de produtos naturais bioativos do fungo endofítico AC-1 isolado de A. cacans.
2.2. Objetivos específicos
I. Realizar a caracterização microscópica e macroscópica do fungo endofitico AC-1.
II. Efectuar a caracterização genetica do fungo endofitico AC-1.
III. Cultivar o fungo endofitico AC-1 em pequena escala nos meios líquidos (300 mL
de Czapek, ME, YM, Sabouraud-Dextrose e Nutritivo) e extrair os extratos brutos.
IV. Realizar cinética de crescimento de AC-1 em cada um dos meios utilizados para a
obtenção dos extratos brutos.
V. Obter o perfil químico dos extratos brutos por CLAE-DAD/ESI-MS.
VI. Avaliar a atividade antimicrobiana (frente a bactérias positivas e
gram-negativas e frente a espécies de Candida) e determinar a concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos, das frações e das substâncias isoladas bioativas, quando em quantidades suficientes para a realização destes ensaios.
VII. Avaliar a atividade antioxidante (DPPH e ORACFL) dos extratos, frações e
substâncias isoladas, quando em quantidades suficientes para a realização destes ensaios.
VIII. Proceder ao fracionamento, isolamento e identificação estrutural de substâncias
bioativas produzidas pelo fungo endofítico AC-1 no meio de cultura que foi selecionado para cultivo em escala ampliada.
