Obtenção dos extratos brutos e análise do perfil químico por CG-MS, CLAE-UV-DAD,

3.7.1. Pequena escala

O fungo endofítico AC-1 foi cultivado em agar PDA a 25±2°_{C /7dias e esta quantidade de}

inóculo foi utilizada, individualmente, para iniciar a cultura nos cinco diferentes meios de cultura líquidos (ME, YM, Nutritivo, Czapek e Sabouraud-Dextrose), cada um com um volume de 300mL

e incubados a 25±2°_{C /120rpm, durante 28 dias. Decorrido o período de incubação, a biomassa}

foi filtrada, separando a biomassa do meio líquido. A biomassa seca foi pesada, estimando-se o rendimento em biomassa e o caldo do meio de cultura foi submetido à extração para obtenção do extrato bruto, onde foram adicionanados 120 mL de acetato de etila e a solução extrativa foi submetida á extração acompanhada de banho de ultrasson por 30 min (procedimento de extração repetido três vezes). Após separação das fases em funil de separação e filtração em algodão, a fase de acetato de etila foi evaporada em um evaporador rotatorio sob pressão reduzida para remoção do solvente e obtenção do extrato bruto em acetato de etila (Anexo 2). O extrato bruto foi envasado, deixado secar o solvente restante, pesado e determinado o rendimento em massa de extrato que foi utilizado para a análise química e biológica subsequente (Rabal, 2011).

3.7.2. Escala ampliada

O fungo endofítico AC-1 cultivado em ágar PDA foi usado para preparar uma solução de

esporos a uma concentração de aproximadamente 1X109 _{esporos/mL, mediante contagem em}

câmara de Neubauer em solução NT (vide composição no Anexo 1) e uma alíquota (1 mL) da suspensão de esporos foi imediatamente inoculada em um volume de 1000 mL do meio de

cultura líquido extrato de levedura e malte (YM) e incubado a 25±2°_{C /120rpm durante 28 dias.}

Decorrido o período de incubação, a biomassa foi filtrado, separando a biomassa do meio líquido. A biomassa seca foi pesada, estimando-se o rendimento em biomassa e o meio de cultura líquido foi submetido à extração para obtenção do extrato bruto (metabólito secundário), onde foram adicionados 200 mL de acetato de etila e a solução extrativa foi submetida a banho

43 Crescimento em meio liquido YM para este procedimento utilizou-se um volume de 1000 mL. Incubação: 25±2°_{C /200 rpm/28dias.}

Calcular numero de esporos

S/n de esporos aprox. 1X109 _esporos/mL

Perfil químico

de ultrasson por 30 min (procedimento de extração repetido três vezes). Após filtração com algodão, a fase de acetato de etila foi aubmetida a secagem utilizando-se um evaporador rotatorio sob pressão reduzida para remoção do solvente organico do extrato (Figura 8). O extrato bruto foi envasado, deixado secar o solvente restante, pesado e determinado o rendimento em massa do extrato que foi utilizado para a análise química e biológica subsequente (Rabal, 2011).

Figura 8. Fluxograma da extração e analises do extrato bruto em escala ampliada.

Inoculação

1- extrair com AcOEt, acetato de etila (3X 120 mL); 2- Evaporar solvente

Filtração Biomassa

Pesar em balança analitica

Extrato bruto

Fracionamento

Ensaio Antioxidante

(DPPH e ORAC-FL) Ensaio Antimicrobiano (Bactérias e Fungos) CLAE-DAD-ESI-MS

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3.7.3. Análise Qualitativa por CG e CLAE

3.7.3.1. Preparo das amostras (clean-up) para as analises.

Utilizando-se a cromatografia em fase gasosa (CG) e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), traçou-se o perfil cromatográfico dos extratos da planta in natura (A. cacans, folhas) e obtidos do fungo endofitico AC-1 em pequena escala e/ou em escala ampliada.

Para tanto, 10,0 mg dos extratos brutos foram submetidos (clean-up) a uma coluna C-18 (Altech, pe, 3,0 mL) e eluídos, consecutivamente, com água (9,0 mL), metanol: água (1:1, v/, 9,0 mL), metanol (9,0 mL), diclorometano (9,0 mL) e hexano (9,0 mL), sendo os solventes evaporados (Schinor et al., 2004)

3.7.3.2. Analises dos extratos por CG-MS.

Para as analises por CG-MS as frações diclorometânicas foram dissolvidas em 100,0 L

de diclorometano, sendo injetado 1,0 L destas soluções. As análises foram realizadas em

equipamento CG-MS modelo GC 2010/QP2010 Plus (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) equipado com injetor automático AOC-20i (Shimadzu), utilizando analisador de seletivo de espectrometria de massas (MS) e coluna capilar Durabond-DB5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm), empregando procedimento analitico de acordo com metodologia descrita por Stefanello et al. (2008): rampa de aquecimento 60 ºC por 3 min e, em seguida, foi programada uma rampa de 80- 300ºC com aumento de 5 ºC/min e depois mantido em isoterma a 300 ºC por 5 min. O gás de arraste foi hélio (1 mL/min) e a temperatura do injetor e do detector foi 300 ºC. As análises foram realizadas no modo de injeção split 1:10 (v/v). A análise de MS foi realizada empregando-se voltagem 70eV com taxa de aquisição de 0,3s para massas no intervalo entre 40 a 600 Da. Os componentes voláteis das amostras foram identificados pela análise dos espectros de massas por comparação com aqueles encontrados na literatura (ADAMS, 2007; ADAMS, 1995) e de banco de dados (NIST, 2005) do equipamento.

3.7.3.3. Analises dos extratos por CLAE-UV-DAD.

As condições cromatograficas usadas para a análise por CLAE-UV-DAD em escala analítica do extrato bruto metanólico das folhas de A. cacans e dos extratos brutos em acetato de etila do fungo endofítico AC-1 cultivado nos diferentes meios de cultura foram:

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- Aparelhagem: cromatógrafo líquido shimadzu-LC 20AT, equipado com duas bombas LC 20AT shimadzu, detector por varredura de espectro ao ultravioleta por arranjo de fotodiodos (UV/DAD) SPD-M20A, sistema de controle CBM-20A e autoinjetor SIL-20A HT com volume de injeção de 20,0L.

- CLAE em fase reversa utilizando coluna Shim-pack Prep-ODS (H) KIT (250,0 x 4,6 mm x 5 m). Como fase móvel utilizou-se duas condições: Condição 1: a composição da fase móvel variou em gradiente linear de metanol:água da seguinte forma: agua deionizada na bomba A e metanol grau HPLC na bomba B, em gradiente: 0-1 min, 10% B; 1-10 min, 10-100% B; 10-15 min, 100% B; 15-20 min, 100-45% B; 20-30 min, 45% B; 30-40 min, 45-10% B. Tempo de corrida

de 40 min. Para outras análises empregou-se a Condição 2: fase móvel isocratica MeOH/H2O

(1:1, v/v). A vazão da fase móvel permaneceu a 0,5 mL/min e com volume de injeção de 5,0L. Detecção por varredura de espectro de 200 a 800 nm com acompanhamento no comprimento de onda de 254 nm.

3.7.3.4. Análises dos extratos por UHPLC-ESI-MS

Para a análise cromatográfica em escala analítica das amostras por UHPLC-MS foi utilizado um cromatógrafo líquido Acquity acoplado com um espectrômetro de massas TDQ Acquity (Micromass-Waters Manchester, England), com fonte de ionização ESI, usando uma coluna C18 BEH Waters Acquity (2,1mm x 50mm x 1,7µm tamanho de partícula). O método utilizado foi: como fase móvel utilizou-se duas condições - Condição 1: O método utilizado foi: solvente A (água Milli Q + acido fórmico 0,1%) e solvente B (metanol tipo HPLC), a vazão foi de 0,2 mL/min, com um tempo final de corrida de 12 minutos começando o gradiente de eleição com 5% de metanol até 100% no minuto 9,0 mantendo a concentração do solvente até o minuto 10,0 e finalmente a partir de 10,1 min voltando a situação inicial e permanecendo até o minuto 12,0. Para outras analises empregou-se a Condição 2: solvente A (água Milli Q + acido fórmico 0,1%) e solvente B (metanol tipo CLAE), a vazão foi de 0,2 mL/min, com um tempo final de corrida de 7 minutos começando o gradiente de eleição com 10% de metanol até 100% no minuto 5 mantendo a concentração do solvente até o minuto 5,5 e finalmente a partir de 5,51 min voltando a situação inicial e permanecendo até o minuto 7,0. Usou-se a detecção nos modos íon negativo e modo íon positivo nas seguintes condições: Voltagem do capilar 3,00 KV, Cone 30,00 V, Temperatura da fonte 130°C, Temperatura de dessolvatação 250°C. As massas analisadas estão na faixa entre 100 a 800 m/z. Na identificação dos íons foi realizado uma dissociação

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induzida por colisão (CID) e os espectros MS/MS foram comparados com os padrões das substancias encontradas na literatura (Energia de colisão 30 V).

3.8. Fracionamento dos extratos brutos ativos, isolamento e purificação dos