Atividade antimicrobiana dos extratos brutos de AC-1 cultivado em diferentes meios de

Os resultados da atividade antimicrobiana dos extratos de AC-1 mostraram efeito bacteriostático nas concentrações avaliadas. Frente a bactérias gram negativas como E. coli e P. aeruginosa não foi possível detectar nenhum efeito inibitório até a maior concentração de extrato avaliada. No caso das técnicas usadas como a técnica de sensidisco e a técnica do poço em camada dupla não foi possível detectar efeito inibitório e isto pode ter ocorrido por dificuldade de difusão dos constituintes do extrato no ágar, devido ás características físico-quimicas das substâncias presentes no extrato que é uma matriz complexa, com mistura de várias substâncias. Na técnica de microdiluição este problema da difusão não é o ponto critico sendo o ensaio realizado em solução. Dos extratos o que apresentou melhor atividade antimicrobiana foi o YM inibindo a 6 dos 10 microorganismos estudados, variando a inibição dos diferentes grupos de microorganismos, desde bactérias gram negativas como S. typhimurium, como bactérias gram positivas e algumas cepas de Candida. Em geral o conjunto dos extratos na concentração de 2,50 e 1,25 mg/mL apresentaram ação biostática frente a 8 dos 10 microorganismos estudados, mostrando atividade antimicrobiana, especialmente para as bactérias gram-positivas e as Candidas. Estudos realizados por Geetha et al., (2011) mostraram que o extrato AcOEt obtido de espécies do gênero Cladosporium spp. apresentaram atividade antimicrobiana contra S. aureus, E. coli e P. aeruginosa, sendo a atividade considerada bactericida pelos autores, esta informação permite determinar o potencial que apresenta este gênero de fungo filamentoso frente a bactérias gram positivas e gram negativas. Sem duvidas, os resultados obtidos neste trabalho não favoreceram a inhibição das indicadoras utilizadas sejamas bactérias Gram negativas ou as gram positivas, sugirindo que as substancias presentes nos extratos de AcOEt do fungo AC-1 cultivado nos diferentes meios não manifestaram atividade antimicrobiana nas condições experimentais estudadas. Isto pode ter ocorrido por uma serie de fatores tais como: efeito de antagonismo das substâncias que compõem o extrato, concentração de substâncias

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antimicrobianas na mistura complexa do extrato, predomínio de substancias que não apresentavam efeito antimicrobiano, dentre outros fatores.

No entanto algumas das substâncias isoladas como o ácido trans-cinâmico (substância

1) e as dicetopiperazinas Rel.ciclo(Pro-Ile) (substância 2) e Rel.ciclo(Pro-Phe) (substância 3)

apresentam relatos de atividade antimicrobiana descritos em literatura (Gu et al., 2015; Qi et al., 2009; Milne et al., 1998; Prasad 1995). Qi et al. (2009) realizaram estudo com fungo marinho do gênero Cladosporium sp e os resultados possibilitaram a identificação e isolamento de nove substâncias, estando dentre estes o ácido 3-fenil-2-propenóico, também denominado de ácido cinâmico e as dicetopiperazinas ciclo-(Phe-Pro) e ciclo-(Val-Pro). As dicetopierazinas isoladas demostraram atividade antibacteriana frente a Loktanella hongkongensis com CIM de 80- 200µg/mL, a Kocuria rhizophila com CIM de 100 µg/mL e a Ruegeria sp com CIM de 200µg/mL., sendo a substância isolada ciclo-(Phe-Pro) a que apresentou maior bioatividade contra todas estas cepas indicadoras de bactérias investigadas. Porém, em comparação com os resultados obtidos dos extratos do fungo endofítico AC-1, foi requerido mais de 1000 µg/mL de extrato para se verificar um efeito antimicrobiano. No entanto, sabe-se que os extratos brutos são misturas complexas, sendo constituidos de diferentes tipos de substâncias, podendo ocorrer efeito sinérgico e antagônico de seus constituintes frente a sua bioatividade. De qualquer modo é possível que as substâncias isoladas, tais como o ácido trans-cinâmico e a dicetopiperazina cyclo-(Phe-Pro), dentre outros constituintes, podem estar contribuindo para o efeito antimicrobiano observado para o extrato em AcOEt do fungo endofitico AC-1.

Ainda, é descrito em literatura que dicetopiperazinas, como por exemplo a cyclo-(Phe- Pro), participam no mecanismo do quorum sensing realizado por Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas alcaligenes (Holden et al. 1999), mostrando efeitos indutores ou influentes no

metabolismo microbiano. Quorum sensing é o processo pelo qual os micro-organismos regulam

a densidade populacional através de sinalização química. As moléculas químicas secretadas por microrganismos são uma forma de comunicação intra- e interespécies que auxiliam as bactérias na coordenação do seu comportamento (Holden et al. 1999).

Ainda, Qi et al., (2009) reportaram para a substância isolada ácido cinâmico efeito

antilarvarico contra Bugular neritina (LC50 de 200 µg/mL) e antibacteriano frente a L.

hongkongensis (CIM de 200 µg/mL). Também para as dicetopiperazinas (DKPS), foram

documentadas diversas atividades biológicas, como antitumoral, antimicrobiana (frente a bactérias e fungos) e antilarvárias (Gu et al., 2015; Qi et al., 2009; Milne et al., 1998; Prasad 1995). Estes dados respaldam, de alguma forma, os resultados das atividades biológicas encontrados para o extrato em AcOEt do fungo endofítico AC-1 isolado das folhas de A. cacans,

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sugerindo que este microorganismo é capaz de biossintetizar metabólitos de interesse farmacêutico e biotecnológico.

5.3. Fracionamento, isolamento e perfil químico dos metabolitos secundários do extrato bruto AcOEt do fungo AC-1 cultivado no meio YM em escala ampliada.

O estudo químico dos extratos produzidos pelo fungo endofitico AC-1 resultou no isolamento e na identificação de três moléculas: substância 1 (ácido trans-cinâmico); substância

2 [Rel.ciclo(Pro-Ile)] e substância 3 [Rel.ciclo(Pro-Phe)]. As substâncias 1, 2 e 3 são

provenientes dos fracionamentos do extrato bruto em acetato de etila do fungo endofitico AC-1 cultivado em escala ampliada (1000 mL) no meio de cultura YM. Além disso, varias substâncias relacionadas a m/z produzidas pelo fungo AC-1 não puderam ser indentificadas. Algumas destas substâncias constam das frações purificadas do extrato em acetato de etila de AC-1 cultivado em escala ampliada no meio de cultura YM e estão em analise estando os seus espectros de RMN e de MS/MS sendo obtidos com vistas a identificação estrutural (Anexo 7 e 8) e ainda outras não puderam ser identificadas devido terem sido isoladas com peso em massa inferior a 1mg o que inviabilizou a obtenção dos dados espectrais de RMN e a determinação da sua identificação estrutural.

A riqueza em termos de diversidade quimica das moléculas produzidas pelo fungo endofitico AC-1 cultivado nos vários meios de cultura pode ser visualizada nas analises por CG- MS e UHPLC-MS (Anexo 4 e 7), onde substâncias detectadas na amostra apresentam mesma m/z e tempos de retenção diferentes tratam-se de isômeros que não puderam ser indenticados. Assim outras análises estão sendo realizadas para contribuir com os dados químicos deste fungo endofitico e se entender em termos metabolitos como se da a interação entre o endófito e a planta em que este associado. O estudo químico do extrato bruto produzido por AC-1 nos conduziu ao isolamento de acido cinâmico e de dicetopiperazinas, entre outras substâncias que ainda não puderam ser identificadas, sendo estes dados coerentes com os encontrados em outros estudos com Cladosporium spp (Gu et al., 2015; Qi et al., 2009).

As dicetopiperazinas são conhecidas há mais de cem anos e os estudos com esta classe de moléculas se intensificaram devido as atividades biológicas destas substâncias, com destaque para as atividades relacionadas com os seus efeitos nas funções cardiovasculares e na coagulação sanguinea. Para estas substâncias atividades como antitumoral, antiviral, antifúngica, antibacteriana, agentes anti-hiperglicêmico, afinidades receptoras dos canais de

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cálcio e serotoninérgico, dentre outras, já foram reportadas em literatura (Gu et al., 2015; Qi et al., 2009; Martins e Carvalho, 2007; Milne et al., 1998; Prasad 1995). As DKPS compreendem uma família importante dos metabolitos secundários que são produzidos principalmente por microorganismos (Kelecom 2002). Os nossos resultados mostram claramente que Cladosporium spp. AC-1 isolado das folhas de A. cacans pode produzir substancias bioativas derivados de fenilpropanóides do tipo benzeno e de dicetopiperazinas com componentes químicos com coerencia em termos biogênicos com o perfil metabólito característico de fungos do gênero Cladosporium.

Biossintetizadas a partir de dois ou mais aminoácidos, as dicetopiperazinas são os menores peptídeos cíclicos conhecidos, com ocorrência em diferentes organismos como mamíferos, leveduras terrestres, líquens, fungos, bactérias e actinomicetos marinhos (Adamczeczeski et al., 1995). Apresentam um esqueleto químico, normalmente com centros esteriogenicos, quirais, rígido e funcionalizado, diferenciando-se pelas estruturas dos substituintes da cadeia lateral de cada aminoácido. Assim, as dicetopiperazinas são estruturas promissoras em termos de bioatividade pois possuem a capacidade de se ligarem a uma grande variedade de receptores com alta afinidade, sendo consideradas protótipos potenciais para o desenvolvimento racional de fármacos e novos agentes terapêuticos (Martins e Carvalho, 2007). O ácido trans-cinâmico é um metabólito que participa da biogênese de vários outros metabolitos secundário. Em plantas, o primeiro passo da via biossíntética é a transdesaminação da L-fenilalanina, pela ação da enzima fenilalanina amônia-liase (PAL), resultando no ácido trans-cinâmico (Dewick, 2009). Esta reação é de fundamental importância, uma vez que o ácido trans-cinâmico é responsável pela formação de uma gama de metabólitos secundários, por exemplo, a partir de uma série de hidroxilações metilações enzimática, dá origen aos fenilpropanóides ácido cumárico, ácido caféico, ácido ferúlico, ácido 5-hidroxiferúlico e o ácido sinapílico, dentre outros. É importante ressaltar que o isolamento do ácido trans-cinâmico, reforça o isolamento e identificação da substância Rel.ciclo(Pro-Phe) (substância 3) a qual tem como precursor a L-fenilalanina (Biasetto, 2011; Simões 2007). No entanto, poucas espécies de Annona com os extratos bioativos foram estudadas em termos químicos e, além disso, não é bem conhecida a diversidade microbiana associada a estes táxons vegetais, bem como não foram investigadas como se dão estas interações planta/microorganismos simbiontes e o efeito do endófito na modulação da produção de metabólitos bioativos. Portanto trata-se de um universo químico e biológico inexplorado e que precisa ser estudado dado o potencial destas plantas como fonte de moléculas bioativas, sendo necessario a continuidade dos estudos para

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se confirmar os resultados aquí encontrados e melhor entender em termos metabolicos o que ocorre na associação entre o fungo endofitico AC-1 e a planta A. cacans.

5.3.1. Atividade antioxidante e antimicrobiana das frações e extrato bruto do fungo AC-1