Análises de expressão e de toxicidade em plantas de algodão contendo o gene cry1ia que confere resistência à insetos

Análises de expressão e de toxicidade em

plantas de algodão contendo o gene cry1Ia

que confere resistência à insetos

Carliane Rebeca Coelho da Silva Orientação: Prof Dr. Péricles de Albuquerque Melo Filho

Co-orientação: Dra. Roseane Cavalcanti dos Santos

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO Departamento de Agronomia

Programa de Pós-Graduação em Agronomia Melhoramento Genético de Plantas

Introdução

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Revisão de literatura

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Objetivos

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Material e Métodos

Revisão Bibliográfica

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Aspectos econômicos do algodoeiro

Gossypium hirsutum L. – principal espécie cultivada

Cultivo comercial abrange mais de 100 países,

com área anual superior a 40 milhões de hectares;

Gossypium hirsutum L. – principal espécie cultivada

Cultivo comercial abrange mais de 100 países,

com área anual superior a 40 milhões de hectares;

Situação nacional:

Estimativa para safra 2009/10:

Caroço – 2 milhões de toneladas

Área – 843 mil ha

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Classificação Taxonômica e Botânica do

Gênero Gossypium

 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m

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Classificação Taxonômica e Botânica do

 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m

 Característica da espécie: presença de bráctea protegendo o botão floral

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Classificação Taxonômica e Botânica do

 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m

 Característica da espécie: presença de bráctea

protegendo o botão floral

 Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a emergência

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Classificação Taxonômica e Botânica do

 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m

 Característica da espécie: presença de bráctea

protegendo o botão floral

 Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a emergência

 A flor é do tipo hermafrodita com sistema de reprodução intermediário

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Classificação Taxonômica e Botânica do

 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m

 Característica da espécie: presença de bráctea

protegendo o botão floral

 Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a emergência

 A flor é do tipo hermafrodita com sistema de

reprodução intermediário

 Fruto: maçã que após a maturação transforma-se em capulho

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Classificação Taxonômica e Botânica do

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Principais problemas na cultura do algodão

Alto custo de produção: U$ 1,500 - 3,000/ha

Cerca de 40% são destinados a:

mecanização da lavoura

controle de plantas invasoras

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Principais pragas:

Plutela xylostella

(tarças-das-crucíferas)

Spodoptera frugiperda

(lagarta do cartucho do milho)

Anthonomus grandis (bicudo do algodoeiro) Heliothis virescens (lagarta da maçã) Pectinophora gossypiella (lagarta rosada) Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja)

Técnica de transferência de gens entre espécies vivas que, em condições naturais, não se cruzam

Técnica de transferência de gens entre espécies vivas que, em condições naturais, não se cruzam

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Transgenia

Aplicabilidade da transgenia no melhoramento de plantas

a) Possibilidade de transferir genes sem a limitação imposta pelas barreiras naturais

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Transgenia

b) Maior controle na transferência de genes

específicos (ex. Alguns genes são transferidos em grupo)

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Transgenia

c) Redução de tempo para obtenção da cultivar melhorada (ex. Leva-se entre 5 a 15 anos no

melhoramento convencional)

b) Maior controle na transferência de genes

específicos (ex. Alguns genes são transferidos em grupo)

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Transgenia

c) Redução de tempo para obtenção da cultivar melhorada (ex. Leva-se entre 5 a 15 anos no

melhoramento convencional)

d) Possibilidade de transferência de genes exógenos (ex. gene de bactéria para planta)

b) Maior controle na transferência de genes

específicos (ex. Alguns genes são transferidos em grupo)

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Área com LGM no mundo

Evolução da área cultivada com LGM (em milhões de ha) no período de 1996 a 2008 nos paises industrializados e em crescimento. Fonte: James (2008)

Fonte: James (2008)

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Principais Métodos de Transformação

Absorção de DNA mediada via polietilenoglicol (PEG)

Biobalística

Vetores biológicos (espécies de gênero Agrobacterium)

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Tecnologia Bt

VANTAGENS Especificidade

Redução do uso de pesticidas (menor dano ambiental)

Objetivos

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Objetivo Geral

Avaliar a expressão e a toxicidade da proteína cry1Ia em plantas transformadas de algodão por meio de testes

moleculares e bioensaios conduzidos com a lagarta militar.

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Metas:

Confirmar a inserção do transgene por meio de

ensaios moleculares e análise de seqüenciamento no período de 12 meses

Estimar o nível de expressão da proteína por meio de Dot-ELISA e Western blot no período de 06 meses

Estimar a taxa de mortalidade dos transgenes em Spodoptera por meio de bioensaios de toxicidade no período de 06 meses

Material e Métodos

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Material Vegetal

cv BRS 293

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Transformação Via microinjeção

Surgimento dos primeiros botões florais

O volume de 10 µL (50 ng/µL).

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Amplificação dos Fragmentos por PCR

Extração de DNA (Kit DNA Easy)

Ensaios de PCR (Taq polimerase)

Quantificação (Gel de agarose 1%)

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Amplificação dos Fragmentos por PCR

Primers (1F/3R, 2F/2R e 1F/2R)

Produtos de PCR (gel de agarose 0,8%)

Syber Green (LGC)

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Análise de Integração do DNA por Southern blot

Formas mais simples de determinar em que altura certos genes estão sendo expressos

DNA genômico digerido com enzimas específicas

Transferência para membrana de nylon

Pré-hibridização

Hibridização com sonda fria (BioNick, Invitrogen)

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Análise do Seqüenciamento

LGBS/UFRPE

Primer 2F/2R (fragmento de 360 pb)

Purificação (Kit SNAP, Invitrogen)

Amostra: 100 ng/ul

MegaBace1000 (Amersham/GE Healthcare)

Análise da seqüência (Sequence Analyzer)

Edição (BioEdit version 7.0.9.0)

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Extração e Quantificação das proteínas

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Dot-Elisa

Material vegetal

Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )

Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)

24 transformantes

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Dac-ELISA

Material vegetal

Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )

Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)

24 transformantes

Dac-ELISA

Técnica utilizada para detectar expressão protéica

Técnica imunológica: uso de anticorpos

Quantitativa.

Muito sensível.

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Western blot

 Estuda o perfil de expressão protéica.

Tecnica comparativa

 Os extratos protéicos são separados por eletroforese, sistema SDS-PAGE

 As proteínas transferidas para membrana de nitrocelulose.

 Os procedimentos posteriores seguirão de acordo com o descrito em Sambrook et al (1989).

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Bioensaio

Material vegetal

Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )

Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)

 24 transformantes

Bioensaio

Folhas liofilizadas (metodologia descrita por Martins et al., 2001)

Larvas de Spodoptera no segundo estágio

Placas com 24 poços, contendo oito repetições

Leitura feita a partir de 48h até o sétimo dia

Taxa de mortalidade será calculada pela por meio da formula de Abbot (1925).

Resultados esperados

Identificar eventos de elite expressando a proteína CryIa em uma dosagem igual ou superior a 50 ng/µg de tecido.

Cronograma:

Planejamento das atividades e revisão da literatura

x Defesa da dissertação D N O S A J J M A M F J x x x x x x x Elaboração de relatório x x x x

Redação de artigos para eventos científicos

x x x x x x x x x x x x Revisão de literatura M x x x x x x Ensaios de toxicidade x x x Western blot x x x Dot ELISA x x x

Extração e Quantificação das proteínas

x x x x x Análise de seqüenciamento x x x x

Análise de integração do DNA via Southern

x x x Ensaios de PCR x x x x x x D N O S A J J M A M F J Atividades moleculares (2010) J Atividades complementares (2009/2010) F M A M J J A S O N D Atividades complementares (2011) Elaboração da dissertação