État de l’art de la mesure de spectre des forces actives et de la

1.3.4 État de l’art de la mesure de spectre des forces actives et de la viola-

1.3 La microrhéologie de la cellule eucaryote 33

élastiqueG(ω)de la cellule. En utilisant une expression similaire¹² à l’équation1.18, Lau et al.trouvent que le spectre des forces s’exerçant dans la cellule est une loi de puissance Sˆ_f(s)∼s⁻². Cette valeur de l’exposant a été interprétée comme le spectre d’un créneau de force.

D’après l’équation 1.18, pour un comportement en loi de puissance de la réponse de J(τ)∼τ^β et du déplacement quadratique moyen∆x²(τ)∼τ^α on s’attend à un comporte- ment en loi de puissance du spectre des forces¹³ :

Sˆ_f(s) = ∆xˆ²(s)

2s²J(s)ˆ ² ∼s^2β−α−1∼s^λ. (1.30) Selon la découverte de Lauet al.,λ =−2, on aurait une relation directe :α =2β+1. En fait ce résultat est critiquable car les deux mesures sont prises à deux endroits de la cellule (intracellulaire pour la mesure passive et extracellulaire pour la mesure active).

1 10 100

ω(rad/s) 10-18

10-17 10-16 10-15 10-14 10-13

Δ(ω) (J2 s/m3 )

F9J774A.1

ω^-2 Δr2 >2(µm2 )

10.00

0.01 0.10 1.00

τ(s) 10-5

10-4 10-3 10-2 10-1

100 F9

J774A.1

τ^1.5

FIGURE 1.17 – À gauche, déplacement quadratique moyen d’un couple de billes phagocytées (microrhéologie à deux points) dans des cellules épithéliales cancéreuses F9 et des macrophages J774A [16]. Cette fonction suit la loi de puissanceh∆x²(τ)i ∼τ^1.5. Ce comportement sur-diffusif (exposant plus grand que 1) indique un effet des forces non-thermiques. À droite, la mesure active de Fabryet al.[28] de magnétocytométrie, permet de tracer le spectre des forces thermiques (droite en pointillé) s’exerçant dans les cellules F9 et J774A. Cette même mesure, couplée aux mesures des fluctuations de la figure de gauche permet de tracer le spectre des forces actives et thermiques s’exerçant dans ces cellules. (adapté de [55]).

Le travail de Bursacet al.[14] tente de vérifier cette relation en sondant l’actine cor- ticale avec des microbilles ferrimagnétiques recouvertes de RGD. Bursac et al. utilisent

12. L’expression estS_f(ω)≈6πa|G(ω)|²C(ω)oùC(ω)est la transformée de Fourier de la fonction d’au- tocorrélation de la position.C(ω)est reliée au déplacement quadratique moyen. L’utilisation deC(ω)leur permet de rester en transformée de Fourier, chose intéressante carG(ω) est calculée directement dans l’es- pace fréquentiel de Fourier.

13. Une loi de puissance dans l’espace temporel implique une loi de puissance dans l’espace fréquentiel donc siJ(t) =A(_t^t

0)^β alors sa transformée de Laplace est de la forme ˆJ(s) =AΓ(1+β)(_s^s

0)^−1−β.

ces sondes pour l’approche active et passive sans toutefois faire les deux mesures de rhéo- logie exactement sur le même objet. Ils calculent le déplacement quadratique moyen des sondes pour des cellules soumises à différentes drogues capables d’inhiber certains pro- cessus biologiques ainsi qu’à différentes températures (figure1.18A). Ils utilisent : le DB- cAMP, drogue diminuant la contractilité cellulaire, le jasplakinolide qui stabilise l’actine, ils appauvrissent la cellule en ATP et font des mesures à 23^◦C, 37^◦C et 41^◦C. Les fluctua- tions des billes oscillent entre des périodes de confinement et des périodes de mouvement dirigé. Il en résulte l’existence de deux régimes : aux temps courts, le déplacement qua- dratique moyen a un comportement sous-diffusif, aux temps longs il a un comportement sur-diffusif. Ces deux régimes existent quel que soit le processus biologique inhibé par les drogues. En outre, ces drogues ont un effet sur l’amplitude des fluctuations. Sur la fi- gure1.18B, Bursacet al. ont tracé l’exposant local¹⁴ du déplacement quadratique moyen pour les cellules de contrôle à 23°C et pour les cellules appauvries en ATP. De plus, la me- sure active de magnétocytométrieG(ω)permet de calculer¹⁵ le déplacement quadratique moyen prédit à l’équilibrevia le théorème de fluctuation-dissipation. Ils comparent donc les exposants prédits à l’équilibre et ceux réellement mesurés (figure1.18B), ce qui permet de faire une première estimation de l’écart à l’équilibre. Aux temps courts, ces mesures approchent l’équilibre mais aux temps longs elles divergent par rapport aux prédictions du théorème de fluctuation-dissipation. La carence en ATP maintient le système à l’équilibre sur des temps plus longs.

Enfin, sur la figure1.18C, la prédiction de Lauet al.qui lie les exposants∆x²(τ)∼τ^α etJ(τ)∼τ^β est vérifiée. Seulement, les couples de points (α, β) ne s’alignent pas sur la droiteα=2β+1, suggérant une autre valeur de l’exposant du spectre des forcesλ =2.5 au lieu de 2. Les deux études de Lauet al.et Bursacet al.ont le défaut d’utiliser des sondes différentes, aucune conclusion ne peut en être tirée quant à l’amplitude des fluctuations des forces.

Mesure de l’amplitude du spectre des forces

Activité des gels d’acto-myosines

L’intérêt de l’étude des forces actives des cellules est de comprendre le rôle et le com- portement des moteurs moléculaires. Au lieu de travailler sur des organismes cellulaires complexes, il peut être enrichissant afin de mieux les comprendre, d’observer le comporte- ment de modèles simples tels que les gels d’actines. Ces gels peuvent être rendus actifs par ajout de myosines II et cette activité est contrôlée par la présence ou l’absence d’ATP. Mi- zumoet al.[68] mesurent les propriétés mécaniques d’un gel actif d’actine à l’aide de billes magnétiques dont ils enregistrent ensuite les fluctuations. Ils peuvent ainsi comparer¹⁶les

14. L’exposant local est la pente locale en échelle logarithme-logarithme.

15. ∆x²(τ) =F⁻¹

2k_BT aiωG(ω)

oùF⁻¹désigne la transformée de Fourier inverse.

16. Dans cet article [68], la partie imaginaire de la fonction de réponse du gel actifα⁰⁰est comparée au terme ^ωC(ω)_2k

BT oùC(ω) est la transformée de Fourier de la fonction d’autocorrélation de la position de la particule. Dans ce cas le théorème de fluctuation-dissipation s’écritα⁰⁰=_2k^ω

BTC_eq(ω).

1.3 La microrhéologie de la cellule eucaryote 35

10⁵ 10⁶

10⁴ 10³ 10² 10¹ 10⁰

2

1

10^–2 10^–1 10⁰ 10¹ 10²

0.01 0.1 1 10 100

2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0

1.6 1.8

1.4 1.2 0.2

0.01.12 1.14 1.16 1.18 1.20 1.22 1.24

A

B C

FIGURE 1.18 – Courbes : 22^◦C (vert), 37^◦C (orange), 41^◦C (violet), DBcAMP (bleu), Jasplaki- nolide (rouge),ATP depletion (noir). Figure A : déplacement quadratique moyen de billes-RGD attachées au cytosquelette par l’intermédiaire des intégrines. Figure B : exposant du déplacement quadratique moyen en fonction du temps∆t (rond) et exposant de la prédiction de celui-ci par le théorème de fluctuation-dissipation (carré). Figure C : exposantαen fonction deβ+1 pour vérifier la relation de Lauet al.(α=2β+1 [14]).

deux mesures à l’aide du théorème de fluctuation-dissipation. Sur la figure1.19A, la partie imaginaire de la fonction de réponse est confondue avec la fonction de corrélation des fluc- tuations, le gel est à l’équilibre. Mais, cinq heures plus tard (figure1.19B), une différence entre les mesures actives et passives est observée¹⁷, le système s’écarte de l’équilibre aux temps longs (ω >10 Hz). Au-delà de cette fréquence le système apparaît figé par rapport à la durée du cycle des myosines et donc on n’observe pas d’écart à l’équilibre.

Activité dans le cytoplasme

La première étude de spectre de l’amplitude du spectre des forces dans une cellule en utilisant exactement la même sonde a été effectuée par Robert et Wilhelmet al.[83]. Ils ont

17. On peut émettre l’hypothèse que le retard de 5 h est le temps nécessaire pour que le gel s’organise complètement.

FIGURE 1.19 – Figure A : comparaison des mesures actives α⁰⁰ et passives ^ωC(ω)_2k

BT pour un gel d’actine et de myosine. Au début de l’expérience les deux courbes se superposent, symptôme d’un système à l’équilibre. Figure B : Même chose que la figure A, cinq heures plus tard. Au-dessous de 10Hz les contributions des myosines sont observables et le gel se retrouve hors de l’équilibre thermodynamique. (d’après [68]).

quantifié le spectre des forces actives sur des endosomes magnétiques (figure1.20droite).

La particularité de leur expérience est de faire à la suite la mesure de microrhéologie pas- sive puis active. Ceci permet de s’affranchir de l’hétérogénéité et des disparités dans la cellule. Le déplacement quadratique moyen mesuré sur des cellules saines montre un com- portement sur-diffusif sur l’échelle de temps de 0.1−10s (figure1.20A) et le spectre des forces actives est largement au-dessus de celui à l’équilibre calculé à l’aide de la mesure de microrhéologie active. Il s’agit ensuite d’identifier les processus biologiques à l’origine des forces actives. Pour cela, des cellules sont droguées avec du nocodazole, qui dépolymérise les microtubules ce qui permet d’étudier leur rôle dans la génération de force. En effet, les endosomes sont connus pour avoir un mouvement dirigé le long des microtubules à l’aide de moteurs moléculaires, les kinésines et les dynéines. Le déplacement quadratique moyen s’en trouve largement modifié et se rapproche de celui calculé à l’équilibre (figure1.20B).

Le système est alors proche de l’équilibre thermodynamique (figure 1.20 gauche). Dans un deuxième temps, Robert et al. mesurent le rôle des filaments d’actine en les dépoly- mérisant avec de la latrunculine A. L’utilisation de cette drogue n’a pas un effet important sur l’amplitude des fluctuations de la sonde (figure 1.20C) qui est encore largement sur- diffusive. Mais la combinaison des mesures actives et passives montre que le spectre des forces se rapproche de celui à l’équilibre. Ceci montre l’importance de la double mesure active-passive, car la dépolymérisation de l’actine a un effet à la fois sur le mouvement de la sonde et sur la viscoélasticité de la cellule et donc sur le spectre des forces thermiques.

Pour déterminer les acteurs biologiques responsables des forces en utilisant des drogues et ainsi mesurer si le système se trouve ou non à l’équilibre, il est nécessaire de connaître

1.3 La microrhéologie de la cellule eucaryote 37

l’amplitude des fluctuations et la viscoélasticité du milieu dans lequel baigne la sonde.

FIGURE1.20 –À gauche : En traits pleins, le déplacement quadratique moyen∆x²(τ)des chaines d’endosomes. En traits pointillé, le déplacement quadratique moyen ∆x²_eq(τ) calculé en utilisant le théorème de fluctuation-dissipation à partir de la mesure active. La courbe A correspond à des cellules de contrôles avec un cytosquelette intact. Sur la courbe B, les mesures ont été effectuées sur des cellules droguées avec du nocodazole. Le nocodazole permet de dépolymériser les microtubules.

Sur la courbe C, les cellules sont droguées avec de la latrunculine A qui dépolymérise les filaments d’actine. À droite, le spectre des forces ˆSf calculé à partir des deux approches de microrhéologie.

En pointillé, le spectre des forces ˆSfeq calculé viala microrhéologie active en faisant l’hypothèse que le système est à l’équilibre. D’après [83].

C HAPITRE 2 Dispositif expérimental et méthodes

Sommaire

2.1 Approche expérimentale . . . 40 2.2 Pince optique . . . 41 2.2.1 Histoire et principe . . . 41 2.3 Montage expérimental . . . 43 2.3.1 Montage de la pince optique . . . 43 2.3.2 Cale piézoélectrique . . . 43 2.3.3 Calibration du piège optique . . . 46 2.3.4 Échantillon expérimental . . . 49 2.4 Acquisition d’images et détection de particules . . . 50 2.4.1 Caméra rapide . . . 50 2.4.2 Détection de particules . . . 51 2.4.3 Limitations expérimentales . . . 52 2.5 Calcul des transformées de Laplace . . . 54 2.6 Calcul des moyennes et des erreurs statistiques . . . 54

2.1 Approche expérimentale

moteurs moléculaires cortex d'actine

R G D bille de silice (1.56 µm)

intégrines membrane plasmique protéines liant le cytosquelette aux intégrines protéines réticulantes

cellule C2C12 (myoblaste) billes attachées au cortex

FIGURE2.1 –À gauche, photo d’une cellule C2C12 sur laquelle sont attachées des billes de silice couvertes de RGD. À droite, schéma simplifié de la géométrie du contact entre la bille et l’actine corticale.

Le but de ce travail est d’étudier les forces stochastiques d’origine bio-chimique s’exer- çant dans le réseau d’actine sous-membranaire. Nous avons choisi de travailler avec des cel- lules musculaires connues pour leur activité provenant de moteurs moléculaires. En effet, les cellules myoblastes C2C12 (figure 2.1gauche) vont se différencier en myotubes dans lesquels l’activité des myosines II génère la contraction musculaire. Ces cellules seront étudiées en position d’étalement sur un substrat recouvert de fibronectine (partie2.3.4).

Pour extraire ces informations du cytosquelette, nous avons besoin d’une sonde. Nous utilisons une bille de silice de 1.56µm de diamètre préalablement recouverte de RGD (par- tie2.3.4). Celle-ci va se lier au réseau d’actine corticale par l’intermédiaire des protéines transmembranaires : les intégrines (figure2.1droite).

Les fluctuations de la bille rendent compte des mouvements du réseau d’actine sous- membranaire. Il est possible de suivre la trajectoire de la bille avec un microscope et une caméra rapide, et d’exercer sur elle des forces à l’aide d’une pince optique. On a accès aux déplacements de la bille sur seulement deux dimensions (x et y) correspondant au plan du substrat. Au demeurant, les déplacements dans la troisième dimension sont très limités, une cellule étalée sur un substrat étant beaucoup plus grande dans les dimensions parallèles au substrat que dans la dimension perpendiculaire. De plus, les billes placées au dessus du noyeau sont exclues de l’étude. À cet endroit, la surface de la cellule n’est pas du tout plane et un petit déplacement suivant les axes parallèles au substrat entraine une variation d’altitude qui altère la qualité de l’image par défocalisation. Les positions de la bille pour chaque film sont déduites des enregistrements en utilisant un algorithme de suivi de particule (partie2.4.2).