On vient de voir comment une cellule devient cancéreuse suite à une exposition à des facteurs cancérigènes. Une cellule intègre des mutations génétiques sur plusieurs gènes qu’elle va transmettre à ces cellules filles. Ce transfert n’est possible que si les gènes qui régulent la réparation de l’ADN, la prolifération cellulaire et/ou l’apoptose sont mutés. Les tumeurs se développent à partir de ces cellules anormales transformées. Il a été montré que certaines cellules tumorales parviennent à quitter leur état malin pour retrouver un phénotype tumoral significativement atténué. Ce phénomène est la « réversion tumorale ». La réversion tumorale n’implique à priorie pas de changement dans la séquence nucléique et ce terme est employé pour désigner la réapparition d’un phénotype moins malin au sein de cellules tumorales (Pollack et al., 1968).
Une cellule normale arrête de proliférer quand elle est en contact avec les cellules voisines, ou quand elle n’est plus sur un support. Une cellule tumorale pousse de façon anarchique, en contact les unes des autres, elles continuent à pousser formant des multi-couches de cellules.
De plus ces cellules cancéreuses sont capables de pousser sans support ou en « soft agar ».
Lors de la réversion tumorale, les cellules révertantes retrouvent les caractéristiques de croissance des cellules normales et ce sont ces deux principaux critères qui vont permettre de distinguer les cellules tumorales et les cellules révertantes.
La découverte de cellules redevenues sensibles à l’inhibition de contact dans une population de cellules de souris NIH3T3 infectées par le virus oncogène SV40 (Sarcoma Virus 40) a ouvert la voie de la réversion tumorale. Les cellules NIH3T3 sont des cellules normales qui sont isolées à partir de fibroblastes embryonnaires de souris et contrairement à d’autres lignées cellulaires, elles ont gardé certaines caractéristiques des cellules normales comme l’inhibition de contact. Lorsque ces cellules arrivent à confluence, elles entrent en phase G1 et arrêtent leur prolifération. Lorsque ces cellules sont infectées et transformées par le virus oncogène SV40, elles acquièrent des caractéristiques de cellules tumorales comme la perte d’inhibition de contact et poussent anarchiquement. En 1968, Pollack et Green ont isolé à partir de ces cellules NIH3T3 transformées par l’oncogène SV40, des clones ayant retrouvé spontanément les caractéristiques des cellules NIH3T3 non-transformées. Pour sélectionner les clones révertants, ils ont utilisé la drogue FuDR (FlUorouridine-DesoxyRibose) sur les cellules à confluences. La drogue FudR est cytotoxique pour les cellules lors de la synthèse de l’ADN en phase S. A confluence, les cellules transformées continuent à proliférer et sont éliminées par la drogue alors que les clones révertants qui ont arrêté leur prolifération survivent. Ces clones ont une morphologie légèrement différente des autres cellules, ils sont plus plats et plus adhérents en culture. Ces clones ont également une capacité réduite à former des tumeurs chez le hamster. Ils ont été nommés « Flat Revertants » en raison de leur morphologie. Il a également été montré que ce n’était pas la perte du virus qui expliquait la perte de tumorigénicité de ces clones révertants (Macpherson et al., 1971).
Plusieurs travaux ont permis ensuite d’isoler et de caractériser d’autres révertants à partir de cellules tumorales selon différentes techniques de caractérisation : leur morphologie en culture, leur incapacité à pousser sans ancrage (en matrigel), leur perte de pouvoir tumorigène après injection dans des animaux immunodéficients ou leur baisse de sensibilité à des agents cytotoxiques comme la drogue FudR. Les travaux de Pollack et Green ont été confirmés avec d’autres cellules et d’autres virus à ADN (le polyoma virus) ou à ARN (le virus du sarcome
de Rous, le virus du sarcome murin de Kristen) (Rabinowitz et al., 1968) (Noda et al., 1983).
Ces études ont également montré qu’il était impossible de ré-infecter des révertants avec le même virus ayant servi à la première transformation. Mais il a été mis en évidence que ces clones pouvaient être sensibles à l’infection par un autre virus (Vogel et al., 1974) (Stephenson et al., 1973). Les clones révertants ont donc quelques caractéristiques qui les distinguent des cellules tumorales dont ils sont issus. Ils résistent au virus si on les réinfecte avec le même virus, ils ne poussent pas en Soft-Agar car ils ont perdu leur indépendance d’ancrage et ils sont beaucoup moins tumorigènes quand on les injecte dans des animaux.
Mais cette réversion tumorale ne s’accompagne pas d’une différenciation ; en effet leur morphologie diffère peu des cellules tumorales parentales et l’analyse de certains marqueurs de différenciation n’a pas révélé de différence d’expression entre les deux types de cellules.
Afin d’identifier les mécanismes enclenchés lors du processus de réversion tumorale, Adam Telerman et Robert Amson ont choisi de travailler avec des cellules tumorales possédant déjà de nombreuses mutations et caractéristiques des cancers dont sont issues ces cellules. Pour isoler des clones révertants à partir de cellules tumorales, ils ont utilisé le Parvirus-H1 qui a la propriété de détruire les cellules cancéreuses et d’épargner les cellules normales (Van Pachterbeke et al., 1993).
Le Parvovirus-H1 comme agent de sélection
Ce virus de la famille des Parvoviridae est un virus autonome non enveloppé à ADN linéaire simple brin. Son cycle lytique dépend de l’état de différenciation et de prolifération de la cellule hôte. Le Parvovirus-H1 est un virus qui a la propriété d’être oncolytique vis-à-vis des cellules tumorales et il est capable d’inhiber la formation de tumeurs chez les animaux de laboratoire (Rommelaere et al., 1991). Le Parvovirus-H1 se réplique dans le noyau des cellules infectées, mais ne s’intègre pas à leur génome. La réplication de l’ADN simple brin viral s’effectue au cours de la phase S sous le contrôle de la machinerie de la cellule hôte.
Dans ces expériences, le Parvovirus-H1 est utilisé comme un agent de sélection des cellules ayant perdu de leur tumorigénicité (Fig. 11).
Figure 11 : Isolation de cellules révertantes.
Une lignée cellulaire contenant des cellules tumorales et quelques cellules révertantes sont infectées par le parvovirus-H1. Les cellules tumorales infectées sont lysées alors que les cellules tumorales résistent à l’infection.
Des modèles à partir de lignées cellulaires tumorales
Les premiers modèles de révertants obtenus à partir de cellules tumorales furent obtenus dans une lignée cellulaire de leucémie érythrocytaire (K562) (Telerman et al., 1993). L’infection par le Parvovirus-H1 a abouti à une mort cellulaire massive. Après quelques semaines de maintien en culture, quelques cellules résistantes à l’effet cytotoxique du virus, environ 1 cellule sur 1 million, ont émergé. Parmi ces cellules résistantes, le clone KS a présenté un phénotype tumoral atténué. Ensuite deux autres clones révertants US3 et US4 ont été obtenus suite à l’infection d’une lignée cellulaire de leucémie (U937) par le Parvovirus-H1 (Nemani et al., 1996). Ces clones US3 et US4 n’induisent quasiment pas de tumeurs quand ils sont injectés à des souris immunodéficientes scid-scid en comparaison aux cellules parentales U937. Leur phénotype tumorigène est significativement atténué. Le criblage de 18 antigènes de surface n’a montré aucune différence entre les clones révertants KS, US3 et US4 et les cellules parentales K562 et U937 ; ces clones ne se sont donc pas différenciés (Fig. 12).
(D’après Tuynder et al., 2002 et Tuynder et al., 2004) Figure 12 : Caractérisation des clones révertants.
A : culture en soft-agar ; calcul du nombre de cellules. B : tumorigénicité in vivo ; mesure du volume de la tumeur après injection de cellules dans des souris scid/scid. C : Analyse par PCR pour détecter la présence de Parvovirus-H1 dans les cellules.
Pour compléter les modèles de révertants, de nouveaux modèles ont été développés à partir de lignées cellulaires issues de tumeurs solides d’adénocarcinome colorectal (DLD-1), de carcinome de poumon (A549) et de mélanomes (WM-266-4, WM-115, SK-MEL-28 et Hs852T) (Tuynder et al., 2004). Tous ces révertants possèdent des caractéristiques de cellules normales ; ils ne poussent pas en matrigel car ils ont perdu leur indépendance d’ancrage, ils n’induisent pas de tumeurs dans des souris immunodéficientes et certains présentent une augmentation de l’apoptose en comparaison aux lignées parentales d’origine. On peut noter que cette apoptose est indépendante de P53 puisque dans ce type de lignées cellulaires tumorales la protéine P53 est mutée. Certains de ces clones révertants produisent le Parvovirus-H1 et l’on ne peut pas exclure que le virus aide à l’apparition de cellules révertantes. Mais on a noté dans les nouveaux modèles de révertants issus de lignées cellulaires T47D, BT20 et MDA-MB231 provenant de tumeurs solides de cancer du sein que certains clones ne contenaient plus le Parvovirus-H1 mais avaient tout de même les caractéristiques de révertants (Tuynder et al., 2002) (Fig. 12).