J'ai débuté la biologie en 1996 au sein du Groupe Recherche et Développement de la société Genset. L'objectif des recherches menées par Adam Telerman et Robert Amson est de comprendre les voies moléculaires impliquées dans la récidive tumorale et de développer de nouvelles thérapies contre le cancer basées sur ces connaissances.
1 - INTRODUCTION GENERALE
Cette transition permet l'activation du facteur de transcription E2F après la phosphorylation de la protéine RB (Giacinti et Giordano 2006). Une phase d'initiation durant laquelle les mitochondries reçoivent des signaux induisant l'apoptose pouvant provenir de l'activation de la protéine P53.
2 - LA TRANSFORMATION CELLULAIRE
La protéine P53 est inhibée en se liant aux oncogènes et aux protéines virales pour conduire à la transformation cellulaire. C : site consensus dans le promoteur siah1b pour l'activité de la protéine P53 et de la luciférase.
3 - LA REVERSION TUMORALE
Une lignée cellulaire contenant des cellules tumorales et quelques cellules révertantes a été infectée par le parvovirus-H1. Par la suite, deux autres clones révertants US3 et US4 ont été obtenus après infection d'une lignée cellulaire de leucémie (U937) par le Parvovirus-H1 (Nemani et al., 1996).
4 - GENES IMPLIQUES DANS LA REVERSION TUMORALE
La protéine YED-Z a été révélée lors de la caractérisation de nouvelles protéines membranaires chez la bactérie Escherichia coli (Drew et al., 2002). Contrairement aux autres membres de la famille STEAP, le gène tsap6 est transcrit de manière omniprésente dans la plupart des tissus humains normaux ( Porkka et al., 2003 ). Et inversement, la délétion de la protéine NIX provoque la croissance de cellules cancéreuses et le développement de tumeurs (Fei et al., 2004).
Les exosomes sécrètent également des protéines anti-apoptotiques de la cellule, telles que ALIX, la thiorédoxine peroxydase ou le TCTP (Amzallag et al., 2004). La première structure publiée du TCTP (1H6Q et 1H7Y) était la structure RMN de la protéine de la levure Schizosaccharomyces pombe (Baxter et al., 2000) (Thaw et al., 2001). Ces sites de modification post-traductionnelle pourraient être impliqués dans le fonctionnement de la protéine.
Le TCTP peut jouer un rôle dans l'homéostasie cellulaire grâce à son interaction avec la partie catalytique α de la protéine Na, K-ATPase ( Jung et al., 2004 ). Lors de la transition métaphase-anaphase, la protéine TCTP se détache des µ-tubules (Gachet et al., 1997). Ces protéines sont impliquées dans l'étape d'élongation de la synthèse des protéines (Cans et al., 2003) (Langdon et al., 2004).
La surexpression de TSAP6 dans les cellules induit une augmentation de la sécrétion de TCTP par ces vésicules. Chez les souris transgéniques, la surexpression du TCTP induit une hypertension artérielle par répression de la pompe Na, K-ATPase (Kim et al., 2008).
5 - APPROCHE EXPERIMENTALE
Le knock-out d'un gène signifie la perte physique de la séquence (ou d'une partie de la séquence) de ce gène entraînant l'absence d'ARN messager et donc de la protéine. Le knock-in d'un gène consiste à modifier la séquence d'un gène qui conduit à la transcription d'un ARN messager et à la traduction d'une protéine mutée. Par recombinaison homologue, la construction sera insérée dans le génome de la souris à l'emplacement souhaité.
La construction qui servira de base à la recombinaison homologue doit d'abord contenir deux régions d'homologie avec le locus cible encadrant la séquence d'intérêt pour permettre la recombinaison de la construction dans le génome de la souris. S'il s'agit d'une expérience de knock-out de gène, seule la cassette de sélection NeoR est placée entre les deux régions homologues, lors de la recombinaison la cassette NeoR remplacera le gène d'intérêt que l'on souhaite supprimer. La construction linéaire est introduite par électroporation dans des cellules ES dérivées de la lignée de souris 129/Sv.
Pour cette raison, les cellules ES recombinantes sont micro-injectées dans la cavité (blastocèle) des blastocystes avant d'être replacées dans l'utérus de la femelle pseudo-enceinte, c'est-à-dire préparée à recevoir l'embryon. Les souris de la lignée 129/Sv dont sont issues les cellules ES ont un pelage agouti (poils noirs avec une bande subapicale jaune), les souris de la lignée C57BL/6 dont sont issus les blastocystes ont un pelage noir uniforme. A ce stade les souris homozygotes obtenues possèdent le même génome que les souris sauvages à l'exception de 2 cassettes loxP situées de part et d'autre de la séquence que l'on souhaite éliminer.
6 - RESULTATS
Pour compléter cette caractérisation, nous avons examiné l'expression de la protéine TSAP6 au niveau tissulaire par Western Blot. A à D : Colocalisation de la protéine TSAP6 avec des marqueurs de Golgi (TGN38) et des endosomes (TF-R et EEA1) par immunofluorescence en MEF (A et B), NIH3T3 (C) et MEL (D). A : analyse par cytométrie en flux de la présence de TF-R à la surface des cellules sanguines.
A et B : analyse par Western blot de TF-R pendant la maturation des réticulocytes (A) ou dans les BMDC (B). Les souris déficientes en gène TSAP6 présentent également un défaut dans la capacité à bloquer les cellules en G2 lors de l'activation de la protéine P53. Les souris KO pour le gène TSAP6 présentent un déficit dans la voie de l'apoptose.
E : Analyse par Western blot du clivage de PARP et de l'activation de P21 et TSAP6 dans la rate d'animaux irradiés. Nous nous sommes ensuite intéressés à la stimulation de la sécrétion des exosomes après l'activation de la protéine P53. Analyse par Biacore de la liaison du TCTP au TSAP6 en présence des médicaments Sertraline et Thioridazine.
7 - DISCUSSION
Expression of the human TPT1 gene encoding translationally controlled tumor protein (TCTP) is regulated by CREB transcription factors. The translationally controlled tumor protein is a novel calcium-binding protein in the human placenta and regulates calcium handling in trophoblast cells. Backbone NMR assignment of the 19 kDa translationally controlled tumor-associated protein p23fyp from Schizosaccharomyces pombe.
The mRNA of the translationally controlled tumor protein P23/TCTP is a highly structured RNA that activates the dsRNA-dependent protein kinase PKR. Identification of the interaction between the human recombinant histamine-releasing factor/translationally controlled tumor protein and elongation factor-1 delta (also known as eElongation factor-1B beta). Identification of heavy metal-induced changes in the expression patterns of the translationally controlled tumor protein (TCTP) in the earthworm Lumbricus rubellus1.
Promoter structure and complete sequence of the gene encoding translationally controlled tumor protein (TCTP) P23. Expression of the gene and processed pseudogenes encoding human and rabbit translationally controlled tumor protein (TCTP). Siah-1b is a direct transcriptional target of p53: Identification of a functional p53 response element in the siah-1b promoter.
Identification of the functional p53 responsive element in the siah-1b promoter
Cloning and mutagenesis. The siah-1b promoter region (nucleotides⫺2613兾⫺1694) was cloned into the pGL3-enhancer vector (Promega). The siah-1b p53 binding element was mutated (CATG to TATA) within the first half of the site (siah-1b mut1) or within the second half of the site (siah-1b mut2) using the QuikChange Multi SiteDirected Mutagenesis kit (Stratagene). Z19579), while the specific probe for siah-1b (probe b) corresponds to nucleotides 1兾230 in the 5⬘UTR of the mRNA (accession no.
This analysis confirmed that the siah-1 CDS probe used previously ( 23 ) recognizes both siah-1a and siah-1b. The relative positions of the siah-1a and siah-1b probes (black bars) used for Northern blot analysis are also indicated. The identified p53RE is functional, despite its unusual structure. p53 binds to the siah-1b promoter in vitro.
Electrophoretic mobility shift assay was performed with a probe corresponding to the p53RE of the siah-1b promoter (nucleotides⫺2160兾⫺2098). By establishing a direct link between p53 and transcriptional regulation of the siah-1b gene, our study further supports the importance of the latter in the p53 response. Electrophoretic mobility shift assay was performed with a probe containing the p53-responsive element of the siah-1b promoter (nucleotide lanes 1–4, 7, and 8).
B and C) HeLa cells overexpressing TSAP6 are specifically delayed in the G2 phase of the cell cycle. The mammalian target of rapamycin, located downstream of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) signaling pathway, was reported to participate in the regulation of such translationally controlled elements [25,26] . ClustalW multiple alignment of Tpt1 sequences showing similarity between Tpt1 genes residing on different chromosomes.
To determine which of the Tpt1 genes is (are) expressed, we performed reverse transcription of total RNA from the mouse M1 cell line. When analyzing 1.35 kb upstream of the ATG, we found a TATA box in a typical position (⫺30 nts from the transcription initiation site). Only the expression of the transcript amplified by the Chr 6/14 Tpt1 primer could be detected in the analyzed mouse tissues.
Probes specific for each chromosome were designed at the 5⬘end of the gene as follows: Primers. We thank Biospace Mesures (10 Rue Mercoeur, 75011 Paris, France) for the quantification of Northern blots. Boehm, et al., The growth-related protein P23 from the Ehrlich ascites tumor: translational control, cloning, and primary structure, Biochem.
These results suggested that persistent H1 parvovirus infection is not necessary to maintain the suppressed malignant phenotype in all the revertants. The PCR analysis shows that both revertants of DLD-1, one of the two revertants from A549, and none of the melanoma revertants are H1-positive (Fig. 1C). The limiting dilution assay of A549 parental and revertant clone CL-1 shows that 32% of the revertant cells produce infectious H1 particles (Fig. 4B).
In one of the two colon revertant models (DLD-1 CL-16), one of the lung (A549 CL-46) revertant models, and all the melanoma revertant models, the level of the protein was significantly reduced (Fig. 1D ). The cell density at confluence is another parameter we tested to better define the flat revertants obtained by inhibition of the expression of TCTP. These results suggest that targeting TCTP and reducing its expression level in v-src-transformed NIH3T3 leads to strong reversion of the malignant phenotype.
A correlation between the cytopathic effect and inhibition of TCTP expression can be observed. Administration of the drugs 2 days prior to injection of tumor cells (early stage model) greatly reduced tumor growth in the animal (Figure 3C). These results suggest that not all reversion pathways would involve TCTP inhibition.
