Pvd de P. aeruginosa PAO1 a) Structure

IV.2.2. Pvd de P. aeruginosa PAO1

Lorsque la Pvd chélate le fer, la fluorescence du chromophore est éteinte par ce métal.

Cette propriété renseigne sur la forme vide ou complexée de la Pvd, et permet donc de distinguer les formes apo et ferrique de la Pvd ((Schalk et al., 1999) (Schalk et al., 2002)). La propriété de fluorescence de la Pvd permet également de suivre in vivo et en temps réel les cinétiques de dissociation des complexes ferri-pyoverdine (Greenwald et al., 2007). Il a été montré plus récemment que la Pvd peut également complexer de nombreux autres métaux (Ag⁺, Al³⁺, Cd²⁺…) mais avec des affinités moindres. Selon le métal chélaté, les propriétés spectrales et de fluorescence de la Pvd sont modulées (Braud et al., 2009). Les spectres d’émission de fluorescence des Trp de FpvA (maximum d’émission de la fluorescence à 337 nm) et d’absorption de la Pvd (maximum d’absorption à 380 nm) se recouvrent, cela rend possible un transfert d’énergie de fluorescence entre ces deux entités si la distance entre elles est inférieure à 10 Å. Ainsi, un transfert d’énergie a lieu uniquement lorsque la Pvd est liée au récepteur FpvA. Il est donc possible d’observer l’émission de fluorescence de la Pvd via le FRET (pour Fluorescence Resonance Energy Transfert) en excitant les Trp de FpvA à 295 nm. Avec cet outil, il est possible de différencier le complexe FpvA-Pvd fluorescent du complexe FpvA-Ferri-pyoverdine non fluorescent (figure 30) et de suivre in vivo et en temps réel le transport du fer chez P. aeruginosa par la voie Pvd ((Schalk et al., 1999) (Schalk et al., 2002)). En effet, ce transport se traduit par un signal caractéristique représenté dans la figure 30. Les cellules sous excitation à 295 nm sont fluorescentes à 450 nm, cette fluorescence serait due au fait que tous les récepteurs FpvA à la surface cellulaire sont chargés en Pvd.

Après ajout de la ferri-pyoverdine, il y a diminution de la fluorescence due à la formation du complexe FpvA-Ferri-pyoverdine non fluorescent. Sur le récepteur, la Pvd est échangée par la ferri-pyoverdine. La remontée de la fluorescence a été tout d’abord attribuée à un recyclage dans le milieu extracellulaire de la Pvd sur le récepteur FpvA après le transport et la dissociation dans le périplasme du complexe ferri-pyoverdine ((Schalk et al., 2002) (Greenwald et al., 2007)). De nouvelles données du laboratoire suggèrent que cette remontée de fluorescence serait indépendante du recyclage de la Pvd, mais liée plutôt à du FRET entre la Pvd et une protéine périplasmique contenant des résidus Trp encore non identifiée (communication interne, résultats non publiés).

Figure 29 : Caractéristiques spectrales de la Pvd (Schalk et al., 1999)

Le spectre d’absorption de la Pvd (maximum d’absorption à 380 nm) et le spectre d’émission de fluorescence des Trps de FpvA (maximum d’émission de fluorescence à 337 nm), se recouvrent. Cela permet un transfert d’énergie de fluorescence entre les deux entités.

Figure 30 : Visualisation par FRET des interaction FpvA-Ferri-pyoverdine lors transport du fer via la Pvd (Schalk et al., 2002)

c) Biosynthèse et maturation

La biosynthèse et la maturation de la Pvd de P. aeruginosa PAO1 ont été les plus étudiées. La combinaison des approches génomiques (identification des gènes impliqués dans la synthèse de la Pvd et attribution des fonctions aux protéines correspondant à chaque gène) et biochimiques (vérification des hypothèses émises par les approches génomiques) a permis la compréhension des différentes étapes impliquées dans la biosynthèse et la maturation de la Pvd (Visca et al., 2007). Les protéines indispensables à la synthèse et à la maturation de la Pvd sont codées par plusieurs gènes localisés dans le locus pvd (pvdDEHIJLNOPQ). Ces gènes codent pour des NRPSs (pour Non Ribosomal Peptide Synthetases) multimodulaires cytoplasmiques (pvdIJDLH) (Ravel & Cornelis, 2003), un transporteur ABC (pvdE) (McMorran et al., 1996) et des enzymes de maturation périplasmiques (pvdNOPQ) (figure 31A) (Lewenza et al., 2005).

La biosynthèse de la Pvd démarre dans le cytoplasme par l’assemblage d’un précurseur non fluorescent par les NRPSs : la ferribactine (Merriman et al., 1995). Les NRPSs PvdIJD assemblent séquentiellement des dérivés des précurseurs des acides aminés, les NRPSs PvdLH interviennent dans la synthèse du précurseur du chromophore (Lehoux et al., 2000). Avant leur incorporation définitive dans la chaîne peptidique de la ferribactine par les NPRSs, certains acides aminés subissent des modifications chimiques par PvdHFA (Visca et al., 2007). L’export du précurseur non fluorescent de la Pvd (ferribactine) à travers la membrane interne vers le périplasme est assuré par le transporteur ABC PvdE (McMorran et al., 1996). Dans ce compartiment cellulaire, la ferribactine est transformée en Pvd.

La maturation périplasmique du chromophore par cyclisation est indispensable à la fluorescence de la Pvd. Ce processus commun pour toutes les Pvds impliquerait une série de réactions d’oxydo-réduction (Dorrestein et al., 2003). Mais également les enzymes PvdNOP de fonction non identifiée et l’estérase PvdQ ((Lewenza et al., 2005) (Yeterian et al., 2009)).

Enfin, la Pvd est sécrétée du périplasme dans le milieu extracellulaire par la pompe à efflux PvdRT-OpmQ (figure 31B) (communication interne, résultats soumis).

Figure 31 : Biosynthèse et maturation de la Pvd A : Gènes codant pour des NRPSs intervenant dans la synthèse et la maturation de la Pvd

B : Biosynthèse (dans le cytoplasme), maturation (dans le périplasme) et sécrétion de la Pvd