Pour déterminer si le gène endogène codant ISL1 était exprimé de manière constitutive dans ces différentes lignées, nous avons mesuré les ARNm d'ISL1 par PCR quantitative (Figure 13a). S’ajoutent aux lignées testées en transfection transitoire, les lignées gonadique mLTC1 et rétinienne RGC5. Deux gènes de référence ont été utilisés : ceux de la cyclophilline et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransférase (HPRT). Les résultats sont exprimés en calculant les moyennes des Cp normalisés, c'est-à-dire les Cp de sortie d’Isl1 divisés par les Cp de sortie des gènes de référence, cyclophilline et HPRT. Concernant les cellules GH3, l'HPRT n'est pas un bon gène de référence puisque ces cellules ne l'expriment pas ou très peu (la moyenne des Cp est égale à 28.5 cycles dans les GH3 comparé à 23 cycles dans les autres lignées) en accord avec les données de la littérature (Melmed, 1982). Par contre, les Cp de sortie de la cyclophilline sont beaucoup plus homogènes, en moyenne à 18- 19 cycles. L’HPRT ne constitue pas dans ces expériences une référence adéquate. En revanche, le gène de la cyclophilline affiche un profil d’expression homogène et constitue donc une bonne référence. Si l'on compare les résultats rapportés à la cyclophilline, Isl1 est fortement exprimé dans les cellules L2T2 et les GT1-7, plus faiblement dans les lignées 1T3- 1 et PC12. Dans les lignées GH3B6 et RGC5, Isl1 est peu exprimé et il est indétectable dans les lignées AtT20 et mLTC1. Il y a donc une forte inadéquation entre les résultats obtenus par transfection transitoire traduisant une activité ubiquiste du promoteur d'Isl1 et ceux obtenus par quantification des ARNm illustrant une expression plutôt spécifique du tissu, notamment au niveau hypophysaire : ISL1 étant absent dans les cellules de type corticotrope (AtT20), faiblement exprimé dans les cellules lacto-somatotropes et plus fortement exprimé dans les cellules gonadotropes (1T3-1), notamment les plus différenciées (L2T2). Ces données contrastent avec celles obtenues avec le gène du Gnrhr (Figure 13b). En effet, les niveaux d'ARNm du Gnrhr ne sont détectables que dans les cellules gonadotropes 1T3-1 et L2T2, en adéquation avec les résultats de transfection transitoire.
Pour confirmer ces résultats, les extraits nucléaires des lignées 1T3-1, AtT20, GH3B6, GT1-7, L2T2 et PC12 ont été isolés et analysés par western blot (Figure 14) en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre ISL1 (anti-Isl1 39-4D5). Cet anticorps est produit par un hybridome sécréteur cultivé au laboratoire et obtenu auprès du Developmental Studies Hybridoma Tissue Bank (National Institute of Child Health and Human Development,
180 University of Iowa, Department of Biological Sciences). Ces données confirment partiellement les résultats obtenus par PCR quantitative. L’anticorps révèle dans cette expérience plusieurs espèces immunoréactives dont deux au moins pourraient correspondre aux isoformes d'ISL1, ISLl1 et ISL12 (Ando et al, 2003). La forme alpha de 39 K est la plus abondante. Nous pouvons remarquer l’absence de bande dans les extraits obtenus à partir des lignées cellulaires AtT20 et GH3B6 qui constituent donc de bons témoins négatifs, en accord avec les données obtenues par PCR quantitative. A partir des extraits provenant des autres lignées GT1-7, 1T3-1, L2T2 et PC12, l'anticorps anti-ISL1 révèle les deux espèces moléculaires susceptibles de correspondre aux deux isoformes d'ISL1. Si ces résultats sont globalement cohérents avec ceux obtenus par PCR quantitative, ils diffèrent néanmoins par les niveaux relatifs de protéines (western blot) et d'ARNm (PCR) détectés. Outre des régulations post-traductionnelles, notamment des taux de dégradation différentielle dans les différentes lignées, la localisation intracellulaire des ARNm, majoritairement localisés dans le cytoplasme, et celle des protéines, essentiellement nucléaires, pourraient expliquer ces divergences.
La confrontation des résultats des expériences de transfections transitoires avec celle de mesure des ARNm par PCR quantitative et des protéines par western blot permet déjà d'éliminer l'hypothèse d'une expression ubiquiste d'ISL1, notamment dans les lignées hypophysaires testées. L'hypothèse d'éléments régulateurs localisés à l'extérieur du promoteur de 5 kb fait l'objet d'un projet à part compte tenu de l'ampleur des technologies à mettre en œuvre, notamment la transgénèse transitoire et la mise au point de lignées gonadotropes 1T3- 1 et L2T2 capable d'intégrer dans un site unique du génome murin le gène complet d'ISL1 associé à un gène rapporteur luciférase. Nous nous sommes donc plus particulièrement intéressés aux modifications épigénétiques.
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Figure 13
Analyse de l’expression du gène endogène codant la protéine ISL1 et GnRHR par qPCR en temps réel.
Mesures du taux d’ARNm relatif codé par Isl1 (A) et par Gnrhr (B) dans les lignées hypophysaires 1T3-1, L2T2, GH3B6 et AtT20, dans la lignée hypothalamique GT1-7, dans la lignée neuronale PC12, dans la lignée gonadique mLTC1 et dans la lignée rétinienne RGC5. Ces mesures ont été normalisées : pour Isl1 (A) par rapport à la cyclophilline (en gris) et à l’Hprt (en noir) et pour Gnrhr (B) par rapport à la cyclophilline
182 Figure 14
Étude par Western blot de la protéine ISL1 dans les lignées cellulaires
Des extraits nucléaires des lignées hypophysaires 1T3-1, L2T2, GH3B6 et AtT20, de la lignée hypothalamique GT1-7 et de la lignée neuronale PC12 ont été analysés par western blot en utilisant l’anticorps anti-Isl1 39-4D5.
Après une exposition de 15 secondes, une bande dominante correspondant à l’isoforme Isl11 de poids 39 kDa et une bande plus faible correspondant à l’isoforme Isl12 sont révélées dans les cellules des lignées hypophysaires 1T3-1 et L2T2 ainsi que dans les cellules de la lignée hypothalamique GT1-7 et de la lignée neuronale PC12. En revanche, ces deux bandes ne sont pas détectées dans les cellules des lignées hypophysaires GH3B6 et AtT20.
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