Analyse des images

Pour éliminer la courbure de l’image (due aux non-linéarités du balayage) et pour améliorer le contraste et diminuer le bruit, les images AFM sont "aplaties" en soustrayant une courbe de

AFM Caractérisation et manipulation de molécules individuelles

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + + ADN

mica

poli-L-ornitine

FIG. 3.21 –Schéma qui montre la fonctionnalisation du mica utilisé pour déposer les molécules d’ADN.Le mica clivé (chargé négativement) est recouvert de poly-L-ornitine (qui présente en moyenne 300 charges positives par molécule). De cette façon, on forme une couche de charges positives sur laquelle les molécules d’ADN peuvent facilement venir se fixer.

FIG. 3.22 –Analyse de la longueur d’une molécule d’ADN.On suit le contour de la molécule (tracé avec le programme open source ImageJ). La longueur de contour des molécules d’ADN ainsi estimée est ensuite analysée de façon statistique.

premier ou de deuxième degré de chaque ligne de l’image. Ces images corrigées sont ensuite analysées avec le programme open source ImageJ. Ce programme permet de déterminer le contour des molécules d’ADN et leur longueur. L’histogramme répresentant la distribution des longueurs de contour des molécules d’ADN est à la base de l’analyse des données obtenues par AFM.

Résultats expérimentaux

Chapitre 4

Étude des mécanismes d’action des facteurs de remodelage RSC et ISWI

Les études biochimiques effectuées en volume ont montré que les facteurs de remodelage de la chromatine peuvent influencer la position des nucléosomes le long de la molécule d’ADN, transférer les octamères d’histones d’une molécule d’ADN à une autre, et générer tout une sé- rie d’intermédiaires de la chromatine remodelée. Si certaines conséquences de cette activité (comme la translocation et l’introduction de torsion dans l’ADN) commencent à être caracté- risées, le vrai mécanisme d’action de cette famille de protéines reste largement inconnu. Les expériences en molécule unique, utilisant des techniques de micromanipulation telles que les pinces magnétiques, ou des techniques de visualisation comme l’AFM, offrent une nouvelle approche pour étudier le fonctionnement mécanique et cinétique de ces enzymes. Dans la pre- mière partie de ce chapitre nous revenons sur le formalisme topologique et le comportement de l’ADN sous torsion. Ceci facilitera l’analyse et la compréhension des données expérimentales preséntées en deuxième partie de ce chapitre.

4.1 Formalisme topologique

On sait depuis 1953 que la molécule d’ADN en solution est composée de deux brins qui s’enroulent pour former une hélice droite caractérisée par un pas hélical de 10.5 paires de base correspondant à une distance de 3.6 nm. Le fait que les deux brins d’ADN sont enroulés l’un autour de l’autre implique qu’il est impossible de les séparer sans introduire de coupures dans leur squelette sucre-phosphate et forcer le passage d’un brin à travers l’autre. On peut définir l’indice d’enlacement de la molécule (ou linking numberL_kcomme le nombre de fois qu’il faut couper la molécule d’ADN et effectuer le passage des brins qui constituent la molécule d’ADN pour arriver à les séparer (voir Fig.4.1). On dit que la molécule d’ADN est dans un état relâché si son indice d’enlacementL_kest égal à l’indice d’enlacement naturelL_k0défini par la relation suivante :

L_K0 ≡ N

h (4.1)

oùN est le nombre de paires de base de la molécule ethle pas hélical de la molécule.

Pour caractériser l’état d’enroulement d’une molécule d’ADN, deux grandeurs entrent en compte : la torsade ou TwistTW et la vrille ou Writhe W r. La torsade représente le nombre

Formalisme topologique Mécanismes d’action d’ISWI et RSC

6

Lk = 6 nick suivi par un passage d'un brin et re-ligation

separation des deux brins ADN double

brin

ADN simple brin

FIG. 4.1 –Schéma montrant une molécule d’ADN circulaire ayant un indice d’enlacementL_k0 égal à 6. Une valeur de Lk0= 6 signifie que la molécule d’ADN a 6 tours hélice double brin ou 6 croisements hélice. Si on veut séparer les deux brin de cette molécule d’ADN, on doit effectuer 6 fois une cassure d’un des deux brins de la molécule, forcer ensuite le passage de l’autre brin d’ADN par la cassure et liguer enfin le brin cassé.

de tours qu’effectue un simple brin d’ADN autour de l’autre brin. Pour une molécule d’ADN relaxé, leT_W est égal au nombre d’enlacementL_k0 :

T_W =T_W0 =L_k0 = N

h (4.2)

oùT_W0s’appelle la torsade spontanée de la molécule d’ADN.

La vrille représente le nombre de croisements de l’axe de la molécule avec lui-même. Elle mesure les structures tertiaires de la molécule. Pour une molécule relâchée,W r= 0.

En 1969, White a démontré (théorème de White) que le nombre d’enlacement Lk est un invariant topologique qui comptabilise le nombre total de croisements des deux brins de la molécule [282] :

Lk=TW +W r. (4.3)

Un ADN est dit surenroulé lorsqueL_k 6= L_k0, c’est à dire lorsque la molécule présente un excès ou un déficit d’enlacements par rapport à sa forme torsionellement relâchée. La variation du nombre d’enlacements de la molécule est donc donnée par la relation suivante :

∆L_k=L_k−L_k0 = ∆T_W +W r. (4.4)

En normalisant par rapport au nombre d’enlacements naturels de l’ADN (Lk0), on obtient la densité de surenroulementσ:

σ≡∆L_k/L_k0. (4.5)

Cette façon de normaliser le nombre d’enlacements d’un ADN permet de comparer des mo- lécules de longueurs différentes.σest positif lorsque l’ADN est surenroulé et négatif lorsqu’il est sousenroulé.

Mécanismes d’action d’ISWI et RSC Comportement de l’ADN sous torsion

Lk0 = 16 Tw0 = 16 Wr = 0

Lk = 14 Tw = 14 Wr = 0

Lk = 14 Tw = 12 Wr = 2

I II

FIG. 4.2 –Schéma démontrant les effets induits par un changement de l’indice d’enlacements (L_k) dans la molécule d’ADN.Si on enlève 2 tours d’hélice à une molécule circulaire, on aura dans la molécule une variation deL_k égale à 2. D’après le théorème de White, on peut répartir cette variation entre la torsade et dans la vrille de l’ADN. On peut donc former une molécule d’ADN surenroulé avec un réduction de la torsade de deux unités (I) ou une augmentation de la vrille de l’ADN de la même quantité (II).

L’ADN est généralement superenrouléin vivo, ayant unσcompris entre -0.03 et -0.09 [283]

(Fig.4.3).

Le nombre d’enlacements est un invariant du système. Si des tours sont introduits (ou en- levés) dans une molécule d’ADN, le changement topologique intervenant dans la molécule se répartit entreW r etT_W (voir Fig.2). Un changement dans l’un implique un changement com- pensatoire dans l’autre comme expliqué dans la figure 4.2. En étudiant des molécules d’ADN sur des clichés de microscopie électronique, on a pu évaluer que le rapport ∆T_W/W r vaut environ1/3[284].