Mon travail de thèse a permis d’affiner nos connaissances sur la dynamique des histones H3 en réponse aux dommages de l’ADN grâce à l’exploitation combinée de deux nouvelles technologies, la micro-irradiation laser UVC et le système SNAP permettant le suivi simultané en temps réel des histones parentales et néo-synthétisées. En particulier, les résultats que j’ai obtenus permettent de compléter notre vision du modèle décrivant les réarrangements de la chromatine induits par les lésions de l’ADN, le « modèle Accessibilité- Réparation-Restitution » (Figure 17).
Tout d’abord, nos connaissances concernant les mécanismes contrôlant in vivo l’accessibilité de la chromatine endommagée étaient très limitées (Figure 18). Une étude laisser présager que les histones H3 sont en partie solubilisées après irradiation globale aux UVC (Wang et al., 2006a), une autre suggérait que la chromatine lésée est décondensée (Luijsterburg et al., 2012). Ici, nos résultats démontrent que les histones H3 parentales ne sont pas massivement solubilisées mais au contraire redistribuées en périphérie du site lésé et ce de manière DDB2-dépendante (cf. partie résultats 3, données cohérentes avec l’étude développée par (Luijsterburg et al., 2012)). Une perte de signal correspondant aux histones H1, H2A et H4 ayant été rapportée dans les régions de chromatine endommagées aux UVC (Luijsterburg et al., 2012), il serait intéressant de déterminer également le devenir de ces histones « mobilisées » : sont-elle redistribuées autour de la zone lésée comme H3? Ou sont- elles au moins en partie solubilisées ? Cette analyse permettrait de comprendre comment la dynamique des histones est cordonnée dans l’espace et le temps et d’évaluer sous quelle forme les histones sont « mobilisées » : molécule unique ? dimère ? tétramère ? particule nucléosomale ? En outre, nous avons mis en évidence que la désorganisation de la chromatine en réponse à une irradiation localisée aux UVC est un processus local, et non
Conclusions: Apport des résultats au modèle « Accessibilité-Réparation-Restitution »
l’organisation de la chromatine en territoires chromosomiques (Cremer and Cremer, 2010) régule l’étendue des altérations de la structure de la chromatine après lésions de l’ADN en imposant des barrières structurales au-delà desquelles la chromatine ne peut se désorganiser ? Cette question mérite des recherches complémentaires. Il sera aussi important de prendre en considération que la chromatine n’est pas forcément désorganisée de la même manière en fonction du type de dommages générés (discuté en partie 2.1).
Mon travail de thèse affine également nos connaissances des mécanismes de restitution de l’architecture chromatinienne (Figure 19). En plus de l’incorporation d’histones H3.1 et H2A néo-synthétisées aux sites de chromatine endommagée (Dinant et al., 2013; Polo et al., 2006), nous avons révélé que la mise en place de nouvelles histones H3.3 (cf. résultats partie 1) ainsi que le « retour » d’histones H3 parentales (cf. résultats partie 4) participent à la réorganisation de la chromatine après irradiation locale aux UVC. Non seulement cette dynamique des histones favorise la restitution de la structure de la chromatine (la question du maintien de l’information épigénétique est discutée en partie 2.2) mais elle permet aussi à la chromatine endommagée de redevenir fonctionnelle. En effet, la reprise de l’activité transcriptionnelle de la chromatine endommagée nécessite la présence de HIRA, chaperon de l’histone H3.3. Mais les mécanismes sous-jacents restent à déterminer : le redémarrage de la transcription est-il directement lié à l’incorporation de nouvelles histones H3.3 ? Ou lié au « retour » d’histones H3.3 parentales couplé à la réparation des lésions ? Ou encore la conséquence d’une autre fonction du chaperon HIRA, indépendante de la dynamique des variants H3.3 induite par les dommages de l’ADN ? (cf. résultats partie 2).
L’importance fonctionnelle de la dynamique des histones après stress génotoxique dans les voies de signalisation et de réparation des dommages de l’ADN est encore sous- évaluée. L’étude de ce phénomène chez divers organismes a conduit à l’obtention de données en apparence conflictuelles, comme c’est le cas pour le rôle de H3.3 et HIRA en réponse aux dommages de l’ADN (discuté dans les résultats partie 2.3). En effet, une perte d’expression de l’histone H3.3 chez le poulet (Frey et al., 2014), ou d’une des protéines orthologues de HIRA chez la levure S. pombe (Blackwell et al., 2004; Kanoh and Russell, 2000), conduit à une hypersensibilité à une irradiation aux UVC, ce qui n’est pas le cas après diminution de l’expression de HIRA dans les cellules humaines (nos données). Enfin, dans le modèle
« Accessibilité-Réparation-Restitution », nous considérons généralement que la plasticité de la chromatine associée aux étapes précoces de réparation permet de rendre l’ADN endommagé accessible aux machineries de réparation tandis que la dynamique des histones couplée aux étapes tardives contribue à restituer l’intégrité structurale et fonctionnelle de la chromatine. Néanmoins, cette considération a ses limitations, comme l’illustrent les résultats que j’ai obtenus au cours de ma thèse : le chaperon HIRA est recruté tôt aux sites de dommages UVC, de manière couplée à la détection des lésions, mais ne contrôle pas la
Conclusions: Apport des résultats au modèle « Accessibilité-Réparation-Restitution »
réparation globale de ces dommages dans les cellules humaines. Au contraire, il est requis pour la réactivation de la production d’ARN dans les régions de chromatine réparées, soit quelques heures après qu’il se soit décroché de la chromatine lésée (cf. résultats partie 2.3).
D’autres facteurs de la dynamique de la chromatine régulant la reprise de l’activité transcriptionnelle des cellules endommagées aux UVC sont également recrutés rapidement aux sites de lésions de l’ADN, comme la sous-unité ATPase SMARCA5 (Aydin et al., 2014) et le chaperon d’histones FACT (Dinant et al., 2013). Mais SMARCA5 est impliqué dans le recrutement de CSB, facteur précoce de la réparation TC-NER tandis que FACT persiste plus longtemps que HIRA enrichi dans les régions de chromatine lésées. Donc, l’action précoce et transitoire de HIRA dans le redémarrage de la transcription en réponse à un stress génotoxique semble être caractéristique de ce chaperon d’histones.
Perspectives: Paramètres contrôlant la dynamique des histones en réponse aux dommages