Résultats: Mise en place de nouvelles H3.3 dans la chromatine endommagée
1. Mise en place précoce de nouvelles histones H3.3 par le
Résultats: Mise en place de nouvelles H3.3 dans la chromatine endommagée Pour cette étude, j’ai d’abord analysé par immunofluorescence le recrutement de chaperons d’histones H3 aux sites de lésions induites par les UVC 30 minutes après irradiation locale (Figure 2). Ni les chaperons de H3, ASF1a, ASF1b, NASP ni le chaperon dédié à H3.3, DAXX ne présentent d’enrichissement détectable aux sites de dommages produits par les UVC dans les cellules U2OS. Néanmoins, en accord avec ce qui a été observé après cassures de l’ADN (Adamson et al., 2012), les sous-unités HIRA, UBN1 et CABIN1 du complexe chaperon HIRA, chaperon spécifique de H3.3, sont recrutées dans les régions de chromatine irradiées aux UVC. Comme pour les nouvelles histones H3.3, le recrutement de la protéine HIRA aux sites de lésions est visualisable dans la majorité des cellules endommagées dans les différentes phases du cycle cellulaire. De plus, ce recrutement,a lieu à la fois dans des cellules tumorales et dans des fibroblastes primaires humains (Figure S2).
L’utilisation d’une approche ARN interférence permettant de diminuer l’expression de chacune des sous-unités du complexe HIRA a établi que la sous-unité CABIN1 stimule la relocalisation de la protéine HIRA au niveau des sites de lésions de l’ADN (Figures S2 &
S4). Puis, j’ai appliqué une même approche ARN interférence afin d’étudier le rôle de différents chaperons d’histones H3 dans la mise en place de novo de variants H3.3 aux sites de dommages. Ni CAF-1, ni ASF1, ni DAXX n’est impliqué dans cette mise en place dans les cellules U2OS. Par contre, j’ai démontré que chacune des sous-unités du complexe HIRA favorise l’accumulation de nouvelles histones H3.3 dans les régions de chromatine endommagées aux UVC (Figures 3 & S4). Les cellules transfectées avec un siHIRA sont celles qui présentent le défaut le plus manifeste, sûrement à cause du fait que la protéine HIRA contrôle la stabilité des autres membres du complexe (Ray-Gallet et al., 2011). La protéine HIRA semble aussi réguler indirectement la mise en place de nouveaux variants réplicatifs H3.1 aux sites de dommages induits par les UVC, mais le mécanisme sous-jacent reste à être déterminer (Figure S4).
Je me suis finalement intéressée au mécanisme de recrutement de HIRA dans la chromatine lésée. D’une part, ce recrutement n’est pas altéré dans les cellules U2OS préalablement traitées avec un inhibiteur de transcription (Figure S2). D’autre part, le recrutement de HIRA est précoce, observable dans les minutes qui suivent une irradiation locale aux UVC et transitoire, puisque plus aucune accumulation de ce chaperon d’histone n’est visualisable 5 h après irradiation (Figure 5). En outre, il précède l’enrichissement du chaperon d’histone CAF-1 aux sites de lésions. Ces différences de cinétiques de relocalisation traduisent une dépendance différente vis à vis de la voie de réparation NER : alors que la mise en place de nouvelles histones H3.1 par CAF-1 dans la chromatine endommagée est couplée aux étapes tardives de la réparation (synthèse réplicative, (Polo et al., 2006)), celle de nouvelles histones H3.3 par HIRA n’est pas perturbée en absence de synthèse réparatrice mais dépend de l’activité d’ubiquitylation du complexe UV-DDB, complexe de détection des lésions induites par les UVC. En effet, l’accumulation de HIRA et/ou de
Résultats: Mise en place de nouvelles H3.3 dans la chromatine endommagée nouvelles histones H3.3 dans les régions de chromatine lésées est fortement altérée après baisse d’expression des protéines précoces du NER, DDB1, DDB2 et CUL4A dans les cellules U2OS, sans défaut détectable de l’incorporation basale de nouvelles histones H3.3 (Figures 4 & S5, données non montrées). En outre, l’enrichissement de HIRA aux sites de lésions de l’ADN induites par les UVC n’est pas modifié après baisse d’expression des facteurs TC-NER CSA et CSB (données non montrées) et par perte du facteur tardif de réparation XPG (Figure 4). De plus, la mise en place de nouvelles H3.3 par HIRA est inhibée après perturbation globale des activités d’ubiquitylation (traitement avec un set de siARN contre l’ubiquitine ou par inhibition du protéasome) (Figures 4 & S6). Enfin, l’expression d’une forme dominante négative de CUL4A, capable d’être recrutée aux sites de dommages de l’ADN mais ayant perdu sa capacité de fixer la protéine E2 ubiquitine ligase, inhibe l’enrichissement de HIRA dans la chromatine endommagée (Figure 4). Ainsi, l’ensemble de ces résultats démontre que c’est l’activité du complexe DDB1-CUL4A, plutôt que sa présence, qui est requise pour favoriser le recrutement de HIRA aux sites de lésions de l’ADN générées par les UVC.
En conclusion, les données obtenues ont permis de mettre en évidence une nouvelle voie participant à la restitution de la chromatine après stress génotoxique, avec le chaperon HIRA comme facteur clé de la mise en place de novo de variants H3.3 dans la chromatine endommagée. Elles révèlent en outre que mettre en place des histones néo- synthétisées aux sites de lésions de l’ADN ne nécessite pas forcément que la réparation de ces lésions soit achevée.
1.3. Discussion : comment HIRA est-il recruté aux sites de dommages ?
Le mécanisme contrôlant le recrutement du complexe HIRA aux sites de dommages générés par les UVC n’a pas encore été complètement élucidé. Le facteur de réparation UV- DDB ubiquityle divers substrats en réponse à une irradiation aux UVC, notamment les protéines de la voie NER et les histones (cf. introduction parties 1.2.2 & 3.2.1 et revue (Nouspikel, 2011)). Ainsi, il est possible que ce facteur ubiquityle également le complexe chaperon HIRA, ce qui faciliterait sa redistribution aux sites de lésions de l’ADN. Une analyse à haut débit dans des cellules U2OS n’a néanmoins pas permis d’identifier de changements du niveau d’ubiquitylation des sous-unités du complexe HIRA dans les cellules humaines irradiées aux UVC (Povlsen et al., 2012). Par contre, une étude plus récente a révélé que UV-DDB interagit avec CABIN1, et faciliterait la dégradation de ce membre du complexe HIRA dans les heures qui suivent l’irradiation (Choi et al., 2013). Cependant, nous avons observé que baisser l’expression de CABIN1 par siARN défavorise le recrutement de la sous-unité HIRA aux sites de dommages (Figures S2 & S4), ce qui suggère que la poly- ubiquitylation et dégradation de CABIN1 dépendante du complexe UV-DDB serait plutôt
Résultats: Mise en place de nouvelles H3.3 dans la chromatine endommagée requise pour décrocher HIRA de la chromatine lésée. La possibilité que le complexe HIRA reconnaisse un ou plusieurs facteurs ubiquitylés par UV-DDB aux sites de lésions de l’ADN représente une autre hypothèse qui serait intéressante d’explorer dans de futures recherches.
Enfin, il est aussi fort probable que l’activité du complexe UV-DDB, qui semble être requise pour augmenter l’accessibilité de l’ADN dans les régions de chromatine endommagée (Nouspikel, 2011), permettrait d’exposer de l’ADN nu, substrat reconnaissable par HIRA. En effet, des travaux sur des cellules humaines et chez la drosophile ont démontré que ce chaperon d’histone a la capacité de fixer directement l’ADN (Ray-Gallet et al., 2011) et se retrouve enrichi dans les régions du génome à faible densité de nucléosomes (Ray-Gallet et al., 2011; Schneiderman et al., 2012). De plus, nous avons démontré que la terminaison de la réparation et la mise en place de nouvelles histones H3.3 favorise la dissociation de HIRA de la chromatine endommagée (Figure S5). Donc, ces résultats suggèrent que le complexe chaperon HIRA est recruté aux sites de lésions par l’ADN lésé, dont la densité en nucléosomes a été réduite (modèle en Figure 6).
Résultats: Importance de la voie HIRA pour la reprise de la transcription post UVC