Matériel et Méthodes
3. Caractérisation des protéines membranaires exprimées
125
solution A+B supplémentée en antibiotiques. L’injection est réalisée à l’aide de microcapillaires de verre (3.5’’Drummond # 3-000-203-G/X) étirés (Etireuse horizontale Micropipette Puller P-97, Sutter Instruments Co) puis cassés pour une taille finale de ~10 µm avant d’être remplis d’huile minérale incompressible (Sigma) maintenant l’étanchéité du système. On aspire dans un microcapillaire le mélange des ARNm codant pour les deux sous- unités du canal (ARNm codant pour SUR + ARNm codant pour Kir6.2, dans des proportions respectant la stoechiométrie des deux sous-unités), pour les fusions ABCC-Kir6.2 ou GPCR- Kir6.2, ou encore pour les GPCR seuls dans les conditions suivantes: 2 ng de Kir6.2 pour 6 ng de SUR; 2 ng de Kir6.2∆C36; 5 ng de GPCR-Kir6.2; 2 ng de Kir3.4 S143T; 1 ng de PTX-S1;
2 ng de M2; 2 ng de D2. L’ovocyte est alors empalé à l’aide du microcapillaire et l’ARN est injecté à l’intérieur (Figure 52), à raison de 50 nL par ovocyte. Le remplissage de la pipette et les microinjections sont réalisés à l’aide d’un injecteur à piston (Nanoject, Drummond).
Transcription
in vitro Micro-injection
Synthèse
protéique Patch-clamp
ADNc ARNm Ovocyte de
Xénope
Pipette de patch
Assemblage des sous-
unités Canal
K+
Transcription
in vitro Micro-injection
Synthèse
protéique Patch-clamp
ADNc ARNm Ovocyte de
Xénope
Pipette de patch
Assemblage des sous-
unités Canal Transcription
in vitro Micro-injection
Synthèse
protéique Patch-clamp
ADNc ARNm Ovocyte de
Xénope
Pipette de patch
Assemblage des sous-
unités Canal
K+
Figure 52 : Etapes de l’expression fonctionnelle dans l’ovocyte de xénope
Les ovocytes sont ensuite incubés individuellement (afin de prévenir toute contamination) sur plaques 96 puits entre 2 et 10 jours à 19°C dans la solution A+B supplémentée en antibiotiques, afin de permettre une bonne expression et un bon adressage protéiques à la membrane plasmique.
126
de solubilisation (50 mM phosphate de sodium, 150 mM NaCl, 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, pH 8, d’après Tucker et al., JBC 1996) supplémenté en inhibiteurs de protéases (1 tablette pour 50 mL, Roche) par 5 passages successifs dans une aiguille de 18 g, puis par 2 passages dans une aiguille de 27 g. Les lysats sont centrifugés 3 fois 10 minutes à 1000 g, puis le surnageant contenant les membranes totales est précipité par ultracentrifugation à 165000 g pendant 30 minutes. Le culot est repris par 15 µ L de solution RIPA (pour 500 mL : 200 mL H2O, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,5 % sodium deoxycholate, 0,1 % SDS, 1%
Triton X-100, pH 8) contenant des inhibiteurs de protéases (pour 5 mL de RIPA : 10 µ L DMSO, 10 µg leupeptine, 10 µg pepstatine, 10 mg iodoacétamide, 50 µ L PMSF).
Les préparations membranaires sont ensuite solubilisées dans un tampon de charge dénaturant à raison d’un volume de protéine pour un volume de tampon (Tris-HCl pH 6.8 125 mM, SDS 4%, 2-βmercaptoéthanol 10 %, glycérol 20 %, bleu de bromophénol 0.02 %). Elles sont alors chargées dans les puits d’un gel de concentration à 5 % de Bis-acrylamide avant de passer dans un gel de migration à 10 % de Bis-acrylamide. Chargées négativement par le SDS, les protéines migrent suivant leur poids moléculaire apparent sous l’influence d’un courant de 50 mA.
L’électrophorèse s’effectue dans un tampon de migration (25 mM Tris, 250 mM glycine, 0,1 % SDS) pendant 1h. Le dépôt en parallèle de protéines standard colorées de poids moléculaires connus permet l’estimation de la taille des protéines déposées.
Les protéines sont ensuite transférées sur membrane de nitrocellulose (Hybond ECL Amersham) à 100 mA sur la nuit en chambre froide.
La membrane est rincée rapidement dans du TBS 1X (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4), puis elle est saturée 1h dans une solution de blocage (TBS 1X, Blocking Reagent 1 %) afin d’éviter les fixations d’anticorps non spécifiques. L’incubation avec l’anticorps primaire (anticorps monoclonal de rat 3F10 anti-HA) à 100 ng/mL pendant 1h30 à température ambiante est suivie d’un rinçage rapide dans du TBS 1X, puis de 2 lavages de 10 et 30 minutes dans du tampon de lavage (TBS 1X, Blocking Reagent 1 %, Tween 0,1 %). La membrane est alors incubée pendant 1h30 à température ambiante avec l’anticorps secondaire (IgG de chèvre anti-rat conjugué à la HRP) dilué au 1/20000ème puis est rincée rapidement par du TBS 1X et lavée 4 fois 10 minutes (les 2 premières fois dans du tampon avec Blocking Reagent, les 2 autres fois dans du tampon sans Blocking Reagent).
La révélation est effectuée avec le kit ECL (Enhanced Chemiluminescence) Amersham :
127
en présence des réactifs ECL, la peroxydase catalyse la libération de lumière qui permet l’impression d’un film d’autoradiographie (Hyperfilm ECL, Amersham).
3.2 Contrôle de l’adressage membranaire
L’adressage à la membrane plasmique de l’ovocyte des constructions mises en œuvre est suivi par microscopie confocale. Les manipulations ont été réalisées sur la plateforme de microscopie confocale du CEA Grenoble avec l’aide de Didier Grunwald et Stéphane Vassilopoulos.
Seize ovocytes par construction sont fixés dans 4 % de Formalin pendant une nuit avant d’être déshydratés 2 à 3 heures dans 15 % de sucrose. Ils sont ensuite incorporés dans un sucre de tissu tek avant d’être découpés au cryomicrotome (coupes de 20 µM). Les coupes sont déposées sur des lames polysines pour pouvoir être ensuite immunomarquées.
Les coupes sont réhydratées 10 minutes dans du TRIS 100 mM, puis elles sont saturées 30 minutes dans une solution de blocage (PBS 1X, BSA 5 %, sérum de chèvre 5 %, triton 0.25
%) afin d’éviter les fixations d’anticorps non spécifiques. L’incubation avec l’anticorps primaire (anticorps monoclonal de souris anti-HA) dilué au 1/1000ème (dans du PBS 1X, BSA 5 %, sérum de chèvre 5 %, triton 0.1 %) pendant une nuit à 4°C est suivie de 3 lavages de 10 minutes dans du PBS 1X. Les coupes sont alors incubées pendant 1h à température ambiante avec l’anticorps secondaire (IgG de chèvre anti-souris conjugué à la CY3) dilué au 1/500ème (dans du PBS 1X, BSA 5 %, sérum de chèvre 5 %, triton 0.1 %) puis sont rincées 12 fois par du PBS 1X. Elles sont ensuite immergées dans un milieu conservateur, le DAPCO, avant d’être recouvertes par une lamelle fixée à l’aide de vernis à ongle. Les coupes sont alors prêtes pour l’observation microscopique.
3.3 Contrôle de la fonctionnalité des protéines
3.3.1 Technique du patch-clamp 3.3.1.a Principe du patch-clamp
Le passage d’ions à travers les membranes biologiques s’effectue au niveau de pores protéiques transmembranaires : les canaux ioniques. Bien que plusieurs états conformationnels soient possibles pour un même canal, on considère en général schématiquement uniquement les états ‘’ouvert’’ et ‘’fermé’’. Ces changements
128
conformationnels se traduisent par l’ouverture ou la fermeture des voies de passage des ions.
Le sens et l’intensité de ces mouvements ioniques dépendent des forces de perméation, liées à la force de diffusion (qui tend vers l’équilibre des concentrations ioniques de part et d’autre de la membrane) et à la force électromotrice dépendant de la valeur du potentiel de membrane.
Ces flux d’ions à travers un canal entraînent l’apparition de courants mesurables expérimentalement.
La technique du patch-clamp permet la mesure et l’étude de ces variations de courant induites par les mouvements ioniques, ainsi que l’étude du mode de régulation des canaux.
Inventée en 1976 par Neher et Sakmann (Neher et Sakmann, 1976; prix Nobel de Médecine et Physiologie en 1992) puis perfectionnée (Hamill et al., 1981), cette technique permet d’enregistrer l’activité de canaux unitaires ou de l’ensemble des canaux d’une cellule selon la configuration utilisée. On applique une micropipette de verre sur une membrane cellulaire, afin d’en isoler un petit morceau (‘’patch’’) pour étudier les canaux qu’il contient. Un potentiel est imposé à la membrane (voltage-clamp), entre le bain et l’intérieur de la pipette ou de la cellule, et on mesure le courant nécessaire pour maintenir ce potentiel à une valeur constante. Les courants mesurés sont de très faibles amplitudes, allant de quelques pico- ampères (pA) pour des courants unitaires à quelques nano-ampères (nA) pour les enregistrements sur cellule entière. Cette technique rend possible l’étude en temps réel de l’activité des canaux ioniques, et en particulier l’étude des variations de cette activité induites par l’application de substances régulatrices.
Les facteurs influant sur le passage des ions à travers les canaux (et donc sur la valeur du courant mesuré) sont:
- Le potentiel d’équilibre de l’ion considéré (Eion), qui dépend de la concentration de part et d’autre de la membrane suivant l’équation de Nernst: E = RT/zF ln([ion]e/[ion]i)
- Le potentiel membranaire (Vm)
- La conductance des canaux (G), qui traduit la facilité avec laquelle les ions franchissent les canaux (g quand on parle de la conductance d’un seul canal)
Le courant est donné par : I = G(Vm-Eion) dérivé de la loi d’Ohm U = RI
avec U = (Vm-Eion), et G = 1/R dans le cas présent.
En patch-clamp, le potentiel de membrane Vm peut être fixé (conditions de voltage clamp),
129
de même que le potentiel d’équilibre de l’ion considéré Eion (qui peut être ramené à une valeur nulle en se plaçant en concentrations équimolaires de part et d’autre de la membrane). La mesure de I nous renseigne donc directement sur la conductance G, propriété spécifique des canaux étudiés.
3.3.1.b Instrumentation mise en œuvre en patch-clamp
Le poste de patch-clamp utilisé au cours des expérimentations présentées ici est composé des éléments suivants :
1
3
10
12 4
11 9 8 7 6
2
5
13
5 1
3 4 2 1
3
10
12 4
11 9 8 7 6
2
5
13
5 1
3 4 2
Figure 53 : Eléments composant le poste de patch-clamp
130
1- Cage de Faraday assurant la protection de l’espace de manipulation vis-à-vis des perturbations électromagnétiques
2- Microscope inversé (Olympus, ULWCD 0.30, oculaires X 4, X 10, X 40)
3- Micromanipulateur électrique 3 axes permettant des déplacements fins de la micropipette dans les trois dimensions
4- Table anti-vibrations permettant d’amortir les vibrations mécaniques, qui doivent être réduites au maximum avant toute mesure
5- Tête de perfusion rotative, reliée aux corps de seringues contenant les solutions à tester 6- Moniteur vidéo, relié au microscope inversé
7- Convertisseur signal analogique/numérique (Digidata 1322) permettant le transfert bidirectionnel de signaux entre le poste de patch et l’ordinateur
8- Oscilloscope analogique-numérique (HM-407, Hameg) permettant de visualiser les courants en temps réel
9- Amplificateur de patch-clamp RK-300 (Bio-Logic) adapté à la mesure de courants de l’ordre du picoampère (pA) et permettant la conversion courant-tension (convertisseur de résistance 10 GΩ, gain de 10 mV/pA et 100 MΩ, gain de 0,1 mV/pA) et l’imposition d’un potentiel au ‘’patch’’ de membrane par l’intermédiaire de la micropipette de patch
10- Ordinateur prenant en charge la gestion de l’appareillage ainsi que la mesure des données expérimentales
11- Enregistreur papier (RS-3200, Gould) permettant de conserver les enregistrements sur papier
12- Contrôleur système de perfusion, RSC-100 (Rapid-Solution-Changer, Bio-Logic) permettant le changement rapide et automatique des solutions à tester (relié à la tête de perfusion rotative) sous le contrôle du logiciel Perf 2.10 développé par Michel Vivaudou.
13- Micropipette de mesure en verre remplie d’une solution électrolytique dans laquelle plonge une électrode d’argent, à l’aide de laquelle est réalisé le ‘’patch’’. La formation d’un
‘’patch’’ consiste à approcher la micropipette de la membrane d’un ovocyte sur boîte de Petri jusqu’à réaliser par aspiration un scellement (seal) étanche entre la pipette et la membrane.
Lorsque le seal est formé, la petite portion de membrane à l’intérieur de la pipette (patch) est isolée mécaniquement et électriquement (résistance de l’ordre du giga-Ohm). L’électrode d’argent plongeant dans la pipette, reliée au dispositif électronique de stimulation et de détection-amplification, permet alors d’imposer un potentiel (voltage clamp) sur la portion de membrane isolée, mais également de mesurer les courants (de l’ordre du pico-Ampère) induits
131
par le passage des ions au travers des canaux présents dans le patch.
Filtr Out Pulse In Analog in 1
Analog in 0 Analog out 0
RK300
Enregistreur papier Digidata 1322
Ordinateur
Oscilloscope RSC100
Figure 54 : Schéma des connexions entre les instruments composant le poste de patch-clamp
L’ensemble du dispositif de stimulation/détection/amplification est sous le contrôle de l’unité centrale (ordinateur) gérée par l’expérimentateur. Les différents appareillages sont interconnectés selon le schéma décrit ci-dessus (Figure 54).
3.3.1.c Configurations de travail en patch-clamp
L’application de la technique du patch-clamp peut se faire selon diverses configurations (Figure 55):
Configuration « cellule attachée » (cell-attached) : la pipette est appliquée sur la surface d’une cellule intacte. Des dépressions exercées dans la pipette par légères succions permettent la formation d’un contact étroit entre la pipette et la membrane cellulaire. On mesure alors le courant traversant les canaux présents dans le morceau de membrane isolé dans la pipette. La configuration du milieu intracellulaire n’est pas perturbée, mais ne peut pas être facilement modifiée. Cette approche est particulièrement utile pour l’étude des canaux ioniques en conditions physiologiques, par exemple lors des processus d’activation via des messagers intracellulaires tels que le calcium.
Configuration « cellule entière » (whole-cell) : à partir de la configuration cell-attached,
132
il est possible, par succion ou application d’un voltage élevé, de détruire le patch tout en conservant le scellement entre la membrane et la pipette. Dans cette configuration, dite whole- cell, la solution de remplissage de la pipette communique directement avec le milieu cytoplasmique, et l’ensemble des canaux présents dans la membrane plasmique cellulaire peut être interrogé (et plus seulement ceux présents dans le patch délimité par la pipette). Cette variante permet donc de mener des expériences de voltage imposé sur la cellule entière, ou encore d’injecter dans la cellule certaines substances (enzymes, nucléotides…) susceptibles de moduler l’activité électrique des canaux ioniques.
Configuration « excisée outside-out » : à partir de la configuration whole-cell, on peut obtenir par traction délicate un morceau isolé de membrane dont la surface externe est exposée à l’extérieur (outside out) et peut donc être soumise à divers composés. Cette variante est employée lorsqu’on souhaite étudier l’impact de variations de l’environnement de la face externe de la membrane sur l’activité des canaux (ligands extracellulaires).
Figure 55 : Les différentes configurations du patch-clamp
La configuration « cell-attached » permet de préserver l’intégrité du cytoplasme. La configuration « whole-cell » permet la mesure de la totalité des courants de la cellule. Les configurations excisées « inside-out » et « outside-out » permettent d’accéder à des sites de régulation respectivement intra- et extracellulaires.
133
Configuration « excisée inside-out » : si on excise le patch membranaire isolé à partir de la configuration cell-attached, il est possible d’isoler ce patch et de faire varier l’environnement de sa face cytoplasmique. Cette configuration, qualifiée d’inside-out, est particulièrement recherchée pour l’étude des canaux ioniques activés par des agents intracellulaires. Notons également qu’il est possible de se rapprocher de la configuration inside-out en partant de la configuration cell-attached et en perméabilisant la cellule à l’aide d’agents ionophores afin d’obtenir la configuration open cell-attached.
3.3.1.d Conditions expérimentales de travail
Préparations des ovocytes
Après 48 à 72 heures d’incubation à 19°C, temps requis pour obtenir une bonne expression protéique à la membrane plasmique, les ovocytes sont débarrassés manuellement de leur membrane vitelline à l’aide de pinces. Cette étape délicate est réalisée sous une loupe binoculaire, en plaçant l’ovocyte dans une solution hyperosmotique (Shrinking solution = solution A + 100 mM NaCl) afin que l’ovocyte se rétracte et se désolidarise du vitellus qui l’entoure. L’opération n’est effectuée qu’au dernier moment précédant les mesures : en effet, dépourvu de sa membrane vitelline, l’ovocyte devient extrêmement fragile et sa durée de vie est très limitée (1 à 2 heures maximum).
50 µM 50 µM
Figure 56 : Observation au microscope optique (x 16) d’un même ovocyte avant (a) et après (b) élimination manuelle de la membrane vitelline (d’après Methfessel et al., 1986)
L’ovocyte est ensuite transféré dans le poste de patch-clamp pour être testé, sur boîte de Petri contenant une solution isotonique.
134 Microélectrodes de mesure et solutions
Les micropipettes utilisées pour le patch-clamp sont usinées à partir de capillaires de borosilicate (Kimax-51, Kimble products). Ceux-ci sont portés à haute température puis étirés sous l’effet d’une tension contrôlée à l’aide d’une étireuse horizontale (P97 Micropipette Puller, Sutter Instrument Co.) afin de produire des pipettes dont l’extrémité atteint un diamètre de l’ordre du micromètre. Les micropipettes ainsi obtenues sont remplies d’une solution isotonique au milieu intracellulaire et fixées sur l’électrode d’argent chloruré permettant les mesures.
Figure 57 : dispositif expérimental et solutions mises en œuvre lors de la mesure de courants potassiques en patch-clamp. Les conditions sont optimisées de manière à n’observer que la contribution des canaux KATP et à avoir un potentiel d’inversion potassique (EK) nul.
La concentration potassique dans la pipette est fixée (150 mM K+) de manière à se placer en conditions équimolaires de part et d’autre du patch membranaire : de cette manière, le potentiel d’inversion du potassium (EK) est pratiquement nul.
L’électrode d’argent chloruré permet la conversion des courants d’ions en solution en courant d’électrons suivant la réaction réversible suivante :
Ag+ Cl-↔ AgCl + e-
De cette manière, les courants ioniques convertis en courants électroniques peuvent être visualisés directement sur ordinateur.
135 Formation d’un patch et mesures de courants
La formation d’un patch membranaire passe par une première étape d’approche délicate de l’ovocyte avec la micropipette. Une légère surpression exercée dans la micropipette permet d’éviter l’entrée de poussières ou débris présents dans le bain. Une fois le contact établi, une légère dépression exercée par une aspiration continue permet d’aspirer une portion de membrane, ou « patch », et de la faire adhérer aux parois de la pipette de manière quasi- covalente jusqu’à avoir un scellement (« seal ») d’une résistance de l’ordre du gigaohm. Le patch de membrane est alors excisé par un retrait rapide de la micropipette et peut dès lors être interrogé librement. Pour ce faire, il est placé devant un système de perfusion relié à des tubes contenant les solutions à tester (Figure 58).
Figure 58 : Dispositif de perfusion mis en œuvre pour le patch-clamp. Les solutions utilisées ne contiennent pas d’autre cation perméant que le potassium (Na+ ou Ca2+ exclus), de manière à n’observer que les courants potassiques. La tête de perfusion rotative permet de présenter successivement différentes solutions à tester devant le patch membranaire.
En l’absence de cations autres que K+, les principaux courants endogènes susceptibles d’être enregistrés sur l’ovocyte seraient ceux de canaux chlores activés par le calcium (ICl(Ca)).
Ces courants sont inhibés par l’ajout d’un chélateur d’ions Ca2+ (EGTA) dans nos solutions.
Les seuls courants enregistrables dans ces conditions expérimentales correspondent donc uniquement aux flux potassiques (IK) de part et d’autre de la membrane.
Le courant IK engendré par le flux de K+ passant à travers les canaux ioniques présents dans le patch est égal à : IK = GK (Vm-EK), transposition de la loi d’Ohm au gradient électrochimique (Vm–EK), avec Vm le potentiel de membrane (imposé à Vm = -50 mV), et EK le potentiel d’inversion pour l’ion K+ (dans les conditions équimolaires en potassium fixées, EK = 0). IK ne dépend donc que de GK, la conductance transmembranaire pour l’ion K+, traduisant la facilité avec laquelle les ions K+ passent à travers la membrane. Or la valeur de
Tête de perfusion
Patch
136 GK est donnée par Gk = P0 N gk où:
P0 - probabilité que les canaux soient dans un état conformationnel ouvert ou fermé N - nombre des canaux présents dans le patch
gk - conductance unitaire de chaque canal (constante d’environ 70 pS pour le canal KATP)
La valeur du courant mesuré nous renseigne donc sur le nombre de canaux présents dans le patch et sur leur activité (leur ouverture/fermeture).
Dans ces conditions expérimentales (Vm = -50 mV, EK = 0), le passage d’ions K+ à travers les canaux se traduit par une déflexion vers le bas (courant « négatif » ou « entrant »). Ainsi, toute activation des canaux KATP par un agent pharmacologique ou des nucléotides entraîne une déflexion vers le bas du signal enregistré (Figure 59).
Amplificateur
Cellule Patch
Pipette
(diamètre 1µm)
temps (ms/s/min) activateur courant (pA)
0
temps (ms/s/min) activateur courant (pA)
0 i
un canal
n canaux
ipip
Amplificateur
Cellule Patch
Pipette
(diamètre 1µm)
temps (ms/s/min) activateur courant (pA)
0
temps (ms/s/min) activateur courant (pA)
0 i
un canal
n canaux
Amplificateur
Cellule Patch
Amplificateur
Cellule Patch
Pipette
(diamètre 1µm)
temps (ms/s/min) activateur courant (pA)
0
Pipette
(diamètre 1µm)
temps (ms/s/min) activateur courant (pA)
0
temps (ms/s/min) activateur courant (pA)
0
i
temps (ms/s/min) activateur courant (pA)
0 i
un canal
n canaux
ipip
Figure 59 : Illustration de la mesure de l’activité des canaux KATP en réponse à l’application de substances activatrices par la technique de patch-clamp en configuration inside-out.