Cas des composés phénoliques

II.2.1. Chromatographie Liquide Haute-Performance

La chromatographie liquide haute-performance (CLHP) est une puissante technique de séparation utilisée pour l’identification, la quantification et/ou la purification (chromatographie semi-préparative ou préparative) des composés dans un mélange. Ce dernier est mis en solution dans la phase mobile (solvants) puis est injecté sous haute pression en tête de la colonne (tube en acier inoxydable contenant la phase stationnaire) [Neue, 1997 ; Dong, 2006 ; Snyder et coll., 2009]. Il existe plusieurs types de phases stationnaires mettant en jeu des mécanismes de rétention variés : chromatographie d'adsorption, -de partage, - d'échange d'ions, -d'exclusion, etc. La chromatographie de partage est la technique la plus couramment utilisée ; la phase stationnaire est typiquement composée de micro particules de silice greffée avec divers motifs organiques. Deux types de chromatographie de partage peuvent être distingués : l’un est dit en phase normale “ normal phase chromatography ”, les molécules greffées sur la silice sont des groupements polaires tels –NH2 ou –CN ; l’autre est dit en phase inverse “ reversed phase chromatography ”, les greffons apolaires sont composés principalement de chaînes hydrocarbonées (-C8H17 ou -C18H37). Dans le premier cas, la phase

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mobile est généralement apolaire et non aqueuse (hexane pur ou en mélange avec une faible proportion de méthanol ou d’acétonitrile) ; les phénomènes d’adsorption croissent avec la polarité des analytes entrainant une augmentation des temps d’élution. Dans le second cas, la phase mobile est polaire et aqueuse ; les temps de rétention diminuent avec la polarité des analytes [Rosset et coll., 1991] et peuvent être ajustés en utilisant un gradient d’élution combinant l’eau et un solvant organique (notamment le méthanol et l’acétonitrile) comme phase mobile. Cette dernière méthode s’est considérablement développée depuis les années 70 au détriment de la phase normale du fait d’une meilleure reproductibilité des temps de rétention. Ceux-ci, spécifiques de chaque constituant, sont fortement dépendants de la nature de la phase stationnaire, de la composition de la phase mobile et des conditions opératoires (débit, pression et température). A l’instar de la CPG, les molécules sont identifiées en sortie de colonne grâce à un détecteur spectrophotométrique ou spectrométrique ; il enregistre un signal qui est ensuite transformé par l’ordinateur en un chromatogramme [Rosset et coll., 1991].

L’association de la station de CLHP avec un détecteur à barrettes diode (Diode Array Detector, DAD) permet une analyse qualitative d’un mélange par l’enregistrement des spectres UV des constituants individualisés, d’une part et permet une analyse quantitative sur la base de l’aire de chaque pic chromatographique rapportée sur une courbe d’étalonnage externe, d’autre part.

La polyvalence de la CLHP en termes de cibles d’étude (pesticides, polluants, sucres, acides aminés, composés thermosensibles, etc.) est à l’origine de l’essor de cette technique dans divers secteurs d’activités. Ses multiples atouts (rapidité d’analyse, sensibilité, résolution) en font aujourd’hui la méthode de référence pour l’analyse chimique des produits agroalimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques.

De nombreux articles [Merken et Beecher, 2000 ; Huck et coll., 2001 ; de Souza et coll., 2002 ; Calabro et coll., 2004 ; Caristi et coll., 2006 ; de Lourdes Mata Bilbao et coll., 2006 ; Hoffmann-Ribani et coll., 2009] et revues [Molnar-Perl et Füzfai, 2005 ; de Rijke et coll., 2006 ; Valls et coll., 2009] décrivent les protocoles expérimentaux (type de colonne, solvant, gradient) pouvant être envisagés pour la séparation par CLHP des composés phénoliques présents dans les fruits [Shui et Leong, 2002 ; Belajovà et Suhaj, 2004;]. A titre d’exemple, Agócs et coll. [2007] ont comparé les résultats obtenus en phase inverse avec

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deux types de colonnes (C18 et C30) sur la composition en caroténoïdes du zeste et de la pulpe de plusieurs espèces d’agrumes : orange (Citrus sinensis), mandarine (C. reticulata), clémentine (C. clementina), kumquat (Fortunella), pamplemousse (C. maxima) et citron (C.

limon). En phase normale avec une colonne chirale, Caccamese et Chillemi [2010] ont mesuré l’abondance de deux énantiomères de la naringine dans l’albédo des pomélos (C. grandis).

II.2.2. Chromatographie Liquide à Haute Performance / Spectrométrie de Masse

Les premiers couplages CLHP/SM ont été mis en œuvre en 1973 par Shulten et Beckey [1973] en utilisant un spectromètre de masse par désorption de champ dont les multiples inconvénients – notamment ceux liés à la préparation de l’échantillon – en ont restreint l’utilisation. L’une des avancées majeures a été le développement de l’ionisation chimique directe [Hunt et coll., 1977] ; avec cette technique, l’échantillon déposé sur un émetteur chauffé est placé directement dans le gaz réactant. Les ions générés sont désorbés et accélérés jusqu’au spectromètre de masse.

Au début des années 1980, deux nouvelles techniques ont été introduites : le bombardement rapide d’atomes (ou Fast Atom Bombardment FAB) [Barber et coll., 1981a, 1981b] et l’émission secondaire induite par des ions (Liquid Secondary Ionisation LSI) [Aberth et Burlingame, 1984]. Une extension de ces méthodes a été développée par l’intermédiaire du bombardement rapide d’atomes en flux continu (Continuous Flow - Fast Atom Bombardment CF-FAB) [Ito et coll., 1985, 1986 ; Caprioli et coll., 1986 ; Caprioli 1990]. Dans ces trois types d’ionisation, l’échantillon dissous dans un solvant à haut point d’ébullition est bombardé par des ions césium à des énergies de 8 à 30 keV (LSI) ou par des atomes d’argon ou de xénon à haute énergie (FAB et CF-FAB).

En parallèle à ces développements, d’autres techniques d’ionisation ont été introduites ; les plus remarquables sont le ThermoSPray (TSP) [Blakley et Vestal, 1983]

d’une part, et les méthodes d’ionisation à pression atmosphérique, d’autre part. Parmi celles- ci, il faut distinguer l’électrospray (ElectroSpray Ionisation ESI) [Whitehouse et coll., 1985 ; Fenn et coll., 1989] et l’ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation APCI) [Horning et coll., 1974].

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La méthode ESI est mise en œuvre à pression atmosphérique et à température ambiante (figure 9). L’échantillon en solution est introduit dans la source du spectromètre de masse au moyen d’un pousse-seringue ou d’une CLHP. L’analyte traverse une aiguille métallique portée à un potentiel de plusieurs kilovolts (typiquement 3 à 5 kV). Il en résulte la formation de gouttelettes mono- ou poly-chargées, qui conduisent, par désolvatation, à des ions en phase gazeuse qui sont ensuite transmis dans le quadripôle.

Figure 9 : Principe de fonctionnement d’une source électrospray (ESI)

L’APCI est réalisée à pression atmosphérique dans une fourchette de température allant de 300 à 500°C (figure 10). L’échantillon est introduit dans la source à l’aide d’un capillaire dont l’extrémité débouche dans un vaporisateur. L’échantillon est alors évaporé et mis en mélange avec le gaz nébuliseur qui va le transporter jusqu’à une aiguille corona. Une tension est appliquée à cette aiguille (généralement entre ±3000 et ±5000V) provoquant une décharge de quelques µA qui ionise l’air ambiant et crée un plasma autour de la pointe de l’aiguille. Les molécules contenues dans l’échantillon réagissent alors avec les ions radicalaires du plasma, ce qui conduit à leur ionisation.

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Figure 10 : Principe de fonctionnement de l’Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique

Ces deux modes d’ionisation sont actuellement les plus utilisés en raison de la diversité des métabolites pouvant être détectés. Ces techniques douces génèrent des ions avec un faible excès d’énergie interne. Par rapport aux autres méthodes, l’information sur la masse moléculaire des constituants est donc préservée. De plus, elles permettent la détection d’ions positifs et négatifs ainsi que l’utilisation de la spectrométrie de masse en tandem (SM/SM).

Cette dernière permet souvent d’obtenir des informations structurales grâce aux dissociations induites par collision (Collision-Induced Dissociation CID) d’ions préalablement sélectionnés dans le spectromètre. Cette stratégie est souvent mise en œuvre pour l’analyse des composés phénoliques ; les chemins de fragmentation des métabolites secondaires étant généralement analogues à ceux des différentes techniques d’ionisation. Cependant, les intensités relatives des ions peuvent être fortement affectées selon l’appareillage utilisée [de Rijke et coll., 2003 ; March et coll., 2007].

Carini et coll., [2001] ont eu recours au couplage CLHP/SM en mode ionisation chimique positive et négative pour la détermination des polyphénols dans des extraits d’Helichrysum stoechas. Par ailleurs, Baldi et coll. [1995] ont utilisé le couplage de CLHP/DAD (détecteur à barrette d’iode) et le couplage CLHP/SM (TSP) pour la caractérisation de composés phénoliques présents dans les zestes de citron (Citrus limon) ; l’association des spectres UV-visible et des spectres de masse a ainsi permis l’identification de coumarines, de flavones –O et –C glycosylées, de flavonols et de flavanones. De manière analogue, Ruberto et coll. [2007] ont identifié et quantifié les composés phénoliques (17 anthocyanes et 11 flavonols) présents dans les baies de raisin (Vitis vinifera) de différentes

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variétés (Nero d’Avola, Nerello Mascalese, Nerello Cappuccio, Frappato et Carbernet Sauvignon) cultivées en Sicile. En outre, Pikulski et Brodbelt [2003] ont déterminé la position du sucre sur l’aglycone en étudiant les spectres de masse ESI de flavonoïdes glycosylés.

Enfin, Waridel et coll. [2001] ont différencié des flavones 6-C et 8-C glycosylées (vitexine, isovitexine, orientine et isoorientine) en ionisation positive et négative.