Chapitre II. Résultats et discussion
II.1. Étude des colorants de Rhamnus
II.1.3. Analyse des extraits de Rhamnus
II.1.3.1. Comparaison chimique de trois espèces de Rhamnus
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Tableau 2.8. Données chromatographiques des anthraquinones présents dans les Rhamnus.
n° tR (min) UV !max (nm) [M+H]
+/
[M-H]- (m/z)
ions fragments en
mode positif (m/z) identification
I 29,7 224, 264, 434 417/415 271, 229 franguline A
II 30,6 224, 264, 436 403/401 271, 229 franguline B
III 32,4 194, 225, 257, 287, 429 271/269 229 aloe-émodine IV 35,6 191, 224, 263, 434 445/443 271, 175 6-O-(2'-acétyl)-
arabinofuranoside d’émodine
V 41,2 224, 264, 437 459/457 271, 189 6-O-(3'-acétyl)-
rhamnopyranoside d’émodine
VI 50,8 224, 262, 436 487/485 - 6-O-(3',4'-diacétyl)-
arabinopyranoside d’émodine VII 59,2 191, 224, 263, 430 501/499 - 6-O-(2',3'-diacétyl)-
rhamnopyranoside d’émodine
VIII 61,0 222, 289, 441 271/269 229 émodine
IX 62,6 197, 225, 257, 288, 429 255/253 - chrysophanol
X 66,8 224, 262, 432 529/527 - 6-O-(2',3',4'-triacétyl)-
arabinopyranoside d’émodine
XI 71,9 223, 267, 287, 436 -/- - pariétine
Figure 2.25. Chromatogrammes CLHP/UV-Visible, à 350 nm, des fruits immatures de Rh.
saxatilis (a), Rh. catharticus (b) et Rh. alaternus (c).
Les extraits présentent principalement des composés glycosylés et des traces d’aglycones, comme le kaempférol (16) et la rhamnocitrine (19). L’espèce Rh. saxatilis (Figure 2.25a) peut être chimiquement caractérisée par la présence de dérivés 3-O-acétyl- rhamninoside comme les composés 5, 11 et 13. A l’opposé de cette espèce, les extraits obtenus à partir de Rh. catharticus (Figure 2.25b) et Rh. alaternus (Figure 2.25c) ne contiennent pas, du moins en quantité détectable, ces composés caractéristiques.
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a
16
c
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Les espèces Rh. catharticus et Rh. alaternus contiennent des flavonols O-rhamninoside liés en position 3 et en position 4' comme le 4'-O-rhamninoside de quercétine (4), le 4'-O- rhamninoside de kaempférol (6) le 4'-O-rhamninoside de rhamnétine (10) (à l’état de traces) et le 4'-O-rhamninoside de rhamnocitrine (12). La composition chimique en flavonol ne permet pas de distinguer les espèces Rh. catharticus et Rh. alaternus. De plus, on peut ajouter que le 3-O-rhamninoside d’isorhamnétine (3) n’est présent que dans l’espèce Rh. saxatilis.
Après la comparaison qualitative des trois espèces, des fruits immatures de Rhamnus de provenances diverses ont été analysés et le pourcentage relatif de chaque composé est présenté dans le tableau 2.9. Les espèces Rh. saxatilis et Rh. alaternus ont été récoltées à Caumont-sur-Durance et au Mont Ventoux, alors que les échantillons certifiés de Rh.
catharticus proviennent de Pologne, de Hongrie et d’Allemagne. Le pourcentage relatif des composés identifiés dans les échantillons ne varie que très légèrement pour chaque espèce. On peut noter une différence entre les échantillons de Rh. saxatilis (Caumont et Mont Ventoux) pour le 3-O-rhamninoside de kaempférol (2), le 3-O-rhamninoside de rhamnétine (7) et le 3- O-rhamninoside de rhamnocitrine (8), sûrement dû à leur provenance. Enfin, la quercétine (14) a été identifiée dans l’échantillon de Rh. alaternus du Mont Ventoux et non dans celui de Caumont. Ceci peut être dû à une différence de maturité des deux échantillons et/ou aux conditions du milieu (sol, climat...).
Tableau 2.9. Composition et pourcentage relatif en flavonols pour les différents Rhamnus.
a Composé à l’état de traces
b Composé non identifié
Composés Rh. saxatilis (%) Rh. catharticus (%) Rh. alaternus (%)
Caumont Mt Ventoux Pologne Hongrie Allemagne Caumont Mt Ventoux
3-O-rhamninoside de quercétine (1) 12,14 3,75 1,98 0,71 4,31 0,24 1,62
3-O-rhamninoside de kaempférol (2) 6,12 34,24 62,70 51,41 62,46 73,94 74,16
3-O-rhamninoside d’isorhamnétine (3) 1,25 0,57 - - - - -
4'-O-rhamninoside de quercétine (4) -b - tr.a tr. tr. tr. 0,14
3-O-acétyl-rhamninoside de kaempférol (5) 5,41 5,94 - - - - -
4'-O-rhamninoside de kaempférol (6) - - 5,35 1,65 1,33 1,08 1,91
3-O-rhamninoside de rhamnétine (7) 56,81 13,76 1,91 7,84 4,91 0,35 1,43
3-O-rhamninoside de rhamnocitrine (8) 1,85 24,06 19,48 28,45 12,80 20,10 12,80
3-O-rhamninoside de rhamnazine (9) 10,74 12,16 tr. 0,40 0,37 0,65 1,89
4'-O-rhamninoside de rhamnétine (10) - - tr. - 0,01 0,01 -
3-O-acétyl-rhamninoside de rhamnocitrine (11) 0,85 2,68 - - - - -
4'-O-rhamninoside de rhamnocitrine (12) - - 1,80 0,85 0,11 0,29 0,69
3-O-acétyl-rhamninoside de rhamnazine (13) 3,98 1,13 - - - - -
quercétine (14) - - - - - - 0,80
kaempférol (16) 0,33 1,09 5,44 6,27 6,87 1,28 3,89
rhamnocitrine (19) 0,08 0,42 0,93 2,15 0,65 0,24 0,33
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Puisque l’étude de la partie hétérosidique ne permet pas de différencier Rh. catharticus de Rh. alaternus, nous nous sommes intéressés à la fraction aglycone de ces baies immatures.
En effet, chaque molécule aglycone est présente sous différentes formes hétérosidiques en fonction de la position du sucre et/ou de la nature de celui-ci. De plus, chacune des espèces étudiées possède un degré de maturité différent. Aussi, étudier la population aglycone revient donc peut être à simplifier cette étude.
Les trois espèces botaniques de Rhamnus ont été traitées par une solution d’acide trifluoroacétique portée à ébullition durant 1h afin de provoquer l’hydrolyse totale des précurseurs. Cette expérience a donc pour but de rompre la liaison chimique entre l’aglycone et la partie sucre afin de libérer les aglycones présents dans les extraits et d’identifier leur structure.
L’étude chromatographique des différents extraits de Rhamnus montre les principaux flavonols aglycones (Figure 2.26). Chacun d’entre eux a été clairement identifié en comparaison avec les standards commerciaux, par son temps de rétention, son spectre UV/Visible, son pic moléculaire en mode positif et négatif [M+H]+/[M-H]- , et enfin par les ions fragments en mode positifs.
Figure 2.26. Agrandissement des chromatogrammes CLHP/UV-Visible à 350 nm des fruits immatures de Rhamnus hydrolysés : R. saxatilis (a), R. catharticus (b) et R. alaternus (c).
Après hydrolyse, tous les composés glycosylés sont transformés en leur aglycone respectif. Donc, dans ces conditions expérimentales, aucun précurseur glycosylé n’est détecté par CLHP/UV-Visible. Les trois espèces contiennent les mêmes molécules aglycones (Figure 2.26) excepté pour Rh. alaternus et Rh. catharticus où on peut noter l’absence de
a
14
15
16 17
18 19
c
14
16
17 18
19 14
16
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b
18
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l’isorhamnétine (15). Sur le chromatogramme obtenu à 350 nm, le rapport d’aire de pic entre le kaempferol (16) et la rhamnétine (17) dans l’extrait de Rh. saxatilis est d’environ 1/1, alors qu’il est pratiquement de 30/1 dans les extraits de Rh. alaternus et Rh. catharticus. Si on admet que les composés ont un coefficient d’absorption molaire (!) voisin à 350 nm, on peut conclure que dans Rh. saxatilis, le kaempferol (16) et la rhamnétine (17) sont présents en proportions très voisines. Les espèces Rh. catharticus et Rh. alaternus présentent des chromatogrammes très proches. Malgré la diminution de la population en flavonol par hydrolyse des précurseurs glycosylés, la distinction entre Rh. catharticus et Rh. alaternus ne peut pas être faite.
Cette étude nous a donc permis de clairement identifier la structure chimique des principaux flavonols glycosylés et aglycones extraits à partir des fruits immatures de trois espèces du genre Rhamnus, par CLHP/UV-Visible/SM. Pour conclure, il est donc possible de distinguer par des composés caractéristiques l’espèce Rh. saxatilis des deux autres (Rh.
alaternus et Rh. catharticus) qui, d’après la littérature, était la plus employée pour la fabrication du jaune d’Avignon.
II.1.3.1.1. Étude de la partie anthraquinonique
Les fruits matures des trois espèces du genre Rhamnus présentes dans notre région ont été analysés par SPE/CLHP/UV-Visible (Figure 2.27). Ces espèces étaient anciennement employées à l’état mature dans le procédé de fabrication d’un colorant vert appelé vert de vessie. La partie anthraquinonique de ces espèces a été comparée.
Figure 2.27. Agrandissement des chromatogrammes à 450 nm des anthraquinones de Rh. saxatilis (a), Rh. catharticus (b) et Rh. alaternus (c).
Les chromatogrammes obtenus pour les espèces Rh. saxatilis (Figure 2.27a) et Rh.
catharticus (Figure 2.27b) montrent la présence de franguline A (I), de franguline B (II), d’aloe-émodine (III), du 6-O-(2'-acétyl)-arabinofuranoside d’émodine (IV), du 6-O-(3'- acétyl)-rhamnopyranoside d’émodine (V), du 6-O-(2',3'-diacétyl)-rhamnopyranoside d’émodine (VII) et de l’émodine (VIII). Dans l’espèce Rh. alaternus (Figure 2.27c),
IV
!!I II III V
VII VIII a
b
!!I !!II III
IV
!!!V
VII VIII
!!I !II !!!III !!!!IV !V
!VI
!VII VIII
!!X
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viennent s’ajouter aux molécules précédentes deux autres composés : le 6-O-(3',4'-diacétyl)- arabinopyranoside d’émodine (VI) et le 6-O-(2',3',4'-triacétyl)-arabinopyranoside-émodine (X) qui constituent donc des biomarqueurs spécifiques de Rh. alaternus. En revanche, Rh.
saxatilis et Rh. catharticus ne peuvent être différenciés par la composition chimique de leur partie anthraquinonique.
On peut noter que l’analyse SPE/CLHP/UV-Visible des composés aglycones, obtenus par hydrolyse acide des extraits de Rhamnus, n’a pas été détaillée car elle ne permet pas de distinguer chaque espèce. En effet, les chromatogrammes indiquaient la seule présence d’émodine car les composés glycosylés majoritaires présents dans les extraits avant hydrolyse sont tous des dérivés de ce dernier.
II.1.3.2. Comparaison chimique de divers Rhamnus matures