Cependant cette liaison pouvait être mesurée en conditions stoechiométriques, ce qui n’est pas le cas ici. Il ne faut pas oublier que dans les expériences d’empreinte à la DNaseI (liaison à l’ADN en conditions stoechiométriques), le tampon de complexation comprenait toujours du K+ qui pourrait éventuellement être lié par EcNikR (Bloom & Zamble, 2004; Chivers &
Sauer, 2000). Il est également possible qu’EcNikR se lie à pnikA-Fl entre 0 et 1 équivalent de Ni(II) ajouté mais que nous ne puissions pas mesurer cette liaison (bruit de fond). Les variations d’anisotropie sont très faibles. Ces conditions expérimentales ne sont pas optimales pour étudier la liaison d’EcNikR à l’ADN.
Ces sites métalliques présentent une affinité pour le Ni(II) proche de celle du site dit de haute affinité sinon les deux phénomènes ne se succéderaient pas aussi rapidement dans une titration métallique. Les deux phénomènes que sont la métallation et l’agrégation peuvent être dissociés en assurant une protonation des ligands de liaison (Fauquant et al., 2006). Cette protonation diminue l’affinité de ces sites métalliques pour le Ni(II). Le pKa d’agrégation serait proche de 5.4, il possible que les résidus protonés qui sont impliqués dans l’agrégation soient des histidines (pKa : 6) qui sont au nombre de 48 par tétramère. Il a été proposé que le cluster d’histidines (H77, 78, 79, 92) présent à l’embouchure du site de haute affinité soit non seulement le site de métallation transitoire facilitant l’incorporation du nickel dans le site HA mais aussi celui dont la métallation induirait l’agrégation de la protéine. L’étude du mutant 3HA, auquel 3 résidus du cluster ont été mutés (H77 à 79), a révélé que la structuration au niveau secondaire de la protéine était différente de la protéine sauvage. L’environnement terminal de l’hélice α3 serait affecté par la mutation. Malgré cette différence, le mutant a conservé ses propriétés de métallation (liaison de 1 équivalent Ni(II) par sous unité, puis agrégation au-delà). La précipitation que nous supposions dépendante de ce cluster ne l’est pas ou du moins pas uniquement (Fauquant et al., 2006). Il serait intéressant de connaître la capacité de métallation de ce mutant, le nombre de sites affectés par cette mutation, la cinétique de métallation du site de haute affinité ainsi que les propriétés de liaison à l’ADN du mutant.
L’agrégation observée est un phénomène réversible « rapidement » en présence de chélateur comme l’EDTA. Les sites impliqués sont donc plutôt accessibles et exposés au solvant. La cinétique de chélation du Ni(II) contenu dans les sites HA par de l’EDTA est lente mais peut être accélérée en présence de CN- (RD-IMS observations). Ce comportement sous-entend que la plus ou moins grande rapidité de chélation du Ni(II) ne dépend pas seulement de l’affinité de l’agent chélateur pour le métal mais aussi de son accessibilité au métal. Le Ni(II) du site HA est plutôt enfoui dans la protéine. Par ailleurs les changements conformationnels du domaine de tétramérisation (structuration de l’hélice α3, déplacement de la boucle entre β3 et β4) induit par la métallation de ce site par le Ni(II) tend à « bloquer » ce domaine. Mesurer la quantité de Ni(II) liée par EcNikR directement n’équivaut pas à la mesure de la quantité de Ni(II) liée par cette protéine en présence d’agent chélateur.
concernant l’affinité du site HA d’EcNikR pour le Ni(II) où le Kd décrit est de l’ordre du picomolaire (Chivers & Sauer, 2002; Wang et al., 2004). Il s’avère que ce dernier serait de l’ordre de la centaine de nanomolaires (KD moyen de 82 ± 24 nM par la technique de liaison sur filtre, 379nM par titration en UV-Vis à l’équilibre et 363nM par cinétique rapide) (Diederix et al., soumis à publication). Récemment des données similaires ont été proposées par le groupe de S. Ciurli pour HpNikR (Zambelli et al., 2007) à laquelle une affinité de l’ordre du picomolaire pour le site HA avait été attribuée par le groupe de D. Zamble (Abraham et al., 2006). Une technique directe a de nouveau été employée, il s’agit de mesures de calorimétrie (ITC). Les quatre sites de haute affinité d’HpNikR ne seraient pas tous équivalents mais égaux 2 à 2. Les deux premiers sites auraient un KdNi(II) proche de 10nM et les deux autres auraient un KdNi(II) proche de 100nM. L’affinité serait fonction du pH. Des sites de plus basse affinité ont également été décrits pour HpNikR en utilisant l’ITC. Nous sommes en contact avec le groupe de S. Ciurli pour tenter des mesures d’ITC sur EcNikR tout en sachant que les propriétés d’agrégation d’EcNikR risquent d’en limiter la faisabilité.
Le fait qu’EcNikR présente une constante de dissociation pour le Ni(II) de l’ordre de la centaine de nanomolaires semble plus cohérent avec des aspects physiologiques. Cette dernière est le métallorégulateur du Ni(II) chez E.coli et les principales protéines qui lient du Ni(II) chez les bactéries présentent une constante de dissociation pour le métal de l’ordre du µM (HypA (Atanassova & Zamble, 2005), HypB (Olson et al., 1997), UreE (Stola et al., 2006), SrnQ (Kim et al., 2003), Hpn (Ge et al., 2006), SlyD (Hottenrott et al., 1997)…). Si EcNikR présentait un Kd de l’ordre du pM, elle assurerait en permanence une répression de la transcription et les protéines liant du Ni(II) pour leur activité ne pourrait plus assurer leur fonction. Il semble donc plus probable qu’EcNikR ait une sensibilité pour le Ni(II) qui soit du même ordre de grandeur.
II.7.2. Fonction des sites secondaires
La présence de sites de basse affinité avait été suggérée pour expliquer le modèle de liaison à l’ADN en deux temps (KdNi2 : 30nM-30µM) (Bloom & Zamble, 2004; Chivers & Sauer, 2000; Chivers & Sauer, 2002). Bloom et al. avaient d’ailleurs avancé que les deux clusters H77-78-79-92’ et H123-125-C128’ pouvaient être des ligands potentiels du Ni(II).
D’après ce modèle, la liaison du Ni(II) dans le site de haute affinité d’EcNikR permettait la liaison de la protéine à l’ADN avec une affinité moyenne. La métallation de sites annexes présentant une affinité de l’ordre du micromolaire pour le métal permettait une liaison de la protéine à l’ADN avec une haute affinité.
Figure II.16 Modèle de liaison à l’ADN par EcNikR (Bloom & Zamble, 2004; Chivers & Sauer, 2002), z Ni(II) du site dit de haute affinité, z Ni(II) des sites secondaires.
Ce modèle était fonction, entre autres, des propriétés de métallation de la protéine. En effet en considérant un KdNi1 de 7pM pour le site HA, il était supposé que la protéine était 100%
métallée et activable dans les conditions expérimentales testées. Seulement en considérant que le KdNi1 n’est pas de 7 pM mais plutôt de l’ordre de 100nM, il est fort probable qu’une partie de la protéine utilisée, dans les expériences de liaison à l’ADN en conditions stoechiométriques, n’était pas active. La constante de dissociation ou KdADN1 est sans doute légèrement surestimée. L’excès de Ni(II) nécessaire en EMSA permettrait alors de saturer les sites de haute affinité. Une détermination d’un KdADN1 plus juste serait alors envisageable (proche du KdADN2), l’implication de deux sites métalliques ne serait pas nécessaire. Mais cette hypothèse ne tient pas compte de la capacité de liaison métallique et du caractère agrégatif de la protéine.
La présence de sites métalliques secondaires à Ni(II) a été confirmée par notre étude (Fauquant et al., 2006) et lors de la résolution de la structure du complexe EcNikR-Ni-ADN où les cristaux avaient été trempés dans une solution à 5mM de Ni(II). Six autres sites métalliques en plus du site de haute affinité (noté 0 sur la Figure II.17) et d’un site à K+ ont été observés (Schreiter et al., 2006).
Figure II.17 Structure tridimensionnelle du complexe EcNikR-Ni-ADN sur laquelle a été superposée l’emplacement des Ni(II) (×) liés à la protéine après que le complexe ait été trempé dans 5mM de Ni(II). 15 Ni(II) supplémentaires ont été visualisés sur le complexe en plus des 4 sites de hautes affinités et des 2 sites à K+ (Schreiter et al., 2006).
Ces sites secondaires à Ni(II) de basse affinité ne semblent pas directement impliqués dans la liaison à l’ADN (Schreiter et al., 2006). La structure du complexe EcNikR-Ni-ADN trempé dans du Ni(II) ne diffère pas de la structure avant trempage des cristaux. Il a été suggéré que l’effet de ces nickels supplémentaires ne serait pas structural mais plutôt électrostatique. Ils permettraient d’augmenter l’affinité d’EcNikR pour l’ADN en augmentant la charge positive de la protéine (Schreiter et al., 2006).
Cette hypothèse de « répulsion-attraction » permettrait d’expliquer pourquoi EcNikR WT et Q2E ne présentent pas le même comportement face à l’ADN. Ces deux protéines présentent les mêmes propriétés de métallation et d’agrégation en absence d’ADN. La liaison du Ni(II) augmente alors tout autant la charge positive d’EcNikR WT que d’EcNikR Q2E. Pourtant EcNikR WT présente un comportement de liaison à l’ADN plus aspécifique que le mutant Q2E. EcNikR WT agrégée se lierait plus à l’ADN. Le mutant Q2E présente deux charges négatives (E2) supplémentaires dans son domaine de liaison à l’ADN. Une répulsion entre le domaine de liaison à l’ADN d’EcNikR Q2E et les groupements phosphates pourrait avoir lieu et déstabiliser les liaisons hydrogènes opérées par les résidus R3 et T5 avec l’ADN.
Un site métallique liant du K+ dans la structure a été identifié. Les résidus Glu30 et Asp34 (résidus conservés parmi les membres de la famille NikR) de ce site seraient indispensables pour observer un complexe ADN/Protéine en EMSA.
Un site équivalent chez PhNikR a été décrit, à la différence près que ce site liait du Ni(II) (Chivers & Tahirov, 2005).
Récemment, Leitch et al. ont proposé que le second site métallé par du Ni(II) observé au cours de leur travaux soit un site proche du site à K+ décrit dans la structure du complexe ADN/Protéine. Cependant il n’y a aucune preuve de la localisation de ce site. Il ne faut pas oublier qu’EcNikR peut lier jusqu’à 8 Ni(II) par sous unité. Ce site présenterait une géométrie octaédrique et impliquerait 2 résidus imidazoles ainsi que 4 ligands N/O (Leitch et al., 2007).
Il ne serait (bien) formé qu’en présence d’ADN et présenterait une stoechiométrie de 2 Ni(II) par tétramère. Cette stoechiométrie est directement liée à la quantité de métal ajoutée lors de cette étude. Dans cette condition (présence d’ADN), la protéine serait moins sujette à la précipitation. Cet aspect n’est pas évident si l’on considère les résultats obtenus en EMSA et en anisotropie dans notre étude.
Nous pensons que les sites de basse affinité à Ni(II) sont directement responsables de l’agrégation de la protéine. Ce comportement perturberait l’étude de la liaison à l’ADN en provoquant une liaison aspécifique de la protéine agrégée à l’ADN (mesure en gel retard – anisotropie). Les équilibres de liaison à l’ADN seraient perturbés en présence d’excès de Ni(II).
II.7.3. Mécanisme d’action d’EcNikR
Au regard des données de la littérature et des données obtenues, un mécanisme d’action d’EcNikR peut être proposé (Figure II.18).
EcNikR apo ne peut pas se lier sur sa séquence opératrice pnikA.
La métallation de ses sites de haute affinité (HA) couplée à la métallation d’un site à K+ ou éventuellement à Ni(II) lui permettrait de se lier à l’ADN. Les sites de haute affinité ne présenteraient pas une constante de dissociation de l’ordre du picomolaire mais plutôt de l’ordre du submicromolaire. Dans ces conditions de métallation, EcNikR se lierait à l’ADN avec un Kd inférieur ou égal au nanomolaire.
L’addition de Ni(II) supplémentaire à la protéine métallée induit une agrégation massive de cette dernière qui est corrélée à la métallation des sites de basse affinité. Ces sites qui sont au nombre de 7 par monomère, présentent une affinité de l’ordre du micromolaire (2,2µM). La réalité physiologique d’une forme agrégée d’EcNikR est sujette à discussion puisqu’il n’a jamais été mis en évidence un tel état de la protéine in vivo. EcNikR pourrait toutefois avoir une seconde fonction autre que la répression transcriptionnelle et qui serait le stockage du Ni(II). En effet E. coli n’a pas de protéine de stockage définie à la différence de micro-organismes tels que Bradyrhizobium japonicum avec HypB ou encore Helicobacter pylori avec Hpn. Cette dernière, d’ailleurs présentent des caractéristiques communes à
l’agrégation de la citrate synthase dénaturée (Leach et al., 2007)), tend à faciliter l’accumulation du Ni(II) chez E. coli (Zhang et al., 2005). SlyD est en mesure de lier différents métaux dont 3 Ni(II) avec une affinité de l’ordre du micromolaire (Hottenrott et al., 1997). Elle présente un domaine C-ter comprenant un stretch histidine (15H) proche de celui retrouvé chez HypB de B. japonicum et R. leguminosarum. Cette protéine serait également impliquée dans la maturation des hydrogénases (dont HycE la 3ième hydrogénase) en interagissant avec HypB et en facilitant le relargage du Ni(II) contenu dans le site de haute affinité de HypB (Leach et al., 2007; Zhang et al., 2005). Il a été proposé qu’un ou plusieurs facteurs de la maturation de HycE (inductible par le formate) perturbent l’activité de NikR (Rowe et al., 2005). L’un de ces facteurs pourrait être SlyD bien que son activation par le formate n’ait pas été rapportée. Elle pourrait empêcher l’agrégation de la protéine in vivo en liant le trop plein de métal. Elle pourrait également entrer en compétition avec EcNikR et faciliter le relargage du Ni(II) de son site de haute affinité comme elle le fait pour HypB. Cela impliquerait une interaction entre SlyD et NikR. Aucune relation entre ces deux protéines n’a jusqu’à alors été mise en évidence mais il serait intéressant de l’étudier.
Figure II.18 Mécanisme d’activation et d’action d’EcNikR. Le cadre délimite un aspect du mécanisme qui pourrait ne pas avoir de réalité physiologique.
L’addition de Ni(II) supplémentaires au complexe EcNikR-Ni-ADN, ne modifie pas la structure de ce dernier. L’effet des nickels serait de nature électrostatique et non pas structural. Le Kd d’EcNikR-Ni à l’ADN serait diminué en présence d’un large excès de Ni(II) en raison de l’activation totale de la protéine et/ou en raison de l’effet attractif imposé par le métal (caractère stabilisateur du complexe).
La réalité physiologique des deux niveaux de régulation proposés pour l’interaction avec l’ADN est à remettre en question. En effet, aucun métallorégulateur n’a jusqu’à présent été présenté comme ayant deux niveaux de « verrouillages » du contrôle de la transcription. Son homologue chez H. pylori partage de nombreuses propriétés de métallation et de liaison à l’ADN (Abraham et al., 2006; Fauquant et al., 2006). Cependant elle ne présente pas deux niveaux de régulation alors qu’elle nécessite, elle aussi, un excès de cations pour que son complexe HpNikR-Ni-ADN soit visualisé en EMSA (Abraham et al., 2006). D’autre part HpNikR présente aussi un KdNi d’une centaine de nanomolaires pour le site HA (Zambelli et al., 2007) mais par contre ne présente pas un caractère agrégatif aussi prononcé qu’EcNikR (Fauquant et al., 2006). Son Kd pour l’ADN en présence d’un excès de métal n’est que faiblement amélioré de ~ 50 nM à 3-4 nM (Abraham et al., 2006; Benanti & Chivers, 2007).
Il pourrait en être de même pour EcNikR si cette dernière ne liait pas autant de métal et n’agrégeait pas in vitro.
Il a jusqu’à présent toujours été considéré que la liaison du Ni(II) au site de haute affinité d’EcNikR s’effectuait simplement sans qu’aucun partenaire extérieur autre que l’ion Ni(II) ne soit associé. Toutefois, un modèle aussi simple ne reflète pas la complexité cellulaire. En 2005, le groupe de J. Fontecilla-Camps a proposé que la protéine périplasmique du Ni(II) chez E.coli, NikA, ne liait pas directement le métal mais plutôt un complexe « Ni- nickelophore » (Cherrier et al., 2005) qui jouerait une fonction analogue au sidérophore pour le fer (ferrichrome). La nature de cette molécule est en cours d’identification. Il pourrait s’agir soit de 1,2,4-tricarboxylate butane soit de 1,2,3-tricarboxylate propane.
Une telle molécule pourrait être véhiculée dans le cytoplasme bactérien pour ensuite apporter le Ni(II) aux protéines impliquées dans la maturation des hydrogénases ou encore à EcNikR.
La formation d’un complexe ternaire nickelophore/Ni(II)/EcNikR pourrait être envisagée. Un tel complexe pourrait modifier les propriétés de métallation décrites jusqu’à présent sur le système EcNikR-Ni. Il pourrait être intéressant de regarder si un tel complexe existe in vivo ou peut être constitué in vitro.
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