87 Les tests diagnostiques basés sur l'analyse du sang sont attrayants en raison de la simplicité de la collecte d'échantillons. Différentes méthodes telles que l'analyse de microsatellites, l'analyse d'enrichissement par enzyme de restriction et l'analyse du polymorphisme de nucléotide unique identifient des altérations de l'ARN ou de l’ADN circulant dans le sérum et/ou dans le plasma de patients atteints de cancer qui correspondent à des altérations génétiques présentes dans les tumeurs primaires.
Ces analyses du sérum et/ou du plasma peuvent être utilisées pour le diagnostic précoce et d’autres stratégies de détection. Cependant, la complexité technique et le coût élevé limitent les applications cliniques immédiates.
L’ARN, l’ADN et la protéine circulants sont utilisés pour le diagnostic ou le pronostic de différents cancers, par exemple, le cancer du sein, le cancer du poumon et le cancer de la prostate. Nous avons choisi ces marqueurs pour le diagnostic ou le pronostic du cancer rénal. La méthode de spectrométrie, de PicoGreen, de PCR, et d’ELISA sont utilisés amplement en clinique. Nous avons utilisé ces méthodes pour le diagnostic ou le suivi des patients atteints de cancer rénal.
Pour diminuer les désagrégations d’acide nucléique, le sang périphérique est traité à 4 °C pendant 3-5 heures. Les produits d’extractio n de l’ARN sont congelés à - 80°C et les produits de l’extraction de l’ADN sont congelés à - 20°C.
Le niveau de l’ARN circulant dans le sérum chez les patients atteints de CRCC est plus élevé que chez les témoins sains. Chez les patients atteints de CRCC, le niveau de l’ARN circulant est indépendant de l’âge, du sexe, du stade TNM, du grade Fuhrman et de la taille de la tumeur. On peut aussi détecter le haut niveau d’ARN circulant dans le sérum chez les patients CRCC de bas stade, de bas grade et dans les petites tumeurs. Nous avons mesuré les niveaux de l’ARN circulant pré- néphrectomie et post-néphrectomie (7 jours) de sujets traités pour CRCC. Après néphrectomie (7 jours), une baisse de l’ARN circulant indique que la plupart de l’ARN circulant dans le sérum vient de la tumeur. Pour le diagnostic de CRCC, la sensibilité et la spécificité de l’ARN circulant dans le sérum sont significatives. Donc, l’ARN circulant dans le sérum peut être utilisé comme biomarqueur diagnostique du CRCC.
88 De plus, le niveau de l’ARN circulant est mesuré par spectrométrie, méthode simple, rapide et économique.
Nous avons détecté le haut niveau de l’ARNm de CA9 dans le sérum chez les patients atteints de CRCC. Par contre, nous n’avons pas trouvé d’ARNm de CA9 dans le sérum chez les témoins sains. De plus, le niveau de l’ARNm de CA9 dans le sérum est diminué après l’opération (7 jours). Donc, nous avons indiqué que tout l’ARNm de CA9 dans le sérum vient de la tumeur rénale chez les patients atteints de CRCC. De plus, le niveau de l’ARNm de CA9 dans le sérum est indépendant de l’âge, du sexe et du grade Fuhrman, mais est corrélé au stade TNM, à la présence de métastases et à la taille de la tumeur. Le niveau de l’ARNm de CA9 dans le sérum peut donc refléter la progression de la tumeur rénale. Pour le diagnostic de CRCC, la sensibilité et la spécificité de l’ARNm de CA9 dans le sérum sont significatifs. Donc, l’ARNm de CA9 dans le sérum peut être utilisé comme biomarqueur diagnostique du CRCC. La méthode de RT-PCR quantitative est complexe et coûteuse, mais elle peut quantifier précisément le niveau de l’ARNm de CA9.
Dans nos études, nous avons utilisé 2 méthodes différentes pour mesurer le niveau de l’ADN circulant dans le sérum. Le produit d’extraction de l’ADN est mesuré par spectrométrie et le niveau de l’ADN circulant dans le sérum est mesuré directement par la méthode de PicoGreen®. Par spectrométrie, la moyenne de l’ADN circulant dans le sérum chez les patients atteints de CRCC est plus élevée que chez les témoins sains, mais cette différence n’est pas significative. De même, par la méthode PicoGreen®, la moyenne de l’ADN circulant dans le sérum chez les patients atteints de CRCC est similaire à celle des témoins sains et la différence n’est pas significative. Des niveaux élevés d’ADN circulant sont observés chez les patients atteints des cancers testiculaire, colorectal et ovarien [Ellinger J et al. 2009, Schwarzenbach H et al. 2008, Zachariah RR et al. 2008]. Nos résultats par la méthode de spectrométrie et par la méthode de PicoGreen® indiquent que la différence n’est pas significative entre les patients atteints de CRCC et les témoins sains. Pour le diagnostic de CRCC, la sensibilité et la spécificité de l’ADN circulant dans le sérum ne sont pas significatives. Il y a des explications possibles pour nos résultats sur l’ADN circulant : l’ADN tumoral ne
89 représente pas tout l’ADN circulant dans le sérum chez les patients atteints de CRCC.
Le nombre de nos échantillons n’est pas suffisant pour une étude statistique. Les méthodes utilisées sont insuffisantes pour mesurer l’ADN circulant. Donc, plus d’échantillons et une autre méthode (par exemple, la PCR en temps réél) sont nécessaires pour confirmer ces résultats.
Dans la littérature, la méthode PCR en temps réel a été utilisée pour mesurer l’intégrité de l’ADN circulant. Dans nos études, nous avons choisi la PCR traditionnelle pour détecter les fragments de tailles différentes du gène GAPDH de l’ADN sérique. La distribution du gène GAPDH est homogène dans l’organisme et ce gène est utilisé normalement comme gène contrôle dans beaucoup d’essais. En outre, le niveau de l’ADN circulant du gène GAPDH ne permet pas de détecter de différence significative entre les groupes en fonction du sexe et de l’âge [Zhong XY et al. 2007]. Nous avons détecté 4 fragments de tailles différentes (109 bp, 193 bp, 397 bp et 456 bp) du gène GAPDH. Le fragment de 109 bp est utilisé comme contrôle de la qualité de l’ADN circulant dans le sérum et détecté dans tous les spécimens. Chez les témoins sains, nous avons détecté seulement les fragments de 109 bp et 193 bp.
Notre résultat est comparable à l’étude de Giacona MB et al sur la longueur de l’ADN du plasma chez les témoins sains [Giacona MB et al. 1998]. Par contre, les fragments de 397 bp et 456 bp sont détectés chez les patients atteints de CRCC. Nos résultats indiquent que l’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum chez les patients atteints de CRCC est mieux conservée que chez les témoins sains. De plus, nous avons aussi comparé l’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum de pré-néphrectomie et post- néphrectomie (7 jours). L’intégrité de l’ADN circulant est diminuée significativement après néphrectomie. Nos résultats indiquent que tous les fragments longs viennent de la tumeur rénale. De plus, chez les patients atteints de CRCC, il n’a pas été observé de différence significative entre les groupes pour l’âge, le sexe et le grade de Fuhrman. En outre, l’intégrité de l’ADN circulant est meilleure chez les patients présentant un stade élevé (T3) et/ou une grosse tumeur (> 4.0cm). Ces résultats peuvent être expliqués par la nécrose dépendant du stade et de la dimension de la tumeur. En conséquence, l'ADN circulant chez les patients atteints de CRCC a une
90 large gamme de longueurs de fragments d'ADN génomique après digestion incomplète ou aléatoire. Pour le diagnostic de CRCC, la sensibilité et la spécificité de l’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum sont significatives. Donc, l’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum peut être utilisée comme biomarqueur diagnostique du CRCC. La méthode de PCR traditionnelle est simple et économique. Mais, cette méthode quantifie qu’approximativement l’’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum.
Nous avons utilisé la méthode ELISA pour quantifier directement le niveau de la protéine CA9 dans le sérum. La moyenne de la protéine CA9 dans le sérum chez les patients atteints de CRCC est plus élevée que chez les témoins sains. Il n’a pas été observé de différence significative entre les groupes pour l’âge et le sexe. En outre, la moyenne de la protéine CA9 dans le sérum est plus élevée chez les patients présentant un stade élevé (T3), un grade élevé (3+4), et une grosse tumeur (> 4.0cm).
De plus, le niveau de la protéine CA9 dans le sérum est corrélé à la présence de métastases et de récidive. Le niveau de la protéine CA9 dans le sérum peut donc refléter la progression de la tumeur rénale. Pour le diagnostic de CRCC, la sensibilité et la spécificité de la protéine CA9 dans le sérum sont significatives. Donc, la protéine CA9 dans le sérum peut être utilisée comme biomarqueur diagnostique du CRCC.
Selon nos résultats, l’ARN circulant, l’ARNm de CA9, l’intégrité de l’ADN circulant et la protéine CA9 peuvent être utilisés comme biomarqueurs diagnostiques du CRCC.
Les sensibilités et les spécificités des biomarqueurs sont significatives. La méthode de spectrométrie et de PCR traditionnelle sont simples et économiques pour mesurer l’ARN circulant et l’intégrité de l’ADN circulant. On pourrait utiliser l’ARN circulant et l’intégrité de l’ADN circulant pour chercher un CRCC dans un groupe présentant des hauts risques de cancer rénal. La méthode de RT-PCR quantitative est complexe et coûteuse pour mesurer l’ARNm de CA9, mais, l’ARNm de CA9 à une meilleure sensibilité et une meilleure spécificité que les autres marqueurs. On pourrait utiliser l’ARNm de CA9 pour suspecter un CRCC.
Traditionnellement, 85% à 90% des masses solides rénales sont considérées comme des CCR. En utilisant la tomodensitométrie abdominale ou d’autres techniques
91 d'imagerie, beaucoup de petites tumeurs rénales asymptomatiques sont découvertes fortuitement [Vasudevan A et al. 2006]. Or, 20% des petites tumeurs rénales solides seraient bénignes [Li G et al. 2004], et l’imagerie distingue difficilement une petite lésion bénigne d’une petite lésion maligne [Zhang J et al. 2007]. Un diagnostic préopératoire de bénignité ou de malignité est pourtant essentiel à l’heure où la chirurgie partielle tend à supplanter la néphrectomie totale pour ces petites tumeurs, et où apparaissent d’autres modes de prise en charge : thérapeutiques destructrices par radiofréquence ou cryoablation.
L’aspiration à l’aiguille fine (FNA) est une technique sûre, peu traumatisante, et les complications sont rares. Toutefois, le nombre de cellules obtenues par la FNA est très faible (seulement quelques cellules), et les cellules anormales peuvent être absentes, rendant le diagnostic cytologique impossible ou faussement négatif. Les progrès récents des techniques cytologiques, en particulier avec l'aide des biomarqueurs moléculaires, améliorent la sensibilité et la spécificité de la FNA [Li G et al. 2006]. Comme l'imagerie guidée pour la biopsie percutanée, la FNA des masses rénales peut être utilisée pour diagnostiquer les tumeurs bénignes et ainsi adapter la prise en charge [Jaff A et al. 2005, Wunderlich H et al. 2005]. Toutefois, la FNA est une procédure coûteuse et complexe, qui nécessite un radiologue et un cytopathologiste expérimentés.
Nous avons analysé les résultats des petites tumeurs solides (diamètre ≤ 4 cm). Les sensibilités et les spécificités de l’ARN circulant (79% et 53%), de l’intégrité de l’ADN circulant (81% et 61%), l’ARNm de CA9 (83% et 100%) sont significatives. L’ARNm de CA9 a une meilleure sensibilité et une meilleure spécificité. L’ARN circulant et l’intégrité de l’ADN circulant sont des méthodes simples et économiques pour aider à identifier une tumeur maligne avant l’opération. Selon nos résultats, on pourrait utiliser ces marqueurs pour aider à distinguer les petites tumeurs rénales solides avant l’opération.
D’après la méthode statistique du t-test et l’analyse de régression, nous avons comparé les résultats de l’ARN circulant, de l’ARNm de CA9, de l’ADN circulant et de
92 la protéine CA9 dans le sérum chez les mêmes patients (32 patients). Les niveaux de l’ARN circulant et de l’ADN circulant sont significativement différents (P=0.006) et significativement indépendants (R=0.273). Les niveaux de l’ARN circulant et de protéine CA9 sont significativement différents (P=0.015) et significativement indépendants (R=0.328). De plus, les niveaux de l’ADN circulant et de la protéine CA9 sont aussi significativement différents (P=0.011) et significativement indépendants (R=0.364). Les explications des résultats sont inconnues. Nous supposons que les mécanismes de sortie et de dégradation de l’ARN circulant, de l’ADN circulant et de la protéine CA9 peuvent être différents dans la circulation. Par contre, les niveaux de l’ARN circulant et de l’ARNm de CA9 sont significativement identiques (P=0.374) et significativement corrélés (R=0.847). Nous supposons que les mécanismes de sortie de l’ARN circulant et de l’ARNm de CA9 peuvent être similaires. La fabrication des protéines dépend toujours des ARNm. Dans les cellules, le niveau de la protéine est aussi corrélé au niveau de l’ARNm. Nous n’avons pas trouvé de relation entre le niveau de la protéine CA9 et le niveau de l’ARNm de CA9 dans le sérum (R=0.558). Nous ne savons pas la raison exacte.
Une difficulté de suivi après l’ablation du CCR est la prédiction précoce de la récidive.
Environ 70% des CCR sont des tumeurs localisées. Mais, 30-40% des patients présenteront une évolution métastatique mortelle. La plupart des récidives apparaissent dans les trois à cinq ans après la chirurgie [Skolarikos A et al. 2007]. Donc, l’évaluation des risques de récidive est importante.
Le niveau de l’ARN circulant, de l’ARNm de CA9 et de l’intégrité de l’ADN circulant est diminué après l’opération. Donc, on pourrait utiliser ces marqueurs pour surveiller les patients atteints de CRCC après l'opération. Mais, l’ARN circulant et l’intégrité de l’ADN circulant ne sont pas des marqueurs spécifiques du cancer rénal. En dehors de la récidive du cancer rénal, plusieurs facteurs peuvent augmenter l’ARN circulant et l’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum. De plus, le niveau de l’ARN circulant dépend de la standardisation du recueil et du traitement des échantillons en clinique.
L’ARNm de CA9 et la protéine CA9 sont des marqueurs spécifiques du cancer rénal,
93 mais, le niveau de l’ARNm de CA9 dépend de la standardisation du recueil et du traitement des échantillons en clinique. La qualité de l'échantillon influe beaucoup sur le niveau de l’ARNm de CA9 dans le sérum. Par contre, la protéine CA9 est plus stable que l’ARNm de CA9 dans le sérum. Donc, nous avons choisi la protéine CA9 et étudié la protéine CA9 comme le marqueur pronostique du cancer rénal.
La moyenne de la protéine CA9 dans le sérum chez les patients atteints de CRCC métastatique ou récidive de CRCC est plus élevée que celle des patients atteints de CRCC localisés. Dans notre étude sur le taux préopératoire de la protéine CA9 dans le sérum chez des sujets présentant un CRCC localisé, la courbe de survie de Kaplan- Meier indique que le groupe à taux élevé de protéine CA9 a un plus grand risque de récidive que le groupe avec taux faible. Dans l’analyse univariée de régression de Cox, le niveau de la protéine CA9 sérique est un facteur plus sensible que le stade TNM, la taille de la tumeur et le grade Fuhrman. Donc, le niveau de la protéine CA9 dans le sérum pourrait être utilisé pour guider le suivi post opératoire et peut être dans l’avenir indiquer un traitement adjuvant précoce des patients du groupe à haut risque de récidive.
Les études approfondies sont nécessaires pour connaître les mécanismes de sortie et de dégradation des marqueurs. Les études au long cours sont nécessaires pour apprécier l’utilisation multiple de marqueurs.
94
IV - Conclusion générale
95 Notre étude est la première à s’intéresser de manière systématique aux biomarqueurs sériques des patients atteints de CCR.
Nous avons montré que le taux de l’ARN circulant dans le sérum chez les patients atteints de CRCC était plus élevé que chez les patients atteints d’oncocytome rénal et que chez les témoins sains. Le taux élevé de l’ARN circulant dans le sérum pourrait constituer un marqueur pour le diagnostic de CRCC.
Nous avons montré que le taux de l’ARN messager de CA9 dans le sérum chez les patients atteints de CRCC était plus élevé que chez les témoins sains. Le taux élevé de l’ARN messager de CA9 dans le sérum pourrait représenter un marqueur puissant pour le diagnostic de CRCC.
Nous avons montré que l’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum chez les patients atteints de CRCC était meilleure que chez les patients atteints d’oncocytome rénal et que chez les témoins sains. L’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum pourrait constituer un marqueur pour le diagnostic de CRCC.
Nous avons montré que le niveau de protéine CA9 dans le sérum chez les patients atteints de CRCC métastatique était plus élevé que chez les patients atteints de CRCC localisé et que chez les témoins sains. Le niveau élevé de protéine CA9 dans le sérum suggère un risque élevé de récidive. Le niveau de protéine CA9 dans le sérum pourrait aider au suivi post-opératoire des patients atteints de CRCC.
Le CA9, surtout sous forme d’ARN messager présent dans le sérum, semble prometteur pour le diagnostic précoce et le suivi des malades porteurs de CRCC par une technique de biologie moléculaire très standardisable et reproductible. Un brevet a été déposé pour envisager une exploitation industrielle.
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V- BIBLIOGRAPHIE
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