Niveaux d'ADN circulant dans le sérum de sujets présentant différents types de CCR et de sujets témoins sains. De plus, l’intégrité de l’ADN circulant chez les patients atteints de CRCC est meilleure que chez les patients atteints d’oncocytome rénal et chez les témoins sains. L'intégrité de l'ADN circulant dans le sérum peut constituer un marqueur pour le diagnostic du CRCC.
Le cancer du rein
Diagnostic
- Diagnostic radiologique
- Diagnostic histologique
- Tumeurs bénignes
Le cancer du rein provient de différents segments des canaux urinaires intraparenchymateux (tubes collecteurs proximaux, distaux). Ce sont des tumeurs qui se développent à partir du tube contourné distal et représentent 10 à 15 % des cancers du rein. Ce sont des tumeurs de très mauvais pronostic, représentant moins de 1 % des cancers du rein et touchant les hommes jeunes.
Pronostic
- Type histologique
- Grade nucléaire
- Stade
- Ploïdie et prolifération cellulaire
- Marqueurs de l’adhésion cellulaire
En revanche, lorsqu’ils sont petits, le diagnostic de cancer du rein est impossible à poser car ils ont le même aspect à l’imagerie. Le stade tumoral décrit la taille de la tumeur et son éventuelle extension au-delà du rein. Un diagnostic précoce et la détermination de facteurs pronostiques fiables sont donc particulièrement importants dans le cancer du rein.
Les marqueurs moléculaires du carcinome rénal
La voie HIF dans le cancer du rein
- Le gène VHL
- CA: L’anhydrase carbonique
- Historique
- Fonction-physiologie des CAs
- Détection de CA9 dans les cellules et les tissus
Ces altérations du gène VHL sont absentes dans le CRCH et l'oncocytome rénal [Gnarra JR et al. De plus, l’ARNm de CA9 n’est pas trouvé dans le tissu rénal normal ni dans le sang provenant de témoins sains [Li et al. Li et al ont mesuré le niveau d'ARNm de CA9 dans le tissu tumoral de patients atteints de CRCC.
Autres marqueurs moléculaires du CCR
Recherche de marqueurs moléculaires sériques
ARN circulant
ADN circulant
- Source de l’ADN circulant
- Quantification de l’ADN circulant
- Intégrité de l’ADN circulant
L'ADN circulant a souvent une structure similaire à celle des cellules apoptotiques [Fournie GJ et al. Chez les patients atteints d'un cancer de la prostate, l'intégrité de l'ADN plasmatique a également augmenté davantage que chez les témoins sains [Hanley R et al.2006]. Hanley R a utilisé des sondes PCR en temps réel et TaqMan de différentes tailles pour mesurer l'intégrité de l'ADN [Hanley R et al.2006].
Les objectifs du travail
Matériels
Patients et témoins sains
Collecte des échantillons
Méthodes
- Extraction de l’ARN
- Extraction de l’ADN
- Transcription inverse (RT)
- RT-PCR one-step
- PCR traditionnelle
- PCR quantitative
- Electrophorèse
- Mesure de l’intégrité de l’ADN circulant
- PicoGreen ® assay
- Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay (ELISA)
Nous avons utilisé le kit QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen, Courtaboeuf, France) pour extraire l'ADN total dans le sérum. La première étape était une dénaturation à 94°C pendant 2 minutes, le cycle de PCR était le suivant : après dénaturation à 94°C pendant 1 minute, les brins d'ADN ont été chauffés à 57°C. Les fragments d'ADN ont été visualisés et photographiés sous lumière UV avec coloration BET.
La position des produits de PCR par rapport à la position des bandes séquentielles d'ADN standard, les tailles des produits de PCR ont été précisées. L'intégrité de l'ADN circulant est exprimée par le rapport GAPDH4/GAPDH1, GAPDH3/GAPDH1 et GAPDH2/GAPDH1. PicoGreen® est 10 000 fois plus sensible que la méthode d'absorption UV et beaucoup plus sélectif pour l'ADN double brin que pour l'ADN et l'ARN simple brin.
Le test PicoGreen® minimise donc la contribution de la fluorescence de l’ARN et de l’ADN simple brin. Le test PicoGreen® permet la quantification de seulement 25 pg/ml d'ADN double brin par un spectrofluorimètre. Ensuite, l'étalon d'ADN est dilué à des concentrations de 100 µg/ml à 2 µg/ml par un tampon 1X TE.
Courbes de fluorescence du PicoGreen® avec ARN (ARN), ADN double brin (ADNdb) et ADN simple brin (ADNsb).
Résultats
Premier article
- Introduction
- Discussion
- Introduction
- Discussion
Dans cette étude, nous avons quantifié le niveau d’ARN circulant chez les patients atteints de CRCC. Cet article est le premier à montrer que le taux d'ARN circulant est significativement plus élevé dans le sérum des patients atteints de CRCC que dans celui des sujets sains, sans corrélation avec l'âge, le stade TNM, le grade de Fuhrman et la taille de la tumeur. Par conséquent, le niveau d’ARN circulant peut être utilisé comme biomarqueur sérique pour le diagnostic du CRCC.
Nos données suggèrent que le taux d'ARN circulant est plus élevé dans le CRCC que dans l'oncocytome rénal. Cette réduction significative indique que l’augmentation de l’ARN circulant pourrait provenir de la tumeur elle-même. Ce résultat prouve également que l’ARN circulant peut être utilisé pour le suivi postopératoire.
La spectrophotométrie utilisée pour mesurer le niveau d’ARN circulant est couramment utilisée en laboratoire et ouvre donc la voie à une utilisation pratique. En conclusion, nous avons démontré le niveau élevé d’ARN circulant chez les patients CRCC. Les données suggèrent que l'ARN circulant pourrait être un outil de diagnostic permettant de distinguer les patients atteints de CRCC des témoins sains ou des patients atteints d'oncocytome rénal.
L’ARN circulant utilisé comme biomarqueur sérique constitue un nouveau domaine de recherche pour le diagnostic du CRCC.
Troisième article
- Introduction
- Discussion
Bien que la forme soluble de la protéine CA9 ait été trouvée dans le sérum, aucun rapport sur l'utilité clinique de la protéine CA9 sérique chez les patients atteints de cancer n'a été publié. Nous avons étudié le taux sérique de protéine CA9 chez les patients CRCC. Nos données indiquent que la protéine sérique CA9 est élevée chez la majorité des patients atteints de CRCC.
Le niveau de protéine sérique CA9 est en corrélation avec la taille, le stade et le grade de la tumeur. Le taux de protéine CA9 dans le sérum des patients présentant des métastases de CRCC est significativement plus élevé que chez les patients présentant une forme localisée et que chez les patients sains. Nos données montrent que la protéine sérique CA9 a une sensibilité et une spécificité acceptables pour le diagnostic du CRCC.
La courbe de survie montre clairement la différence entre le groupe avec des niveaux élevés de protéine CA9 et le groupe avec de faibles niveaux. Des niveaux élevés de protéine CA9 sont associés à un taux élevé de récidive du CRCC. Selon l'analyse de régression univariée de Cox, le grade, la taille de la tumeur et la protéine CA9 étaient des facteurs significatifs de récidive postopératoire du CCRC.
La protéine CA9 pourrait donc permettre l'identification d'une sous-population caractérisée par un risque plus élevé de récidive et représenter un nouvel outil moléculaire pour guider la surveillance et le traitement postopératoires.
Article 1 en cours
- Introduction de l’article
- Matériels et méthodes
- Résultats préliminaires
- Discussion des résultats
L’ARNm sérique moyen de CA9 chez les patients CRCC (copies/ml) est supérieur à celui des témoins sains (0 copie/ml). Niveaux d'ARNm CA9 dans le sérum de sujets atteints de CRCC et de témoins sains. Entre le groupe préopératoire et le groupe postopératoire, la différence d'ARNm sérique CA9 est hautement significative (P = 0,001).
Courbe ROC évaluant la valeur diagnostique du taux d'ARNm CA9 dans le sérum des tumeurs rénales. Les taux d'ARNm CA9 dans le sérum des sujets atteints de CRCC ne variaient pas en fonction du sexe (P = 0,507). 78 Le niveau d'ARNm CA9 dans le sérum est significativement plus élevé chez les patients présentant des métastases ganglionnaires (N+) ou viscérales (M+) par rapport aux patients atteints de CRCC localisé (P = 0,027).
Nos observations confirment que les patients présentant des taux sériques élevés d’ARNm CA9 présentent un risque plus élevé de métastases. Les taux sériques moyens d’ARNm CA9 préopératoires étaient significativement plus élevés que les taux postopératoires (P = 0,001). Ces résultats indiquent que l’ARNm sérique CA9 provient de la tumeur.
L’ARNm CA9 dans le sérum peut être utilisé pour surveiller les patients après un traitement chirurgical ou ablatif.
Article 2 en cours
- Introduction de l’article
- Matériels et méthodes
- Résultats préliminaires
- Discussion
Cependant, aucune différence significative dans l'ADN sérique circulant n'a été observée entre le groupe CRCC et le groupe oncocytome rénal (P = 0,714), entre le groupe CRCC et le groupe témoin sain (P = 0,064). De plus, la différence d’ADN sérique circulant entre le groupe oncocytome rénal et le groupe témoin sain n’était pas significative (P = 0,227). Niveaux d'ADN circulant dans le sérum chez les sujets atteints de CRCC, CRTP, CRCH, oncocytome rénal, kyste rénal et chez des témoins sains.
Nous avons mesuré le niveau d'ADN circulant dans le sérum de patients atteints de CCR et de sujets témoins sains à l'aide de méthodes spectrométriques et PicoGreen®. L'ADN circulant moyen dans le sérum des témoins sains était de 1 698 ng/ml par spectrométrie et de 5 779 ng/ml par PicoGreen®. De plus, l'ADN circulant moyen dans le sérum des patients atteints de CRCC (2334 ng/ml par spectrométrie et 6381 ng/ml par PicoGreen®) est inférieur à celui des patients atteints d'un cancer du poumon (24300 ng/ml) [Sozzi G et al. .
Cependant, nous n’avons observé aucune différence significative dans l’ADN circulant dans le sérum entre le groupe CRC et le groupe témoin sain. Plusieurs facteurs peuvent interférer avec l’absorption lors de la quantification de l’ADN circulant dans le sérum. Nos résultats ne nous permettent pas de considérer le taux d’ADN circulant dans le sérum comme moyen de diagnostic du CCR.
La quantification de l'ADN circulant dans le sérum par une autre méthode (par exemple, PCR en temps réel) est nécessaire pour confirmer nos résultats.
Discussion générale
Le niveau d'ARN circulant dans le sérum des patients atteints de CRCC est supérieur à celui des témoins sains. La sensibilité et la spécificité de l'ARN circulant dans le sérum sont importantes pour le diagnostic du CRCC. Nous avons détecté un niveau élevé d’ARNm CA9 dans le sérum des patients atteints de CRCC.
De plus, le taux d’ARNm CA9 dans le sérum est réduit après la chirurgie (7 jours). Le niveau d’ARNm CA9 dans le sérum peut donc refléter la progression de la tumeur rénale. Pour le diagnostic du CRCC, la sensibilité et la spécificité de l’ARNm sérique CA9 sont significatives.
Dans nos études, nous avons utilisé 2 méthodes différentes pour mesurer les niveaux d’ADN circulant dans le sérum. Nos résultats montrent que l’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum est mieux préservée chez les patients CRCC que chez les témoins sains. La sensibilité et la spécificité de l’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum sont importantes pour le diagnostic du CRCC.
Par conséquent, l’intégrité de l’ADN circulant dans le sérum peut être utilisée comme biomarqueur diagnostique du CRCC. La qualité de l’échantillon influence grandement le niveau d’ARNm CA9 dans le sérum. Le taux élevé d'ARN circulant dans le sérum pourrait constituer un marqueur pour le diagnostic de CRCC.
