Discussion

Le ClC-5 est sensible au pH extracellulaire

Nous avons vu que le xClC-5 est insensible aux variations du pH intracellulaire pour des valeurs proches du pH physiologique. D'autres techniques pourraient être mises en œuvre pour déterminer la sensibilité au pH intracellulaire dans une gamme de pH plus large.

Par contre, l'acidification du milieu extracellulaire inhibe l'activité électrique du xClC-5.

Des résultats similaires aux notres (Schmieder et al., 1998) ont récemment été publiés par Mo et al. (1999) et par Friedrich et al. (1999).

L'inhibition par l'acidification extracellulaire est une caractéristique propre au ClC-5

La modulation de l'activité électrique par le pH intra- et/ou extracellulaire a été décrite pour divers canaux ioniques (Tombaugh and Somjen, 1996; Duprat et al., 1997; Chalfant et al., 1999; Abriel and Horisberger, 1999) (Tableau 11). Au sein même de la famille des ClC, la dépendance vis-à-vis du pH a pu être mise en évidence pour plusieurs membres. Dès 1983, Hanke et Miller montrent que l'acidification intracellulaire active le courant conduit par les canaux ClC-0 reconstitués dans des bicouches artificielles à partir de l'électroplaque de Torpedo marmorata. Contrairement au ClC-0, qui apparaît totalement insensible au pH extracellulaire, le ClC-1, canal majoritaire du muscle squelettique, est activé lors de l'acidification du milieu extracellulaire (Rychkov et al., 1996 et 1997). L'acidification du milieu extracellulaire active également le ClC-2 (Malinowska et al., 1995; Sherry et al., 1997; Jordt and Jentsch, 1997).

Puisque l'acidification extracellulaire peut se traduire par une stimulation ou bien par une inhibition, on peut considérer l'effet d'une variation de pH sur l'activité d'un canal comme une

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caractéristique propre de ce canal. Ces études montrent aussi que la régulation des canaux ioniques par le pH peut se faire sur l'une et/ou l'autre face de la protéine canal et repose probablement sur des mécanismes divers.

Canal pH extracellulaire pH intracellulaire Références

ENaC insensible acidification inhibe Harvey et al., 1988; Chalfant et al., 1999;

Abriel and Horisberger, 1999

TASK acidification inhibe insensible Duprat et al., 1997

ClC-0 insensible acidification

stimule¹

Hanke and Miller, 1983

ClC-1 sensible² sensible³ Fahlke et al., 1996; Rychkov et al., 1996 et 1997

ClC-2 acidification stimule¹ n.d. Malinowska et al., 1995; Sherry et al., 1997;

Jordt and Jentsch, 1997

ClC-K1 acidification inhibe n.d. Uchida et al., 1995

ClC-5 acidification inhibe insensible⁴ Schmieder et al., 1998; Friedrich et al., 1999;

Mo et al., 1999

Tableau 11: Effet de variations du pH extracellulaire et intracellulaire sur les courants conduits par différents canaux ioniques. n.d.: non déterminé.

Mécanismes d'action des protons

L'étude de l'influence du pH sur différents paramètres électrophysiologiques peut aider à préciser le mécanisme d'action des protons. D'après Rychkov et al. (1996), la probabilité d'ouverture du ClC-1 augmente avec la concentration de chlorure extracellulaire. La protonation du canal sur sa face extracellulaire augmenterait l'affinité pour le chlorure extracellulaire, empêchant ainsi la fermeture du canal en présence d'un milieu extracellulaire acide.

L'ouverture du canal ClC-2 par l'hyperpolarisation ou le choc hypo-osmotique met en jeu la région N-terminale de la protéine. L'étude réalisée par Jordt et Jentsch (1997) montre que la sensibilité au pH extracellulaire est également portée par la queue N-terminale du canal, qui serait impliquée dans un mécanisme de type "balle et chaîne" (ball and chain) dans lequel la région évoquée constituerait une structure permettant la fermeture du canal en se liant sur un autre domaine cytoplasmique de la protéine (Jordt and Jentsch, 1997).

1 L'acidification intracellulaire augmente la probabilité d'ouverture du canal.

2 L'acidification extracellulaire stimule le courant et ralentit la cinétique d'inactivation. La dépendance du pH extracellulaire interfère avec la dépendance de la concentration extracellulaire en chlorure.

3 L'acidification intracellulaire diminue l'inactivation du courant et augmente la probabilité d'ouverture du canal.

4 Aucun effet n'a été observé pour des valeurs proches du pH physiologique.

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La sensibilité au pH extracellulaire du xClC-5 que nous décrivons suggère qu'un ou plusieurs sites de liaison aux protons se situent sur la face extracellulaire de la protéine. Comme la courbe de titration a permis de déterminer un pKa de 6,7, le site de fixation pour les protons pourrait être au niveau d'un résidu histidine (De Biasi et al., 1993). D'autre part, un coefficient de Hill d'environ 2,2 pourrait refléter l'existence de plusieurs sites de liaison au niveau du canal (Duprat et al., 1993; Rychkov et al., 1997). Ce résultat est conciliable avec une organisation structurale en homodimère, dans laquelle chaque protomère présente un site de liaison pour un proton. Une telle organisation en dimère a été montrée pour le canal ClC-0 (Hanke and Miller, 1983; Middleton et al., 1996; Ludewig et al., 1996) et a été largement suggérée pour les canaux ClC-1 et ClC-2 (pour revue, voir Jentsch, 1999).

Signification physiologique de la sensibilité au pH

La connaissance de la localisation d'un canal (au niveau tissulaire et sur les différentes membranes et endomembranes cellulaires) aide à la compréhension de la signification du rôle physiologique de sa sensibilité au pH. En effet, les canaux ioniques présents sur les membranes de certains compartiments intracellulaires sont soumis de manière physiologique à un pH éloigné du pH cytosolique au niveau de la lumière du compartiment intracellulaire. Le milieu extracellulaire peut subir des acidifications transitoires et locales de manière physiologique. Par exemple, dans le système nerveux, une acidification transitoire du milieu extracellulaire a été décrite lors de la transmission synaptique au niveau de l'hippocampe (Krishtal et al., 1987).

Enfin, des variations du pH extracellulaire peuvent survenir dans des situations pathophysiologiques comme l'ischémie ou les activités épileptiformes (Mutch and Hansen, 1984; Siesjö et al., 1985; Nedergaard et al., 1991). Des conditions d'hypertension oculaire peuvent également aboutir à une acidification intra-rétinale (Yamamoto et al., 1992).

Ainsi, les interprétations de la sensibilité au pH des différents canaux sont variées et parfois divergeantes ou controversées. L'inhibition de la conductance au sodium sensible à l'amiloride, identifiée comme le canal sodium ENaC, a été interprétée comme un signal de cross- talk dès 1988 par Harvey et al.. La même interprétation en est faite en 1999 par Abriel et Horisberger. Ces auteurs parlent d'un effet de rétrocontrôle négatif. Par contre, l'inhibition de la conductance au sodium est vue comme un effet de régulation du pH intracellulaire par Chalfant et al. (1999). Le canal potassium TASK a été proposé comme senseur du pH extracellulaire par Duprat et al. (1997). Une forme gastrique du ClC-2 serait impliquée dans la sécrétion de HCl au niveau de l'estomac (Malinowska et al., 1995; Sherry et al., 1997). Cette hypothèse est controversée pour deux raisons: les caractéristiques électrophysiologiques du courant étudié ne coïncident pas avec celles du courant ClC-2 exprimé dans différents systèmes cellulaires (Thiemann et al., 1992; Jordt and Jentsch, 1997; Furuwaka et al., 1998) et la spécificité gastrique de la protéine n'est pas établie (Thiemann et al., 1992; Furuwaka et al., 1995; Cid et al., 1995).

Etant donné que le rôle physiologique du ClC-2 n'est toujours pas identifié, il est difficile de spéculer sur le rôle physiologique de sa sensibilité au pH. Aussi, on n'explique pas encore

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comment l'augmentation du courant ClC-1 en milieu extracellulaire acide peut être conciliée avec la diminution de la conductance au chlorure observée sur les fibres musculaires intactes dans ces conditions (Palade and Barchi, 1977).

Concernant le canal ClC-5, la signification physiologique de sa régulation par le pH extracellulaire sera discutée dans un cadre plus large, tenant compte également de sa localisation et de son lien avec la maladie de Dent (voir chapitre 8).

En bref, il apparaît que l'activité électrique du xClC-5, exprimé dans l'ovocyte de xénope, est régulée par le pH extracellulaire, mais est insensible à une acidification du milieu intracellulaire jusqu'à une demie unité pH en dessous du pH physiologique. L'acidification du milieu extracellulaire inhibe le courant conduit par le xClC-5 avec un pK_a d'environ 5,7. Le site de liaison protonique pourrait impliquer un ou plusieurs résidus histidine sur la face extracellulaire du canal. En effet, le coefficient de Hill de 2,2 pourrait être le reflet de la structure homodimérique du canal.

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