E.2.a Haute teneur en modificateur organique

Les Tableau VII-4 et Tableau VII-5 donnent les coefficients normalisés pour les facteurs de rétention des composés hydrophobes respectivement dans le méthanol et l’acétonitrile.

Concernant les composés neutres, la qualité d’ajustement du modèle apparaît satisfaisante avec chacun des modificateurs organiques. Seuls les facteurs teneur en solvant et la température s’avèrent influents pour tous les solutés, quel que soit le modificateur organique, exception faite de la digitoxine trop peu retenue dans l’acétonitrile. Ceci confirme le mécanisme de rétention attendu, de type partage. Les effets des facteurs mis en évidence sont encore plus prononcés dans le méthanol. La teneur en solvant apparaît généralement deux fois plus influente que la température, à par dans le cas du triphénylène. Quant aux asymétries et aux efficacités correspondantes, la modélisation échoue (valeurs de Q² très basses), rendant les coefficients inexploitables, malgré un indice d’information potentiellement intéressant (valeurs supérieures à

Etude de robustesse : domaine d’application 0,5). Ce phénomène, combiné à la haute variabilité observée pour les points au centre, confirme le problème de reproductibilité de tels paramètres chromatographiques déjà rencontré au niveau des mesures d’efficacité pendant le circuit interlaboratoire sur le projet européen d’une colonne de référence, « HPLC column as a reference material » [221].

Tableau VII-4 : Estimations des coefficients normalisés pour la modélisation des facteurs de rétention des composés neutres à haut niveau de solvant ; seuls les coefficients significatifs sont figurés.

Digitoxine Butylbenzène Pentylbenzène o-Terphényle Triphénylène Solvant MeOH MeCN MeOH MeCN MeOH MeCN MeOH MeCN MeOH MeCN Moyenne 1,65 0,64 5,26 5,39 7,67 7,69 7,33 6,73 15,62 9,86

%S - -2,19 -3,44 -2,58 -3,84 -2,80 -3,98 -2,98 -3,79 -2,61

T - -1,53 -1,04 -1,72 -1,14 -1,77 -1,11 -2,46 -1,52

Conc. pH

%S*%S T*T pH*pH Conc.*Conc.

%S*T

%S*pH

%S*Conc.

T*pH T*Conc.

pH*Conc.

R² 0,99 0,99 1,00 0,99 1,00 0,99 1,00 0,99 1,00 0,99 Q² 0,61 0,73 0,70 0,68 0,71 0,69 0,74 0,70 0,81 0,75

Tableau VII-5 : Estimations des coefficients normalisés pour la modélisation des facteurs de rétention des composés basiques à haut niveau de solvant ; seuls les coefficients significatifs sont figurés.

Clofazimine Amiodarone Solvant MeOH MeCN MeOH MeCN Moyenne 2,98 4,06 10,07 7,15

%S -3,57 -1,99 -3,45 -1,25

T -1,11 1,42

pH 10,08 10,89 18,05 19,39

Conc. -1,36 -1,10

%S*%S

pH*pH 2,12T*T 3,99

Conc.*Conc.

%S*T

%S*pH -0,54 -0,69

%S*Conc.

T*pH T*Conc.

pH*Conc.

R² 1,00 0,99 1,00 1,00 Q² 0,90 0,57 0,92 0,70

Pour les composés basiques, à savoir la clofazimine et l’amiodarone, si la teneur en solvant possède un effet du même ordre de grandeur que celui constaté sur les neutres, la température, au contraire, est à peine mise en évidence. Le pH, comme attendu, s’avère le facteur le plus influent : il intervient à la fois par des termes linéaire et quadratique 3 à 15 fois plus importants que ceux relatifs au solvant. De plus, la valeur du coefficient linéaire du pH ne semble pas beaucoup dépendre de la nature du modificateur organique, au contraire du terme quadratique, noté uniquement pour l’amiodarone. Manifestement, au voisinage des conditions nominales du test, la rétention de la clofazimine peut s’approximer par une fonction linéaire du pH tandis que pour l’amiodarone, il est nécessaire de rajouter un terme correctif quadratique

[359]. Afin d’expliquer ce phénomène, nous nous sommes appuyés sur des données publiées [360-363]. Nous pouvons alors estimer de façon approximative⁴⁵ le pH apparent des phases mobiles en fonction de la teneur et de la nature du modificateur organique : à 25°C, de 5,00 en solution purement aqueuse, le pH d’un tampon acétate s’élève à 6,7 avec 70% de méthanol et jusqu’à 7,5 avec 59% d’acétonitrile. Concernant les solutés, s’agissant de composés basiques, leur pK_a va au contraire s’abaisser avec l’ajout de modificateur organique. En première approximation, prenons une dérive moyenne de -0,6 pour chaque sonde quel que soit le solvant : les pK_As de la clofazimine et de l’amiodarone descendent respectivement à 7,0 et 8,1. En intégrant ces valeurs dans l’équation régissant la rétention des composés ionisables en fonction du pH,

+

−

−

+ ⋅

= +

10 1 10

A

A

pK pH

B BH

pK pH

k k

k , où k_B et k_BH+ représentent les facteurs de capacité des espèces B et BH⁺, nous obtenons la modélisation de la Figure VII-3. Précisons toutefois que les facteurs de rétention sont fictifs, n’ayant pas accès aux valeurs réelles relatives aux formes complètement ionisée et neutre pour les composés, qui fixent d’ailleurs la valeur de la pente pour l’approximation linéaire.

Figure VII-3 : Modélisation du facteur de rétention de composés basiques en fonction du pH apparent de la phase mobile ; pKA fixés à 7,0 (trait plein) et à 8,1 (croix), la valeur de pH apparent (fixée pour l’exemple à 7,2) est figurée sous la forme de pointillés.

S’agissant de la clofazimine, pour les deux modificateurs organiques, la rétention se situe toujours dans le domaine de l’approximation linéaire. Quant à l’amiodarone, la modélisation de sa rétention nécessite un modèle quadratique pour les deux modificateurs organiques. D’après le Tableau VII-5, le coefficient du second degré est d’ailleurs deux fois plus important dans l’acétonitrile que dans le méthanol. Cette variation peut s’expliquer par la mise en jeu de phénomènes de solvatation différentielle des espèces conjuguées du couple B/BH⁺ qui dépendent de la nature du solvant.

45 Toutes les données disponibles faisant état d’une température à 25°C, nous ne pourrons pas évaluer le pH apparent de nos phases mobiles à 40°C. Néanmoins, l’élévation de température ne remettant pas en cause l’ordre des pH et pK apparents, le raisonnement exposé reste valable.

Approximation linéaire

Modèle quadratique (+)

Modèle quadratique (-) kB

kBH+

Etude de robustesse : domaine d’application Les facteurs température et concentration, lorsqu’ils sont mis en évidence, s’avèrent faiblement influents. Pour la température, autant le coefficient pour la clofazimine est homogène avec ceux des composés neutres, autant l’inversion de signe constatée pour l’amiodarone s’avère difficile à expliquer de façon simple, des phénomènes compensateurs pouvant être mis en jeu. En effet, la hausse de la température provoque une élévation de la constante de dissociation, qui se traduit par une diminution de la concentration de BH⁺ mais a contrario une augmentation de celle de SiO^-, phénomène pouvant expliquer au final une rétention ayant tendance à augmenter [110, 364]. Etant donnée la valeur relativement faible de Q², nous ne discuterons pas plus en détails l’absence de ce comportement sur la clofazimine dans l’acétonitrile. Le facteur concentration, influent dans le méthanol uniquement, révèle sans équivoque la participation d’un mécanisme d’échange de cations à la rétention des composés basiques. Notons néanmoins que la qualité de prédiction du modèle est meilleure en méthanol, vraisemblablement grâce à la présence supplémentaire du facteur concentration et du terme d’interaction solvant*pH.

Quant à l’asymétrie de pic et à l’efficacité de l’amiodarone (résultats non figurés), le pH s’affirme comme le principal facteur influent, dans les deux modificateurs organiques, à l’exception de l’efficacité dans l’acétonitrile où aucun facteur n’est mis en évidence (valeurs très faibles pour R² et Q²). L’accroissement du pH induit des réductions de l’asymétrie de pic et de la hauteur de plateau réduite, traduisant une meilleure efficacité. Ce phénomène, combiné à l’influence de la concentration sur les facteurs de rétention, possède certainement pour origine la diminution de la fraction de la base sous forme protonée pendant l’augmentation du pH : en partant du principe que la plupart des groupements silanol sont déjà dissociés, la part d’échange d’ions participant au mécanisme de rétention diminue avec le nombre de BH+, impliquant une meilleure symétrie de pic et consécutivement une meilleure efficacité.