DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS VI

Ces travaux ont été réalisés au Laboratoire de Chimie Environnementale et Analytique de l'Ecole Supérieure de Physique et de Chimie Industrielles de Paris, dirigé par le Professeur Marie-Claire HENNION. M. David Victor McCALLEY, Lecteur en Sciences de la Séparation à la Faculté des Sciences Appliquées, Université de l'Ouest de l'Angleterre, et M. Jacques CROMMEN, Professeur au Laboratoire d'Analyse des Médicaments, Université de Liège, m'ont fait le grand honneur de relire ce travailler et être rapporteurs.

Liste des publications

Introduction

Nous nous sommes également intéressés aux caractéristiques qui évoluent lors de la dégradation d'une colonne dans des conditions réelles de test. Pour permettre des comparaisons visuelles des colonnes, la dernière étape du développement de notre procédure de caractérisation implique la construction de cartes d'identité.

Partie A : Synthèse bibliographique et problématique

Les phases stationnaires greffées apolaires et l’analyse de solutés basiques

A Introduction

B La matrice de silice

Pour mieux comprendre la complexité de cette surface, nous détaillerons les propriétés générales de ce matériau en suivant le cheminement de la figure I-1. Dans un premier temps, nous nous concentrerons sur les caractéristiques locales de la silice à l'échelle de quelques atomes (< 1 nm), puis nous décrirons les propriétés supplémentaires qu'entraîne l'organisation du matériau dans différents ordres de grandeur, que ce soit à l'échelle des pores ou particule (quelques micromètres).

B.1.a Nature de la surface et chimie des silanols

En pratique, tout dépend de la valeur du point de neutralité et des constantes de réaction. Les caractéristiques de cette répartition dépendent de la nature de la silice, et donc de sa synthèse.

B.1.b Géométrie et énergie de surface

D'un point de vue chromatographique, ce dernier point constitue clairement une limitation de l'utilisation de la silice pour l'analyse de composés basiques, souvent rencontrés en milieu pharmaceutique. Pour cela, il peut être souhaitable d'augmenter le pH de la phase aqueuse, au-delà de 9, ce qui provoque une dissolution du support.

B.1.c Structure des pores

Phases stationnaires greffées apolaires et analyse des solutés basiques De la disposition de ces noyaux partent. Comme l'illustre la figure I-5, la topologie de la silice amorphe poreuse est extrêmement complexe ; Certains travaux de synthèse apportent cependant des éclaircissements.

B.1.d Propriétés physiques : morphologie, taille et distribution des particules

Un écart important conduit donc à une dégradation des performances de la colonne, et nous visons donc à obtenir des écarts aussi étroits que possible. Cette section se concentrera donc sur le procédé sol-gel, qui a sans doute révolutionné la synthèse de la silice.

B.2.a Procédure générale du sol-gel

Augmentation de la perte de charge due aux petites particules, provoquant un tassement du lit, associé à la création de volumes morts et de chemins préférentiels. Les propriétés géométriques et thermodynamiques dépendent du processus de synthèse du matériau [37]. L’objectif de la section suivante est d’illustrer les résultats de différentes voies d’obtention de silice, toutes issues du procédé sol-gel.

B.2.b Procédures dérivées du sol-gel

Le séchage par pulvérisation, qui consiste à pulvériser le gel suivi de son séchage. Dispersion mécanique du gel (ou suspension colloïdale), suivie d'une émulsion et d'une extraction de l'eau résiduelle (« émulsion huileuse ».

B.2.b.i Silice particulaire

Le groupe méthyle est présent non seulement dans la structure interne, mais également à la surface de la particule. Cette approche diffère de la procédure sol-gel classique, car l'hydrogel n'est pas obtenu par gélification mais par coacervation4.

B.2.b.ii Synthèse de monolithes macroporeux

Ce PES, émulsionné avec un mélange hydroalcoolique, précipite sous forme de billes solides d'hydrogel de silice lors de l'ajout du catalyseur. Au niveau de la synthèse, la séparation des voies particulaire et monolithique a lieu lors de la formation du gel, lors de la séparation des phases : la voie monolithique dépend de la décomposition spinodale, qui se caractérise par de petites fluctuations de la composition à grande distance, tandis qu'une le processus de nucléation classique est caractérisé par de grandes variations de composition sur de petites distances.

C Les silices greffées apolaires

Phases stationnaires greffées apolaires et analyse des solutés basiques. Figure I-10 : Images MEB a) de la structure poreuse typique d'un monolithe de silice, b) d'un macropore et c) de la structure mésoporeuse du squelette de silice [73]. La création de ce pont est réalisée par l'action d'un groupe partant X d'un silane quadri-substitué sur un groupe silanol du gel de silice, comme illustré sur la figure I-11.

C.1.b Les différents types de greffon

Le greffage consiste à remplacer le groupe silanol par un groupe alkyle, ce qui confère à la phase stationnaire un caractère hydrophobe. Plus confidentiellement, les phases greffées cholestéryle [82-84], n-alkylfluorényl [85, 86], imidénaphtalène [87], calixarène [88], phtalocyanine ou fullerène, revues dans la synthèse Saito [84], sont destinées à des applications très spécifiques. .

C.1.c Les différents types de greffage

Phases stationnaires greffées apolaires et analyse des solutés basiques. Figure I-13 : Exemples de phases greffées a) phényle, b) fluorées et c) cyano. Enfin, les greffons se différencient par la longueur de la chaîne alkyle principale et l'intégration éventuelle d'hétéroatomes ou de cycles.

C.1.c.i Greffage monomérique

Pour des raisons d'encombrement stérique8, le taux de greffage ne dépasse jamais à peine 50%9 des groupements silanol accessibles en surface. La figure I-16 présente deux exemples contrastés de conformations, en considérant un taux de greffage typique d'un octadécylsilane. un B).

C.1.c.ii Greffage polymérique

En effet, la figure I-20 montre que pour un taux de greffage globalement similaire, la densité de greffage varie localement : alors que la polymérisation en solution permet d'obtenir un greffage homogène, la polymérisation en surface se distingue par de fortes variations locales de densité de greffage. Ces variations locales de densité de chaîne entraînent des différences dans les conformations des chaînes alkyles selon l'approche choisie pour la polymérisation.

C.1.c.iii Greffage oligomérique

Contrairement à la polymérisation verticale, cette voie repose sur une polymérisation contrôlée qui s'effectue uniquement à la surface de la silice, préalablement hydratée avec une monocouche d'eau [93, 94]. L'utilisation d'un pH suffisamment élevé pour la phase mobile, pour supprimer l'ionisation des composés basiques, avec le risque de se retrouver confronté à des problèmes de stabilité de la phase stationnaire - la silice se dissout à pH alcalin - et des solutés à analyser - certains produits se dégradent rapidement en un environnement alcalin.

C.2.b Stabilité des phases greffées

Silices traditionnelles de type A contenant des niveaux élevés d'impuretés métalliques (valeurs typiques : 1000 ppm de sodium, 200 ppm d'aluminium et 150 ppm de fer). Dans les silices ultra pures de type B, une technologie plus récente, leur niveau total descend à moins de 20 ppm.

C.2.b.i Stabilité en pH

La différence entre ces deux types de silice se retrouve dans les mesures de pKa des silanols des silices vierges ou greffées. Outre la présence de plusieurs classes de silanols se distinguant par des acidités différentes, les silices de type A s'avèrent toujours plus acides que leurs homologues. . Type B. Les phases stationnaires consacrées à l'analyse des composés basiques comportent toutes des silices de type B [109], nous nous limiterons donc à cette dernière catégorie dans nos travaux.

C.2.b.ii Facteurs supplémentaires

D De l’origine de la diversité des phases : réduction de l’accès aux silanols résiduels et extension de la gamme de polarité

D.2.a Recouvrement terminal

Ces problèmes expliquent également le retard de développement de ce type de « contrainte finale » par rapport à leurs homologues apolaires. La plupart des phases stationnaires destinées aux applications pharmaceutiques ont subi au moins un end-coiffage.

D.2.b Densité de greffage

Cependant, l'efficacité du traitement de coiffage final n'est jamais totale : en raison d'un obstacle stérique, le coiffage ne peut pas être parfait. Il est cependant possible de modifier la surface avec des greffons qui possèdent à leur extrémité une fonction polaire (de type hydroxyle ou thiol par exemple) : le « end cap » sera alors caractérisé par son caractère polaire.

D.2.c Encapsulation

Le greffon polaire est plus volumineux car il nécessite une chaîne C3 pour éloigner suffisamment la fonction polaire de la surface, réduisant ainsi l'efficacité du coiffage. L'encapsulation du polymère présente donc un intérêt particulier : la phase obtenue bénéficie à la fois de la résistance mécanique de la silice et de l'extension du domaine de stabilité du pH conféré par le polymère.

D.2.d Support de silice hybride

Les phases polymères poreuses ont une plage de stabilité de pH plus large que les phases à base de silice. De plus, le polymère rend inaccessibles les silanols présents à la surface de la matrice n'ayant pas réagi, sous réserve d'une parfaite encapsulation de la particule.

D.3.a Protection stérique

A pH acide, la fragilité de la phase stationnaire est due à l'accessibilité du pont siloxane, qui peut être réduite par la base volumineuse [97]. Surtout, il confère au greffon un pouvoir couvrant suffisant en termes de silanols accessibles pour envisager une utilisation à long terme13 de la phase stationnaire à pH élevé (jusqu'à pH 11) [119].

D.3.b Barrière polaire

D.3.b.i Groupement polaire intercalé

Phases stationnaires greffées apolaires et analyse des solutés basiques. Son greffage est réalisé au moyen de deux liaisons covalentes, ce qui permet de réduire plus efficacement le nombre de silanols résiduels qu'avec un greffon monofonctionnel encombré. Les différences localisées dans la nature du groupe polaire intercalé ne font qu'augmenter encore la diversité des phases stationnaires.

D.3.b.ii Modification de surface

Ainsi, les phases stationnaires sont pour la plupart dotées d'un « end-capping », qu'elles aient des greffons purement alkyles ou qu'elles contiennent un groupe polaire intercalé. L'hybridation est toujours en évolution et continuera d'augmenter la diversité des phases stationnaires.

E Conclusion

Très souvent, les phases stationnaires combinent plusieurs stratégies pour optimiser leur protection contre les silanols résiduels et/ou l'hydrolyse de leurs greffons. Cas du end-capping (XTerra MS).

Pourquoi une classification fondée sur une caractérisation ciblée ?

• A Introduction
• B Les tests spectroscopiques
• C Les tests chromatographiques
• C.1.a Modèle thermodynamique
• C.1.b Modèles de rétention
• C.2.a Catégories de tests
• C.2.a.i Tests fondateurs
• C.2.a.ii Tests utilisant uniquement des composés basiques
• C.2.b Propriétés des réponses
• C.2.b.i Hydrophobie
• C.2.b.ii Activité des silanols résiduels
• C.2.b.iii Cations métalliques
• C.2.c Classifications associées aux tests
• D Conclusion

La chromatographie de rétention est souvent utilisée pour déterminer l'enthalpie et l'entropie du transfert de soluté de la phase mobile vers la phase stationnaire. À notre avis, il s’agit de la seule approche simple et réalisable pour la caractérisation des colonnes.

L’apport de la chimiométrie à la classification des colonnes chromatographiques

• A Analyse de corrélation
• B Analyse en Composantes Principales
• C Analyse en Clusters
• D Couplages ACP-AHC
• E Conclusion

La contribution de la chimiométrie à la classification des descripteurs de colonnes chromatographiques présente un degré modéré de corrélation26. L'apport de la chimiométrie à la classification des colonnes chromatographiques. L’analyse typologique consiste à regrouper les individus en groupes selon un critère de similarité sij =100× −(1 dij dmax), où dij désigne la distance entre deux points et dmax, la distance maximale observée entre deux points. deux points [265].

Partie B : Développement du test

Grâce à l'étude de stabilité, nous connaîtrons la résistance du test proche des conditions nominales. A l'issue des étapes 3 et 4, des tolérances expérimentales acceptables seront définies en termes de conditions chromatographiques et de degré d'investigation souhaité.

Méthanol et acétonitrile : deux modificateurs non interchangeables

• A Introduction
• B Effet sur la force isoéluante
• C Effet sur les phases stationnaires
• C.1.b Conditions chromatographiques
• C.1.c Colonnes étudiées
• C.2.a Traitement des données par ANOVA
• C.2.b Résultats sur les composés neutres C.2.b.i Propriétés de rétention
• C.2.b.ii Asymétries de pic
• C.2.c Résultats sur les composés basiques C.2.c.i Facteurs de rétention
• C.2.c.ii Asymétries de pic
• D Conclusion

Contrairement à la sélectivité en méthylène (α1-3) qui reste quasiment constante quelle que soit la colonne testée ou le solvant utilisé, la sélectivité de forme (α2-4) apparaît extrêmement sensible à la nature de la phase stationnaire. La figure IV-7 montre des résultats sur les facteurs de rétention des solutés basiques extrêmement dépendants de la colonne considérée.

Construction du test : d’un test étendu à un test réduit pertinent

• A Introduction et principe
• B Partie expérimentale
• B.3.b Préparation des phases mobiles
• B.3.c Conditions d’injection
• C Traitement des données
• D Résultats et discussion
• D.1.a Facteurs de rétention
• D.1.b Asymétries de pic
• D.2.a Principe et méthodologie
• D.2.b Réduction du nombre de niveaux de pH
• D.2.b.i Facteurs de rétention
• D.2.b.ii Asymétries de pic
• D.2.c Réduction du nombre de niveaux de fraction en solvant
• D.2.c.i Facteurs de rétention
• D.2.c.ii Asymétries de pic
• E Conclusion

La figure V-9, basée sur les facteurs de rétention de la clofazimine et de l'amiodarone, illustre parfaitement ce point. Le « score plot » CP1-CP2 des asymétries retranscrit environ 50 % de l'information initiale, contre 80 % pour celle des facteurs de rétention.

Pouvoir discriminant du test : étude de la variabilité interlot

• A Introduction
• B Partie expérimentale
• C Traitement des données
• D Résultats et discussion
• D.1.b Niveau 2
• D.1.c Niveaux 3 et 4
• E Conclusion

Sauf dans le cas de Luna C18 (2), la variabilité intra-lot est généralement inférieure à la variabilité inter-lot en termes de facteurs de rétention. Cependant, cette estimation globale fournit une évaluation unique de l’étalement inter-lots propre à chaque phase stationnaire.

Etude de robustesse : domaine d’application

• A Introduction
• B Plan d’expériences utilisé
• C Réalisation expérimentale
• D Principe de l’exploitation
• D.3.b Détermination de la répétabilité du test
• D.3.c Comparaison Interlot/Répétabilité du test
• D.3.d Visualisation du domaine robuste
• E Résultats et discussion
• E.2.a Haute teneur en modificateur organique
• E.2.b Basse teneur en modificateur organique
• E.3.a Mise en évidence du vieillissement
• E.3.b Comparaison variabilité interlot/répétabilité du test
• E.3.c Construction du domaine de robustesse
• F Conclusion

Éq. VII-1) en fonction de la teneur en modificateurs organiques et des propriétés physico-chimiques des substances dissoutes. Deux facteurs sont systématiquement mis en avant : la teneur en modificateurs organiques et la température.

Partie C : Applications

Extension de la base de données

A Introduction

B Conditions expérimentales

Elargissement de la base de données Pour plus de lisibilité et d'homogénéité en termes de classifications, nous avons utilisé les conventions d'abréviation utilisées au chapitre V. La première lettre correspondant à l'initiale associée à la nature de la phase : Traduisait-elle la présence d'un type Aqua, C , celui d'un greffon purement hydrocarboné, P, celui d'un groupe polaire intercalé, et E indique une encapsulation polymère ; 2.

C Préliminaires à l’exploitation : étude de la rétentivité moyenne des solutés

La benzylamine ayant un facteur de rétention systématiquement inférieur à 1, elle est définitivement exclue de l'essai. D'autres composés susceptibles d'être éliminés sont la digitoxine et la vancomycine en raison de leur faible facteur de rétention.

D Résultats et discussion

A noter que les rapports chromatographiques se révèlent remarquablement isoéluants pour le pentylbenzène et plus encore pour le butylbenzène, composés sur lesquels nous avons basé notre définition du rapport d'isoélution, en la validant a posteriori.

D.2.a Analyse en Composantes Principales à haut niveau de solvant D.2.a.i Description générale de la classification

D'après le CP2, on observe une répartition du classement selon le solvant testé, toutes les colonnes testées en acétonitrile sont situées en partie haute du plan, et celles évaluées en méthanol, en partie basse. Pour cela, il faudra compléter l’étude par l’examen des « plots de chargement », qui permettront également d’évoquer l’éventuel rejet de la digitoxine.

D.2.a.ii Interprétation des « loading plots » correspondants

L'expansion de la base de données confirme le mécanisme mixte d'une telle rétention de soluté. À première vue, CP2 semble être construit à partir de la projection des facteurs de rétention des sondes de base, tandis que CP3 semble être basé principalement sur la digitoxine.

D.2.a.iii Classifications interprétées

L'interprétation physico-chimique explique également la répartition du classement selon CP2 en fonction de la nature du solvant. Etendre la base de données notamment d'un solvant à un autre, en tenant compte des autorisations relatives du même ordre de grandeur.

D.2.a.iv Vérification chromatographique de l’interprétation

Considérons d'abord le cas de la vancomycine dans le diagramme de chargement présenté sur la figure VIII-7. Contrairement au cas de la digitoxine (voir Figure VIII-2), le facteur de rétention de la vancomycine est très proche de celui de l'ampicilline au niveau CP1-CP2.

D.2.b.ii Classification interprétée

Cependant, on peut raisonnablement considérer que les effets masquants de la phase mobile seront plus prononcés avec le mélange à base de méthanol (plus proche du milieu purement aqueux en termes de liaisons H) qu'avec celui contenant de l'acétonitrile. L'ordre des clusters observé selon CP1 respecte un désordre croissant de la structure locale de la phase stationnaire.

D.2.b.iii Vérification chromatographique de l’interprétation

Partant du principe qu'en présence d'un mécanisme de rétention mixte55 et de manière analogue aux composés basiques, la rétention est toujours associée à l'asymétrie maximale observée, le facteur de rétention caféine peut donc constituer une mesure de l'hétérogénéité énergétique de la phase, de l'ordre de ce qui est forcément plus perturbé à faible teneur qu'à forte teneur en solvants organiques. Soumis au comportement d'autres solutés polaires semblables à la caféine, ce qui peut déjà être suggéré dans le cas du phénol, CP1 peut ainsi être associé à une mesure de désordre, c'est-à-dire à l'entropie de l'ensemble.

D.2.c Synthèse et interprétation thermodynamique des classifications

Expansion de la base de données Les dendrogrammes ont été divisés à des niveaux de similarité équivalents (ligne pointillée), conduisant à chaque fois à 23 groupes. Résultant de la projection de CP3A56 sur le plan CP1A-CP2A, le chevauchement de certains groupes dans la classification haut niveau du solvant reflète l'apport discriminant de CP3A, améliorant ainsi l'analyse cluster.

D.3.a Les phases classiques C8 et C18

Néanmoins, il convient de noter que les paires dont la position relative initiale est significativement modifiée à haut niveau de solvant correspondent à des phases non endcapped, telles que StableBond C8 (C8_5) et Uptisphere NEC (C18_9). Cette diversité semble d'autant plus grande qu'elle semble également dépendre de la teneur en solvant.

D.3.b Les phases à groupement polaire intercalé

Au final, la Figure VIII-16 et la Figure VIII-17 illustrent une grande diversité de comportements chromatographiques pour des colonnes dites « classiques ». La phase dont la nature du groupe polaire est inconnue Polaris C18-A (P18_3) s'avère avoir un comportement proche de Polaris C18-Ether (P18_5), avec le groupe éther, pour toutes les fractions de solvant et comme le confirme la figure VIII-19. .

D.3.c Influence des traitements de surface

Les phases Non-end-capping et Aqua font l'objet d'une identification séparée pour une meilleure lisibilité. Par conséquent, l'absence de « couverture finale » affecte d'autant plus le comportement chromatographique puisque la teneur en solvant organique est faible.

D.3.c.ii Influence du traitement type Aqua

D.3.d Effet de la base du greffon

La phase méthanolique peut s'avérer très proche de la phase purement aqueuse, auquel cas la phase stationnaire est moins dissoute qu'avec une phase acétonitrile ; 2. Ainsi, la position de CapellPak dans les classifications, à hauts et bas niveaux de solvants, toujours proches des phases à groupes polaires entrelacés, indique probablement un effet stabilisant de l'encapsulation de la base de greffage.

D.3.e Etude du phénomène de vieillissement

De plus, la caféine voit également son temps de rétention augmenter, dans une moindre mesure, signifiant un léger changement de l'état de surface qui perturbe la structure de la phase stationnaire. Ce phénomène souligne une fois de plus l'importance de la nature du solvant et de sa fraction dans la phase mobile pour le test, mais aussi pour le développement des méthodes chromatographiques.

E Conclusion

Construction des cartes d’identité : aide au choix raisonné des colonnes chromatographiques

• A Introduction
• B Sélection des descripteurs
• B.2.a Etude globale
• B.2.b Etude par familles de phases stationnaires
• C Caractérisation des supports
• C.2.b Influence du vieillissement
• C.3.a.i Présence du groupement polaire intercalé
• C.3.a.ii Nature du groupement polaire intercalé
• C.3.b.ii Nature du « end-capping »
• C.3.b.iii Influence de la nature du groupement polaire
• C.3.b.iv Encapsulation
• D Du choix raisonné des colonnes chromatographiques
• E Conclusion

En raison de leur diversité, les niveaux de corrélation dépendent de la nature des phases stationnaires. La figure IX-3 représente les diagrammes obtenus pour les phases stationnaires de l'étude de dispersion inter-lots (Chapitre VI).

Conclusion générale