Extraction d’ADN à partir de coprolithes

Pour chaque extraction, environ 1 g de coprolithe a été extrait du cœur de l’échantillon afin d’éviter toute contamination externe.

Le morceau a été réduit en poudre grâce au Mikro-dismembrator (Sartorius), en agitant 1 à 2 min à une fréquence 3000 battements par minute. La poudre obtenue a été incubée à 42°C pendant une nuit, dans 10 ml de tampon d’extraction. L’échantillon a ensuite été centrifugé à 1000 g, pendant 5 min. Trois extractions successives ont été réalisées, la première avec un volume de phénol, la seconde avec 0,5 volume de phénol et 0,5 volume de dichlorométhane et la dernière avec un volume de dichlorométhane.

Le surnageant purifié a été concentré par centrifugation sur une colonne Centricon YM30, afin d’aboutir à un volume final de 200 µl. Un blanc d’extraction a systématiquement été traité en parallèle afin de tracer les contaminations pouvant se produire lors de cette phase.

2.1.1. Rôle de l’EDTA

2.1.1.1. Matériels et Méthodes

Deux échantillons, CC1 et CC3, ont été extraits avec deux tampons d’extraction différents. Le premier tampon, qui contient peu d’EDTA, inspiré de celui utilisé pour extraire l’ADN de

coprolithes de paresseux (Hofreiter et al., 2000). Le second tampon est identique à celui utilisé pour extraire l’ADN des os (Bon et al. 2008) et est très riche en EDTA (Tableau 3).

Les deux tampons ont été testés avec ou sans N-PTB (cf. infra).

Tampon 1 Tampon 2

NaCl (mM) 100 0

Tris-Hl pH 8 (mM) 100 10

EDTA (mM) 25 450

SDS (%) 0,5 0,1

DTT (mM) 50 65

protéinase K

(mg/ml) 0,5 0,5

Tableau 3 : Composition des deux tampons d’extraction utilisés.

Les différents extraits ont ensuite été traités comme décrit précédemment (Bon et al., 2008).

Une amplification par PCR a été effectuée, avec une paire d’amorces permettant d’amplifier 84 pb du gène Cytochrome b d’hyène des cavernes (Rohland et al., 2005). De 0,5% à 0,05%

d’extrait ont été utilisés pour les amplifications.

2.1.1.2. Résultats et discussion

Les extraits traités avec le tampon 1 n’ont permis aucune amplification par PCR, quelle que soit la quantité d’extrait utilisée. En revanche, les extraits effectués avec le tampon 2, riche en EDTA, ont permis une amplification, même en utilisant une très petite quantité d’extrait et jusqu’à la quantité maximale utilisée. Le meilleur alignement de séquences amplifiées sur la banque de données GenBank nt par BLAST est obtenu avec l’hyène des cavernes.

Ces coprolithes proviennent donc vraisemblablement d’hyène des cavernes, un carnivore qui ingère les os de ses proies, et dont les fécès sont très riches en calcium. Le calcium, qui favorise la fossilisation, est un obstacle à l’extraction d’ADN. Par conséquent, un tampon d’extraction riche en EDTA est nécessaire.

2.1.2. Rôle du N-PTB

Les coprolithes de paresseux contiennent beaucoup de produits de Maillard (Poinar et al., 1998). Pour parvenir à extraire de l’ADN amplifiable, il est nécessaire de traiter ces

échantillons avec du N-PTB, une molécule connue pour cliver les liaisons entre les sucres et les protéines.

Afin de tester si cette molécule est nécessaire également à l’extraction d’ADN de coprolithes de carnivores, nous avons extrait l’ADN des échantillons CC2, CC3 et CC4 en présence et en absence de N-PTB.

2.1.2.1. Matériels et Méthodes

Les extractions ont été effectuées avec le tampon 2 décrit précédemment, en présence ou en absence de 10 mM de N-PTB, dissous dans du Phospate de Sodium. Le reste de l’extraction, et l’amplification, ont été faits comme décrit (Bon et al., 2008). Les seules différences résident dans le nombre de cycles de PCR (33) et dans les amorces utilisées (identiques à celle utilisées en 2.1.1.1.).

2.1.2.2. Résultats

Pour tous les échantillons, les extraits ont permis l’amplification d’ADN, que l’extraction ait été faite en présence ou en absence de N-PTB (Figure 27).

Figure 27 : Gel d’électrophorèse montrant les fragments d’ADN amplifiés par PCR, à partir des extractions effectuées sur l’échantillon CC2, en absence (à gauche) ou en présence (à droite) de N-PTB. La quantité d’extrait déposé varie de 0,005% à 0,05% de l’extrait total. Les amorces permettent d’amplifier un fragment de 84 pb du gène mitochondrial du Cytochrome b de l’hyène des cavernes ; trente-trois cycles de PCR ont été effectués.

L’amplification est possible dès les plus petites quantités d’extrait (0,005%) et ne présente pas d’inhibition lorsqu’une quantité plus importante d’extrait est utilisée. Par conséquent, la suite

des analyses a été faite avec des extraits obtenus sans N-PTB, pour limiter les risques de contamination par les réactifs.

2.1.2.3. Discussion

Contrairement à ce qui avait été suggéré dans (Poinar et al., 1998), l’extraction d’ADN de coprolithes ne nécessite pas forcément l’ajout de N-PTB. Les coprolithes d’hyène des cavernes peuvent fournir de l’ADN, que l’extraction ait eu lieu ou non en présence de ce composé. Il semble donc que ces échantillons soient moins touchés que les coprolithes de paresseux par la réaction de Maillard.

2.1.3. Conclusion

Ces premières analyses reposant sur l’amplification d’un fragment du Cytochrome b plaident en faveur de l’attribution des coprolithes à l’hyène des cavernes. Ces échantillons sont très riches en ADN, car des amplifications sont possibles en utilisant de très faibles quantités d’extrait. Les coprolithes contiennent peu d’inhibiteurs, ce qui permet d’obtenir des amplifications en utilisant une quantité d’extrait variant sur deux ordres de grandeur. En revanche, ils sont très riches en carbonate et phosphate de calcium. Si le calcium participe probablement à l’excellente conservation du matériel génétique de ces échantillons, il rend nécessaire l’ajout d’EDTA pour solubiliser et extraire l’ADN.

Contrairement aux coprolithes de paresseux, l’utilisation de N-PTB n’est pas nécessaire à la bonne extraction du matériel génétique.

Les conditions d’extraction de l’ADN de coprolithes dépendent donc fortement de l’espèce productrice et vraisemblablement de la nature de son alimentation. Un régime riche en os induit une plus forte concentration en calcium, tandis que les coprolithes de paresseux présentent plus de produits de la réaction de Maillard.