Chapitre IV Réactivité des complexes avec l’ADN
IV.4. Interaction du complexe métallique (Pt) avec l’ADN en structure
Il apparaît que la relaxation du plasmide a lieu quelque soit la nature du métal (platine, ligne 6 ou palladium, ligne 7) ou du ligand (direct, ligne 6 ou inverse, ligne 8) et ceci, de façon similaire à l‟action du cisplatine.
Pour aller plus loin dans la démarche de compréhension, nous avons essayé de déterminer le type d‟adduits formés avec l‟ADN grâce à l‟utilisation d‟un oligonucléotide de séquence connue.
IV.4. Interaction du complexe métallique (Pt) avec l’ADN en
Figure 111. Réaction du dérivé diaqua du cisplatine avec l’hairpin.185
Figure 112. Chromatogramme HPLC du mélange réactionnel issu de l’action du dérivé diaqua du cisplatine avec l’hairpin. D : hairpin libre, I5’, I3’, IG : monoadduit respectivement sur G1, G2 et G3, Cintra : chelation intrabrin, Cinter : pontage interbrins.185
Les sites de fixation et les intermédiaires ont été identifiés après une digestion enzymatique des produits et une analyse par spectrométrie de masse des fragments ou par la méthode de séquençage de Maxam-Gilbert.187
IV.4.2 Interaction du complexe de platine 1 avec l’hairpin
Nous nous sommes concentrés sur la réactivité du complexe platiné 1 avec l‟hairpin par comparaison avec le cisplatine. La figure 113 présente le mode opératoire mis en place. Nous nous sommes basés sur une stœchiométrie 1:1 platine/hairpin afin de faciliter la détermination de la proportion des différents adduits. Les concentrations utilisées pour les complexes de platine sont en accord avec celles décrites dans les expériences de Kozelka (10-4M).
H3N Pt NH3 Cl Cl
ADN Hairpin Adduits ??
24h, TA, obscurité NaClO4(10mM), H2O
concentrations nombre de moles Hairpin 1,72 .10-4 M 1,72 nmoles Cisplatine 2,00 .10-4 M 2,00 nmoles
Figure 113. Conditions utilisées pour la réaction du cisplatine avec l’hairpin.
Pour le complexe 1, la réaction se déroule en présence de 1% de DMF, pour des raisons de solubilité. Les échantillons ont ensuite été analysés par HPLC analytique (colonne nucleosil C8, phase mobile TEAA (acétate de triéthylammonium) 20 mM + NH4Cl 1M, gradient acétonitrile 10-20%). Les figures 114 et 115 présentent respectivement les chromatogrammes obtenus pour le cisplatine et le complexe 1.
Les échantillons ont également été analysés par HPLC couplée à la spectrométrie de masse, ce qui nous a permis de vérifier la nature des adduits (simple ou double adduit).
25 50 75
120 hairpinKOzl #38 HP cispt 10-4M perchlo UV_VIS_2
mAU
1 - 0,1692 - 0,6413 - 0,7725 - 0,947
WVL:250 nm
1
2
3 1: Hairpin
2: mono-adduit 3: di-adduit
25 50 75
120 hairpinKOzl #38 HP cispt 10-4M perchlo UV_VIS_2
mAU
1 - 0,1692 - 0,6413 - 0,7725 - 0,947
WVL:250 nm
1
2
3 1: Hairpin
2: mono-adduit 3: di-adduit
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 55,0 -50
0 100 200
300 hairpinKOzl #37 HP ac-I-42 10-4m perchlo UV_VIS_2
mAU
min 1 - Peak 1 - 0,0372 - 0,4613 - 0,772
4 - 0,850 5 - 0,9536 - 1,060
WVL:250 nm
1
2
1: Hairpin 2: mono-adduit
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 55,0
-50 0 100 200
300 hairpinKOzl #37 HP ac-I-42 10-4m perchlo UV_VIS_2
mAU
min 1 - Peak 1 - 0,0372 - 0,4613 - 0,772
4 - 0,850 5 - 0,9536 - 1,060
WVL:250 nm
1
2
1: Hairpin 2: mono-adduit
Figure 115. Chromatogramme du mélange des adduits formés entre le complexe de platine (1) et l’hairpin.
Pour la réaction entre le cisplatine et l‟hairpin, nous observons sur le chromatogramme HPLC la présence de trois produits. Le premier pic correspond à l‟hairpin seule (même temps de rétention). En spectrométrie de masse, les fonctions phosphates sont partiellement protonées pour donner un signal associé à une espèce trianionique (masse d‟un hairpin : 6094 daltons, m/3 = 2031,3). Le second pic correspond à un mono-adduit du platine. Il se caractérise par un signal d‟une espèce trianionique à m/3 = 2119,6 ce qui correspond à l‟addition de [Pt(NH3)2Cl]+ sur l‟hairpin (m = 6358,6 daltons). Le troisième pic, obtenu majoritairement, correspond à l‟addition de [Pt(NH3)2]2+ sur l‟hairpin (m = 6323,1 daltons), caractérisé en spectrométrie masse par un signal m/3 = 2107,6.
Dans le cas du complexe 1, mis à part l‟hairpin de départ, un seul produit est détecté. En spectrométrie de masse il se caractérise par un signal à m/3 = 2171,3 conforme à l‟addition de [Pt(triazole)Cl]+ sur l‟hairpin (m= 6515,8 daltons). Dans ces conditions réactionnelles, d‟une manière générale peu d‟adduits sont formés par rapport à la quantité d‟hairpin de départ. Le cisplatine forme majoritairement du di-adduit, tandis que le complexe 1 ne forme qu‟une petite quantité de mono-adduit.
Pour essayer de mieux comprendre les résultats obtenus, nous avons décidé de travailler directement avec les dérivés aqua des complexes de platine connus pour être plus réactifs.
Pour cela, les complexes aqua du cisplatine et du complexe 1 ont été obtenus en utilisant le nitrate d‟argent comme décrit précédemment. Les complexes aqua ont été mis en réaction dans l‟eau directement avec l‟hairpin dans les mêmes conditions réactionnelles que celles
présentées dans la figure 113. Les échantillons ont été analysés par HPLC analytique (Figures 116 et 117) et la nature des adduits a été vérifiée par spectrométrie de masse.
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0
-50 0 100 200
300 hp janv 2010 #39 aqua cispt UV_VIS_2
mAU
min 1 - Peak 1 - 0,0212 - 0,547
3 - 0,890 4 - 0,970
WVL:260 nm
1 2
3
1: Hairpin 2: mono-adduit 3: di-adduit
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0
-50 0 100 200
300 hp janv 2010 #39 aqua cispt UV_VIS_2
mAU
min 1 - Peak 1 - 0,0212 - 0,547
3 - 0,890 4 - 0,970
WVL:260 nm
1 2
3
1: Hairpin 2: mono-adduit 3: di-adduit
Figure 116. Chromatogramme du mélange des adduits formés entre le dérivé diaqua du cisplatine et l’hairpin.
Grâce à l‟utilisation du complexe aqua, la quantité totale d‟adduits formée est supérieure à celle obtenue avec le cisplatine. Les proportions des adduits formés sont changées (comparaison figures 114 et 116). On constate que le di-adduit semble être favorisé et que la quantité de mono-adduit est diminuée.
-40 0 50 100
140 hp janv 2010 #24 hp +aqua 42 1eq UV_VIS_1
mAU
min 1 - Peak 1 - 0,0372 - 0,5423 - 0,7014 - 0,734
5 - 0,879 6 - 0,959
WVL:250 nm
1
1: Hairpin
-40 0 50 100
140 hp janv 2010 #24 hp +aqua 42 1eq UV_VIS_1
mAU
min 1 - Peak 1 - 0,0372 - 0,5423 - 0,7014 - 0,734
5 - 0,879 6 - 0,959
WVL:250 nm
1
1: Hairpin
Dans le cas du complexe aqua de 1, la quantité d‟hairpin restante est très inférieure à celle obtenue avec le complexe 1, mais de multiples produits sont formés (comparaison figure 115 et 117). Les conditions HPLC utilisées avant l‟introduction dans le spectromètre de masse ne nous ont pas permis de séparer les différents produits, leurs identifications n‟ont donc pu être réalisées.