3.2 Discussion
3.2.3 Interprétations
Plateau B-S, étirement
En conditions de sels et de pH données, et quelle que soit la vitesse de l'étirement, le plateau B-S se manifeste toujours pour la même force. C'est donc un processus à l'équilibre, la molécule répond immédiatement à la contrainte imposée. Les deux modèles proposés précédemment satisfont cette condition.
Plateau B-S, relaxation
L'hystéresis constaté lors de la relaxation est par contre plus dicile à interpréter dans le cadre d'un modèle où seul l'agencement interne de la molécule est aecté par l'étire- ment alors que les bases restent appariées [163]. La nature des processus de changement de structure étant la même pendant l'extension que pendant la relaxation, la molécule devrait encore répondre immédiatement (à l'échelle des temps du laboratoire) et qua- siment aussi rapidement que pendant l'extension. Nous ne devrions donc pas observer d'hystérésis. C'est eectivement le cas dans les expériences d'étirements où la molécule est contrainte en torsion. Dans ce cas un plateau est observé à 110 pN mais aucun à 65 pN. Les résultats [90][37][29] ainsi que des considérations théoriques [90][126] suggèrent d'ailleurs un diagramme des structures de l'ADN en fonction des paramètres couple et torsion, mais valable pour un ADN ayant ses deux extrémité xées par les deux brins.
Si nous avons aaire à une transition impliquant un désappariement partiel, les do- maines désappariés lors de la phase d'extension doivent ensuite se réapparier de façon correcte lors de la phase de relaxation : la molécule ne répond pas à la même vitesse que pour le processus de désappariement : il lui faut plus de temps pour explorer et trouver la conformation la plus stable en ADN B. C'est pour cette raison que le passage S→B se fait à une force plus faible qu'à l'étirement.
Plateau B-S et séquence d'ADN
La séquence joue elle aussi un rôle important, comme l'ont montré les expériences d'étirements de molécule avec un AFM [119][37]. Tout d'abord le plateau B-S se manifeste à des forces seuil diérentes selon que l'on tire sur un ADN poly(dA-dT) ou un ADN poly(dC-dG) : 35 pN pour le poly(dA-dT) contre 65 pN pour le poly(dC-dG).
Pour un poly(dA-dT) la deuxième phase (après le plateau B-S), interprétée comme une phase d'éloignement des simples brins dans le modèle de Williams & al., n'apparait pas.
Celle-ci existe en revanche pour un poly(dC-dG) [37] et est sensible au taux de charge, ce qui fait penser à un phénomène hors-équilibre. D'autres expériences indiquent qu'au delà du plateau B-S, les simples brins ont tendance à se séparer [119]. Avec des constructions d'ADN particulières de poly(dC-dG) ou de poly(dA-dT), Rief & al. ont mis en évidence la formation de structures en épingle à cheveux dues à l'appariement d'un brin d'ADN avec lui même [119] (Fig 3.11).
Ceci se produit lorsque la molécule est étirée une première fois au-delà du plateau B-S : les brins commencent à se désapparier. En relaxant la molécule, les deux brins ne s'apparient pas immédiatement complétement et sont piégés dans un état intermédiaire constitué par des appariements des brins avec eux mêmes, (Fig 3.11). Avec l'étirement suivant, ce sont ces structures qui sont détruites. Très semblables à des expériences de dégrafage d'ADN [51] ou d'ARN [94][64], les forces ainsi déterminées pour dégrafer un
et 20 pN selon la séquence et après un premier étirement jusqu'à la phase S. Extrait de [119].
assemblage poly(dA-dT) ou poly(dC-dG) sont aussi cohérentes avec les résultats connus (respectivement ' 9 pN et 20 pN).
Synthèse
A l'étirement, l'amplitude des uctuations du plateau B-S ne dépasse pas quelques pN, sauf cas particuliers (Fig 3.2). C'est là la signature d'un changement coopératif que s'attachent à expliquer les modèles voulant décrire la transition B-S. Cet eet coopératif implique une extension par leurs extrémités des régions déjà dénaturées. Il est plus facile d'étendre une région S déjà existante plutôt que d'en nucléer une nouvelle.
Nous avons vu que pour les zones riches en A-T, le plateau B-S apparaissait en-deçà des 65 pN, ce qui suggère que ce sont ces régions plus fragiles qui vont transiter les premières vers un état désapparié. La transition de ces zones s'eectue toujours aux alentours de 65 pN, car il faut encore tenir compte de la présence des paires C-G : même si elles sont minoritaires, elles maintiennent la structure B en place jusqu'à ce qu'elles soient elles aussi fragilisées.
Les régions riches en C-G maintiennent les deux brins au contact et adoptent très certainement une structure S bien dénie dont l'hélicité serait celle déterminée dans [90].
Au-delà de la transition, la plupart des paires de bases, y compris C-G, se désapparient, menant à une conguration de deux polyélectrolytes chargés en interaction complexe [39] : répulsion des squelettes phosphatés chargés négativement (1 e−par bp), et attraction entre les bases sur les brins diérents ou sur le même brin. Ce passage d'une structure S dénie vers un état désapparié au-delà de 65 pN doit s'accompagner d'un hystérésis ; et doit être dépendant du taux de charge. C'est ce qui est observé dans [119].
Le prol irrégulié du plateau peut s'expliquer par les variations dans la distribution des paires A-T le long de la molécule. L'hystérésis lors de la relaxation s'explique par des
raisons liés au désappariement des zones riches en A-T qui a eu lieu lors de l'extension.
Tant que l'on ne dépasse pas le plateau B-S, le changement de structure des zones riches en C-G, sans désappariement des paires de bases, n'est pas source d'hystérésis à la relaxation.
Ainsi, avec un tel modèle, nous devrions observer des zones sans hysterésis si nous ne dépassons pas le plateau B-S. Ces zones riches en C-G (dont il reste à évaluer la coopérativité et le pourcentage en paire de bases C-G) doivent produire une signature visible : c'est eectivement le cas pour la molécule pBR322 ou pc-DNA his A,B,C (Fig 3.7).
Ainsi, lorsque le squelette sucre-phosphate de la molécule d'ADN présente une cas- sure, il est possible par simple étirement, au-delà du plateau B-S, qu'une partie simple brin se détache complètement du reste de la molécule (Fig 3.12). La molécule est alors partiellement simple brin, ce qui se voit clairement sur le prol d'étirement (Fig 3.8).
Les temps parfois longs pour retrouver la forme B de l'ADN rappellent ceux rencontrés dans les expériences d'ouverture de boucles d'ARN, où il faut aussi attendre plusieurs secondes pour que la structure se replie correctement après étirement [64]. Ces temps longs sont probablement dus ici, aux problèmes de réappariement entre paires de bases justement.
Fig. 3.12 Interprétation de l'étirement de la Fig 3.8 a, le squelette de phosphodiester de la molécule d'ADN est initialement cassé en un endroit. b, sur le plateau B-S les zones riches en A-T se désapparient, les riches en C-G changent de structure. c, au-delà du plateau, même les zones riches en C-G se désapparient, si les interactions entre les deux brins ne sont plus assez nombreuses pour retenir à proximité la partie du brin cassé qui n'est liée à aucune des billes.
Celui-ci est alors libéré dans la solution. d, en retournant à des forces inférieures à 65 pN, la molécule d'ADN est mixte : une partie est simple brin, l'autre est restée double brin. Les prols d'étirements suivants ne se superposent plus à celui d'une molécule d'ADN complète.