Lames de verres Agilent 15k dédiées branchie: Du design à l'utilisation

1. Design

Le choix du format de puce à ADN à utiliser s'est porté sur des puces AGILENT 8 x 15k. Les puces Agilent 15k pouvant accepter la présence de 15208 oligos, nous avons sélectionné 15208 gènes en fonction d’expériences effectuées au préalable. Nous avons tout d’abord choisi d’intégrer dans les gènes de la puce, des candidats fonctionnels identifiés statistiquement dans deux expériences passées. La première, décrite dans le chapitre II, a révélé l’importance de 249 gènes (p.47) dans les processus de réponse à un choc hyperosmotique à 32 PSU. La seconde, non décrite ici, traitant de la réponse de truites arc-en- ciel à un stress de confinement, avait mis en évidence 319 gènes candidats.

Une fois ces 602 candidats de premier ordre sélectionnés, les 14606 places restantes ont été utilisées pour des gènes s’exprimant fortement et spécifiquement dans la branchie.

Pour cela, deux expériences ont été menées sur des puces multitissus commerciales « truites » Agilent 44k (Salem et al., 2008). Une comparaison a été effectuée entre les résultats de l’hybridation d’ARN de différents tissus (rate, muscle, ovaire, testicule et branchie) de truite arc-en-ciel permettant de sélectionner 7983 gènes spécifiquement exprimés dans la branchie (données non présentées). Par ailleurs, une expérience d’hybridation d’échantillons d’ARN de

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branchie de truite arc-en-ciel a permis de sélectionner les 6598 gènes s’exprimant le plus dans la branchie (données non présentées). Finalement, après avoir vérifié les redondances et la présence d’oligos Agilent pour les gènes sélectionnés, 15083 gènes ont été placés sur la puce en utilisant des oligos Agilent et seulement 125 oligonucléotides ont été nouvellement dessinés. La puce générée porte le nom de gillarray et le numéro Agilent AmadID 023781.

2. Extraction des acides nucléiques et marquage

Une fraction de chaque échantillon de branchie (environ 100 mg) a été broyée et l’ARN total extrait par la méthode à étape unique au guanidium isothiocyanate-phenol- chlorophorm (Chomczynski et Sacchi, 1987) en utilisant 1mL de TRIzol par échantillon. Afin de réduire les risques d’activité RNase, les solutions d’ARN obtenues ont été reprises dans 50 µL d’eau RNase free contenant 80 U / mL de RNase inhibitor. L’intégrité de l’ARN, ainsi que sa concentration, ont été contrôlées à l’aide d’un Nanodrop ND-1000 UV-Vis (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, U.S.A.) et d’un Bioanalyseur Agilent 2100 (RNA Nano 6000 Chip / 2100 Bioanalyzer) (Agilent, Palo Alto, CA).

Le marquage des sondes s’est effectué en incorporant à nos ARN de la cyanine 3 lors de la synthèse d’ARN complémentaire (ARNc) en suivant les indications du fournisseur (Quick Amp Labeling (Agilent, Palo Alto, CA)). Brièvement, une quantité de 350 ng d'ARN de chaque prélèvement branchial s'est vu rétro-transcrit en présence d'amino-allyl deoxyuridine triphosphate (dUTP), d'amorces oligo-d (T) et de reverse transcriptase MMLRT (Invitrogen). Les ADNc synthétisés ont ensuite été marqués à la cyanine3 pendant une réaction permettant l'obtention d'ARNc. Préalablement au marquage, une étape consiste à introduire dans nos solutions d’ARN une solution de spike de concentration connue. Cette étape permettra par la suite de quantifier un rapport entre quantité de sonde hybridée et fluorescence du spot. Une fois nos échantillons marqués, ils sont purifiés sur colonne (RNeasy Mini kit (QIAGEN, Valenica, CA)) afin d'enlever les fluorophores non incorporés. La qualité des réactions de marquage est ensuite vérifiée en mesurant la quantité en ARNc produit ([ARNc]*30 / 1000) et l'activité spécifique liée à la cyanine ([cy3] / (1000*[ARNc])) en utilisant un spectrophotomètre Nanodrop ND-1000 UV-Vis (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, U.S.A.). Ce dosage permet alors de valider le bon déroulement des étapes de marquage et de purification. Les échantillons doivent présenter au moins 1,65 µg d'ARNc et une activité spécifique supérieure à 8.

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3. Hybridation, lavage et scan

Pour chaque échantillon, 600 ng d'ARNc ont été dilués dans de l’eau pour un volume final de 19µL afin d'être utilisés pour préparer l'hybridation. Cinq µL de « Blocking Agent 10X » ont été ajoutés à chaque échantillon, ainsi qu'1 µL de tampon de fragmentation 25X, pour obtenir un volume final de 25µL. Après une incubation de 30 min. à 60°C à l'abri de la lumière, 25µL de « Gex 2X » ont été ajoutés puis la solution a été homogénéisée. Une centrifugation à 13000 rpm pendant une minute a ensuite été réalisée. Pour chaque échantillon, 40µL de solution d'hybridation ont été déposés sur la puce à ADN, chaque puce contenant 8 zones d’hybridation correspondant à 8 échantillons. L’assemblage puce-cassete est ensuite placé au four à hybrider Agilent pendant 17 heures à 65°C à 10 rpm. Les puces sont enfin lavées dans 2 solutions de tampon successives. L’étape de lavage peut se faire pour 4 puces simultanément. Le scan s'est effectué sur un scanner Agilent suivant les instructions du constructeur. L’acquisition des données a été effectuée par le logiciel Scan Control. Enfin, le logiciel Feature Extraction a ensuite été utilisé pour effectuer un premier contrôle de la qualité d'hybridation des lames et disposer les grilles nécessaires à la reconnaissance des spots de chaque zone.

4. Contrôle qualité et normalisation des données

L’analyse des QC Reports fournis après scanner et traitement par Feature Extraction a permis de vérifier l’absence de problèmes sur les lames. De nombreux critères sont alors vérifiés concernant l’uniformité des spots, leur saturation, la distribution de leurs intensités, la distribution spatiale des signaux médians de chaque ligne et colonne de spots, la révélation des contrôles positifs, l’intensité du bruit de fond, la reproductibilité du spotting à partir de réplicats, ainsi que la corrélation entre force du signal et concentration en ARNc.

Afin de supprimer les spots aberrants, les informations fournies par Feature Extraction concernant les critères de contrôle, de non-uniformité (individuelle et de la population), de saturation et d’existence réelle (signal significativement supérieur au bruit de fond et positif) du spot ont été utilisés.

La normalisation des données s’est effectuée à l’aide du logiciel SAS 9.0 (SAS®

statistics). Les fichiers bruts importés contenaient pour chaque individu, les valeurs d’expression, ainsi que les informations concernant les critères de contrôle et autres renseignements pour les 15208 transcrits de puce. Dans le cas simple traité ici de la mesure d’un phénotype expressionnel en monocouleur, la normalisation consiste en un simple

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passage en logarithme 10 des valeurs d’expression « gProcessedSignal » proposées par Feature Extraction (signal corrigé pour un bruit de fond local) afin d’obtenir une distribution proche de la normalité et d'un centrage de ces valeurs par la médiane des valeurs de chaque individu.

Pour chaque gène, la moyenne et l’écart type de la distribution des valeurs d’expression ont été calculées. Les valeurs situées à plus de 3 écarts-types de la moyenne de chaque gène ont été considérées manquantes (NA).