La malate déshydrogénase catalyse la conversion de l'oxaloacétate et du malate en utilisant le système de coenzyme constitué par NAD+ et NADH (Figure 11). C‟est une enzyme ubiquitaire qui se présente sous plusieurs isoformes qui ont été identifiées chez de nombreux organismes. Ces isoenzymes se caractérisent par leur localisation dans la cellule et leur spécificité en fonction des coenzymes NAD+ et NADH, qu‟elles utilisent pour les réactions qu‟elles catalysent. Chez les eucaryotes il existe au moins deux isoformes de l'enzyme malate déshydrogénase. La première est une enzyme clé du cycle du TCA qui a lieu dans la mitochondrie (MDH1 chez S. cerevisiae) et la deuxième est retrouvée dans le cytoplasme (MDH2 chez S. cerevisiae) et participe au shunt malate/aspartate. Une troisième isoenzyme a été trouvée dans les peroxysomes de la levure S. cerevisiae (MDH3) et des plantes, où elle convertit le malate produit à partir de glyoxylate, en oxaloacétate (Steffan et McAlister-Henn, 1992).
C.1. La malate déshydrogénase mitochondriale
La malate deshydrogénase codée par MDH1 est une enzyme mitochondriale étroitement liée à la citrate synthase qui est l‟enzyme qui vient juste après elle dans le cycle de Krebs. Cette isoenzyme joue un rôle clé dans le cycle du TCA et dans la navette malate/aspartate qui se déroule dans la membrane de la mitochondrie (McAlister-Henn et Thompson, 1987). La navette malate/aspartate comporte encore deux protéines de transport dans la membrane interne de la mitochondrie. L‟une des protéines est chargée de l‟échange réversible à travers la membrane d‟un malate contre une molécule d‟-cétoglutarate. La deuxième protéine est chargée de l‟échange d‟un ion aspartate contre une molécule de glutamate. Lorsque les ratios NADH/NAD+ dans le cytoplasme et l'espace inter-membranaire augmentent à travers l'activité des déshydrogénases à NAD cytoplasmiques, la malate déshydrogénase cytoplasmique réduit l'oxaloacétate en malate. Le malate diffuse à travers la membrane mitochondriale et va être échangé par le transporteur de la membrane interne contre un -cétoglutarate qui est exporté de la mitochondrie. In vitro, la Mdh1p purifiée, forme un complexe physique stable avec le citrate synthase (Datta et al., 1985) ou avec l'aspartate aminotransférase (Birktoft et al., 1983), une association qui montre son rôle dans le fonctionnement de la navette malate/aspartate. Le gène MDH1 de S. cerevisiae a été cloné (Thompson et al., 1988), et l‟analyse de la séquence d'acides aminés a montré que cette isoenzyme mitochondriale tout comme celles de E. coli et des mammifères (McAlister-Henn
33 et al., 1987) comme le porc (Birktoft et al., 1982; Roderick et Banaszak, 1986), est une enzyme d‟un poids moléculaire d'environ 33.5 kDa (Banaszak et al., 1975).
Les cellules haploïdes de S. cerevisiae dans lesquelles le gène de la malate déshydrogénase mitochondriale MDH1 a été délété, n‟ont pas d‟auxotrophie pour l‟aspartate ou le glutamate supposant une compensation soit par l'isoenzyme cytoplasmique, soit par l‟'aspartate aminotransférase ou les deux.
Chez S. cerevisiae les souches disruptées de MDH1 sont incapables de pousser sur acétate montrant le rôle important que joue la Mdh1p dans la production d‟énergie (cycle du TCA) dans ces conditions de croissance. C‟est donc une enzyme qui joue un rôle important dans le métabolisme chez les levures et de façon plus générale chez les eucaryotes.
C.2. La malate déshydrogénase cytoplasmique
Chez les eucaryotes et notamment chez la levure, il existe une deuxième isoenzyme non mitochondriale, qui est l‟isoenzyme cytoplasmique codée par MDH2. L‟isoenzyme Mdh2p est une enzyme de la néoglucogenèse et est requise pour la croissance sur milieu minimum ayant pour source de carbone l‟acétate ou l‟éthanol (Minard et McAlister-Henn, 1991). Elle catalyse une étape de la néoglucogénèse à partir du pyruvate. En effet dans la mitochondrie l'oxaloacétate issu du cycle de Krebs ou encore de la décarboxylation du pyruvate ne peut pas franchir la membrane mitochondriale. Il est alors transformé en malate par la malate déshydrogénase mitochondriale (MDH1) avec comme cofacteur le NADH (réaction inverse de celle du TCA). Le malate ainsi formé peut traverser la membrane de la mitochondrie et être transporté dans le cytosol (navette malate/aspartate). Au niveau du cytoplasme le malate est retransformé en oxaloacétate par la malate déshydrogénase cytosolique (MDH2) avec le NAD+comme cofacteur. L‟oxaloacétate va être ensuite transformé en Phosphoénol-pyruvate (PEP) par la PEP carboxykinase et rentrer dans la voie de la néoglucogénèse.
L‟isoenzyme malate déshydrogénase codée par MDH2 est une protéine d‟environ 42 kDa qui est une sous unité du dimère qu‟elle forme avec l‟isoenzyme mitochondriale (34 kDa). Malgré les différences de poids moléculaire, l‟alignement de ces deux protéines a montré qu‟elles présentent 49% de similarité. Sur la base de comparaisons des structures tridimensionnelles des malate déshydrogénases du porc, Roderick et Banaszak (1986) ont révélé des régions présentant une forte homologie entre ces deux isoenzymes et la présence de résidus acides aminés jouant un rôle important dans le choix du cofacteur NADH ou NAD+ (Birktoft et al.,
34 1989). Chez S. cerevisiae la protéine Mdh1p se différencie de la Mdh2p par une séquence de 17 acides aminés en N-terminal qui permet son adressage à la mitochondrie et qui est probablement clivée après l‟importation dans la mitochondrie (Thompson et McAlister-Henn, 1989; Thompson et a1., 1988). L‟enzyme Mdh2p de S. cerevisiae possède une séquence de 12 acides aminés en N-terminal, qui la distingue de la Mdh1p et de la Mdh3p. Néanmoins cette séquence d‟acides aminés n‟existe pas chez la malate déshydrogénase cytosolique des mammifères (Joh et al., 1987). Il a été montré que la suppression de cette séquence de 12 acides aminés n‟a pas d‟effet sur le taux de Mdh2p dans la cellule (Minard et McAlister- Henn, 1991) mais supprime son rôle dans la néoglucogenèse (Gibson et McAlister-Henn, 2003). Cette séquence d‟acides aminés jouerait un rôle dans le choix du cofacteur.
C.3. La malate déshydrogénase peroxysomale
Dans des mutants où les gènes MDH1 et MDH2 ont été disruptés, Minard et McAlister-Henn (1991) ont montré qu‟il y avait toujours une activité malate déshydrogénase ce qui a laissé supposer l‟existence d‟un troisième gène codant une malate déshydrogénase.
En effet, les cellules haploïdes de S. cerevisiae disruptées de ces deux gènes avaient toujours une activité malate déshydrogénase et pouvaient croitre sur des substrats non fermentescibles.
Des études postérieures ont permis d‟isoler et de caractériser le gène MDH3 qui présente 50%
de similarité avec MDH1 et 43% de similarité avec MDH2 (Steffan et McAlister-Henn, 1992).
L‟enzyme Mdh3p de S cerevisiae est une enzyme de 37 kDa qui a une séquence carboxy- terminale constituée du tripeptide Ser-Lys-Leu qui est une séquence d‟adressage aux peroxysomes comme chez d‟autres protéines (Purdue et Lazarow 1994). La disruption de MDH3 entraine une incapacité de croissance sur l‟oléate comme seule source de carbone (Van Roermund et al., 1995) montrant ainsi que cette enzyme est impliquée dans le cycle du glyoxylate. Une Mdh3p dépourvue de sa séquence terminale SKL conserve toute son activité malate déshydrogénase mais n‟est pas adressée dans les peroxysomes. Cette enzyme tronquée a permis de restaurer l‟activité malate déshydrogénase cytoplasmique Mdh2p dans les souches ou le gène MDH2 a été disrupté (McAlister-Henn et al., 1995).
C.4. Les enzymes malate déshydrogénase chez la levure Yarrowia lipolytica
Chez Yarrowia lipolytica seulement deux gènes ont été identifiés contrairement à S.
cerevisiae et à la majorité des eucaryotes. Le gène YALI0D16753g de Y. lipolytica est l‟orthologue du gène YKL085w (MDH1) de S. cerevisiae et code une protéine de 338 acides
35 aminés qui présente une séquence d‟adressage à la mitochondrie avec une probabilité de 99%
(MITOPROT). Le deuxième gène, YALI0E14190g de Yarrowia lipolytica est l‟orthologue du gène YOL126c (MDH2) de S. cerevisiae, qui code normalement une malate déshydrogénase cytoplasmique, et code chez Y. lipolytica une protéine de 331 acides aminés. L‟absence d‟un troisième gène malate déshydrogénase (peroxysomale) et l‟analyse de la séquence prédite de la protéine codée par MDH2 nous amenés à vouloir comprendre le fonctionnement ce gène MDH2.