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MATERIEL ET METHODES
46 Figure 12 : Schéma de la carte des vecteurs d’expression JMP62-URA3ex et JMP62 LEU2ex
A.2.2. Les vecteurs pour la production de protéines
Pour la production des protéines de fusion dans E. coli, le plasmide pMAL c2X a été utilisé. En effet la construction a consisté à fusionner le gène d‟intérêt avec le gène de la MBP pour permettre sa purification une fois produite dans la bactérie.
Le vecteur pMAL c2X a été conçu pour permettre l‟expression et la purification d'une protéine produite à partir d'un gène ou un cadre ouvert de lecture. Le gène est inséré en aval du gène malE qui code la protéine Maltose Binding Protein (MBP), permettant l'expression d'une protéine de fusion MBP. La MBP dans ces vecteurs a été introduite pour permettre une liaison à l'amylose. Le vecteur contient le promoteur fort tac et la séquence signal de l'initiation de la traduction du malE pour permettre une forte expression des gènes clonées et une étape de purification de la protéine de fusion au moyen d'affinité MBP pour le maltose.
Le vecteur contient également un site de clonage multiple et est porteur du peptide signal d‟adressage des pré-protéines de fusion MBP dans le cytoplasme porteurs et d‟une séquence codante pour le site de reconnaissance d'une protéase spécifique, qui va permettre le clivage de la protéine d'intérêt après purification.
47 Figure 13 : Carte du plasmide pMAL c2X pour la production des protéines dans E. coli
A.2.3. Les vecteurs pour le clonage des cassettes de disruption
Les vecteurs pBluescript II KS (+/-) et pBluescript II SK (+/-) : Pour le clonage des cassettes de disruption, nous avons utilisé le plasmide pBluescript II KS (+/-) ou le pBluescript II SK (+/-). Ces deux séries de vecteur représentent deux orientations du MCS (multiple cloning site) présent dans le gène lacZ codant pour le fragment alpha N terminal de la bêta-galactosidase (KS représente l‟orientation du MCS avec lequel la transcription de lacZ se fait de KpnI à SacI au lieu de SacI à KpnI en ce qui concerne SK).
Les symboles + et – du pBluescript indiquent l‟orientation de la région inter génique (IG). Les deux vecteurs contiennent le promoteur inductible plac en amont de la région lacZ qui complémentée avec la région E. coli lacZ permet la sélection de colonies blanches contre les colonies de couleur bleue lorsqu‟il n‟y a pas d‟insertion de fragment d‟ADN dans le MCS.
Ils contiennent également une origine de replication ColE1 ori et le gène de résistance à l‟ampicilline pour la sélection des transformants.
Figure 14 : Carte des vecteurs de clonage pBluescript II KS (+/-) et pBluescript II SK (+/-)
48 A.3. Les milieux de culture
A.3.1. Les milieux pour Yarrowia lipolytica
A.3.1.1. Les milieux de culture classique pour Yarrowia lipolytica
Milieu complet YPD - 10 g/L Bactopeptone
- 10 g/L Extrait de levure (Yeast Extract, Difco, Detroit, MI) - 10 g/L Glucose
Milieu minimum YNBNO
- YNB W/O (Yeast Nitrogen Base; w/o acides aminés , sulfate d‟ammonium) 0.67%
- NH4Cl 0.5%
- Tampon phosphate (KH2PO4-Na2HPO4) pH6.8, 50 mM - Glucose 1%
A.3.1.2.Les milieux de culture pour la croissance des mutants Yarrowia lipolytica
Milieu minimum YNB Casa : sélection des mutants Ura+ ; Leu-
- YNB W/O (Yeast Nitrogen Base ; w/o acides aminés , sulfate d‟ammonium) 0.67%
- NH4Cl 0.5%
- Tampon phosphate (KH2PO4-Na2HPO4) pH6.8, 50 Mm - Glucose 1%
- Casaminoacids 0.2%
Milieu minimum YNB Ura : sélection des mutants Ura-; Leu+
- YNB W/O (Yeast Nitrogen Base ; w/o acides aminés , sulfate d‟ammonium) 0.67%
- NH4Cl 0.5%
- Tampon phosphate (KH2PO4-Na2HPO4) pH6.8, 50 mM - Glucose 1%
- Uracile 0.05g/l
49 A.3.1.3. Le milieu d’induction pour l’accumulation des triglycérides
Nous avons utilisé le milieu préparé selon le tableau 1, surtout pour l‟analyse des corps lipidiques dans les souches dans lesquelles nous avons fusionné les gènes DGA1 et LRO1 avec la YFP.
Tableau 2 : Composition du milieu d’induction pour l’accumulation des triglycérides Solution stock Stérilisation 500 ml Concentration finale.
YNB W/O 50 g/l Filtration 0.22 µm 17 ml 0.17%
NH4Cl 250 g/l 121° 20 min 10 ml 0.5%
Tampon PO4 NaK pH6.8 500 mM 121° 20 min 50 ml 50 mM
YE (100g/l) Filtration 0.22 µm 7.5 ml 1.5 g/l
Emulsion d’acide oléique 20% Sonication 50 ml 2%
A.3.1.4. Les milieux pour les analyses phénotypiques : tests en goutte
Pour la réalisation des tests en gouttes pour l‟analyse phénotypique, nous avons utilisé plusieurs milieux à partir du milieu minimum de culture de Yarrowia lipolytica complémenté par différentes sources de carbone (Tableau 3). La composition du milieu dépend du test de croissance que nous voulons réaliser. Nous avons utilisé dans la plupart des cas une émulsion d‟acide oléique, de tributyrine, de trioléine comme source de carbone avec des contrôles sur glucose milieu minimum ou milieu riche. Les milieux sont quelque fois complémentés par l‟uracile, les casamino acides ou la leucine pour les souches auxotrophes.
Tableau 3 : Composition du milieu pour les analyses phénotypiques : tests en goutte.
Solution stock Stérilisation 500 ml Concentration finale.
AGAR 2% 121° 20 min 1.6%
YNB W/O 50 g/l Filtration 0.22 µm 17 ml 0.17%
NH4Cl 250 g/l 121° 20 min 10 ml 0.5%
PO4 NaK pH6.8 0.5 mM 121° 20 min 50 ml 50 mM
Emulsion 20% Sonication 50 ml 2%
50 A.3.2. Les milieux pour Escherichia coli
A.3.2.1. Le milieu de culture complet : Luria-Bertani broth (LB) - 10 g/L Bactotryptone
- 5 g/L Extrait de levure (Yeast Exctract, Difco, Detroit, MI) - 10 g/L NaCl
- pH ajusté à 7
A.3.2.2. Le milieu de culture pour la sélection des transformants
Pour la sélection des transformants d‟E. coli le milieu de culture complet est utilisé additionné d‟un antibiotique selon le gène de résistance contenu dans le plasmide utilisé. La Kanamycine (50 à 100 μg/mL) a été utilisée dans la majorité des clonages avec les vecteurs JMP62-URA3ex ou JMP62-LEU2ex et l‟ampicilline (50 à 100 μg/mL) pour les vecteurs pMAL-c2X et pBluescript.
A.3.2.3. Le milieu de culture pour la production des protéines de fusion - 10 g tryptone
- 5 g yeast extract - 5 g NaCl
- 2 g glucose
- IPTG (concentration 0.5 mM)