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FIGURE 46: Purification des protéines NprR et NprRΔHTH
A. Profil d’élution en chromatographie d’exclusion de taille (SEC) : les protéines purifiées en sortie d’IMAC ont été injectées sur une colonne préparatrice SEC (S200-26/60). Les chromatogrammes représentent l’absorbance à 280nm (mAU) en fonction du volume d’élution (ml).
B. Analyse sur gels SDS-PAGE : 10µl d’échantillon ont été déposés sur un gel SDS-PAGE à 12.5%.
Les puits 1 et 2 représentent respectivement les fractions de lyse totale et soluble. Le puits 3 correspond à l’échantillon injecté sur la colonne IMAC (fraction soluble après filtration). Le puits 4 correspond à une fraction protéique non retenue sur la colonne IMAC durant l’injection. Les puits 5 et 6 correspondent au pic d’élution de la chromatographie IMAC. Enfin, le puits 7 correspond à une fraction éluée un peu après le volume mort de la colonne SEC (S200-26/60) pouvant contenir des agrégats. Les puits suivants correspondent aux pics minoritaire et majoritaire de la colonne SEC.
0 500
120 140 160 180 200 220 ml
170.42 130.62
173.78
129.65
167.32
Dimères
B Pic minoritaire
Agrégats
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2. Purification des échantillons pour la cristallisation
Les protéines NprR, NprRΔHTH et NprRΔHTH-SeMet sont purifiées en deux étapes selon le protocole décrit dans le chapitre Matériels et Méthodes : une chromatographie d’affinité sur résine de nickel suivie d’une chromatographie d’exclusion de taille. J’obtiens les protéines purifiées NprR (51 kDa) et NprRΔHTH (45 kDa) avec un rendement moyen de 40 mg par litre de culture. Dans les deux cas, les profils d’élution de la colonne d’exclusion de taille présentent un pic majoritaire à des volumes d’élution de 184.70 ml et 194.66 ml respectivement pour NprR et NprRΔHTH précédé d’un pic minoritaire à des volumes d’élution de 167.32 ml et 173.78 ml respectivement pour NprR et NprRΔHTH (FIGURE 46-A). L’analyse électrophorétique sur gel SDS-PAGE des fractions d’élution montre que les 2 pics contiennent une bande largement majoritaire, de masse correspondant à la protéine purifiée, NprR ou NprRΔHTH (FIGURE 46-B). La pureté des échantillons n’est cependant que relative et on note la présence de contaminants de faibles poids moléculaires ainsi que des contaminants de hauts poids moléculaires, plus importants dans le pic minoritaire que dans le pic majoritaire. D’après la calibration de la colonne (Matériels et Méthodes p84), les pics identifiés correspondent à des tétramères et des dimères. Ainsi, dans les conditions de purification, la forme Apo de l’effecteur NprR est majoritairement sous forme dimérique. Le pic minoritaire suggère l’existence d’un équilibre avec une forme tétramérique minoritaire mais pourrait également s’expliquer par la présence des contaminants de haut poids moléculaire.
Les fractions correspondant au pic majoritaire sont mélangées et concentrées sur des unités de filtration (Vivaspin) ayant un cut-off de 30kDa. Dans le tampon de purification, les échantillons de protéine entière NprR peuvent être concentrés jusqu’à 45 mg/ml (876µM) alors que la forme tronquée NprRΔHTH est plus soluble et supporte une concentration allant jusqu’à 60mg/ml (1.33mM). La protéine tronquée et marquée au sélénium, NprRΔHTH-SeMet, est également purifiée sous une forme majoritaire dimérique mais un avec rendement de purification moindre (10mg pour 2L de culture) et une solubilité légèrement réduite, l’échantillon marqué pouvant être concentré jusqu’à 20mg/ml.
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Paramètres NprR (2mg/ml) NprRΔHTH (2mg/ml)
Mw théoriques (Da) 51 339 44 490
Mw mesurées (Da) 114 277 96 993
Rh (nm) 4.508 4.353
Concentration (mg/ml) 1.339 1.303
Etat oligomérique Dimère Dimère
FIGURE 47: Analyse par SEC-MALS des protéines NprR et NprRΔHTH A. NprR B. NprRΔHTH
Les mesures ont été effectuées à partir des protéines diluées à 2mg/ml ( 40µM) dans du tampon E ajusté à pH7.5. 100µl d’échantillon sont injectés sur une colonne Superdex S200-10/300, équilibrée donc dans le tampon E pH 7.5. Les chromatogrammes représentent l’indice de réfraction en mV (axe des ordonnées de gauche, courbe rouge) et le logarithme de la masse moléculaire (axe des ordonnées de droite, courbe noir) en fonction du volume d’élution en ml.
125 3. Analyse par SEC-MALS
Nous avons cherché à confirmer l’état oligomérique des protéines en solution et pour ce faire, nous nous sommes tournées vers le SEC-MALS (Size Exclusion Chromatography – Multi-Angles Light Scattering). Cette méthode permet de calculer la masse moléculaire des analytes qui composent un échantillon, indépendamment du volume d’élution, grâce à la mesure de leur indice de réfraction.
Nous avons analysé les deux formes de l’effecteur à une concentration de 2mg/ml soit 40µM et 45µM respectivement pour NprR et NprRΔHTH. Dans les deux cas, la masse moléculaire mesurée est stable sous les pics d’élution ce qui indique que les échantillons sont homogènes. A partir des indices de réfraction, des masses moléculaires de 114 277Da et 96993Da ont été calculées respectivement pour NprR et NprRΔHTH, ce qui correspond à des formes dimériques des protéines (FIGURE 47 – A et B).
Ces expérience confirment que la forme Apo de l’effecteur est dimérique en solution.
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FIGURE 48: Spectres CD des formes Apo et complexées de l'effecteur
Les mesures ont été effectuées à 20°C sur une gamme de longueur d’onde allant de 185 à 260nm, les données traitées ont été réduites à une gamme de 190-240nm. Les protéines ont été diluées à 5mg/ml (100µM) dans du tampon Phosphate (50mM, pH7.8, 50mM NaF). Le peptide NprX7 a été ajouté à une concentration de 500µM pour mesurer les complexes. Les spectres représentent la différence entre les coefficients d’extinction molaire (Δε en M-1.cm-1) en fonction de la longueur d’onde (λ en nm).
185 205 225 245
λ (nm)
-4 -2 0 2 4 6 8
185 205 225 245
Δε (M-1.cm-1)
λ (nm)
NprRΔHTH
Apo NprRdHTH Fit Apo NprRdHTH NprRdHTH/NprX7 Fit NprRdHTH/NprX7
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