CHAPITRE IV IMPLICATION DU SYSTEME MMR DANS LA
4- Etude de l’activité glycosylase de la protéine MutY d’E. coli
a) Etude du clivage des duplexes
Les duplexes de 24 paires de bases GG/CC, GG/AC et G*G*/AC sont radiomarqués sur le brin riche en purines par le γ
32P-ATP et hybridés selon le protocole décrit précédemment (§ I 2 b). 40 fmol de duplexe radiomarqués sont incubés à température ambiante avec 130 ng de protéine MutY en présence de 20 mM Tris-HCl pH 7.5; 50 µg de BSA et 10 mM EDTA pH 8 dans un volume final de 10 µl. Pour chaque duplexe testé, les temps d’incubation sont de 30 minutes, 1h, 3h et 6h. La réaction est arrêtée par addition de 2 µl de NaOH 2.5 M et par chauffage (95°C pendant 5 minutes). 10 µl d’une solution de 75%
Réponse de MutS x masse molaire de l’ADN
Réponse de l’ADN x masse molaire de MutS
formamide, 0.02% BBP et 0.02% XC sont rajoutés avant le dépôt de 3 µl d’échantillon sur un gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (gel 24% 19:1 acrylamide:bisacrylamide; 7 M urée; 1 TBE). Après une migration à température ambiante de 30 minutes (20W), le gel non séché est exposé sous cassette, lu par le phosphoImager et quantifié pour déterminer la fraction d’ADN clivé par MutY.
b) Etude de la spécificité de la protéine MutY par compétition contre la sonde radiomarquée GG/AC
La réaction se fait dans les mêmes conditions expérimentales décrites dans le paragraphe précédent en présence de duplexe compétiteur GG/CC ou G*G*/AC de 24 paires de bases non marqué. Le rapport de concentration sonde/compétiteur varie entre 0 et 25.
Après une incubation de 30 minutes à 37°C, l’échantillon est préparé et déposé sur un gel de
polyacrylamide selon le protocole décrit ci-dessus. La quantification du gel permet de
déterminer la fraction d’hétéroduplexe GG/AC radiomarqué clivé en absence et en présence
de compétiteur. Le rapport (fraction d’ADN clivé en absence de compétiteur/fraction d’ADN
clivé en présence de compétiteur) est reporté en fonction de la concentration en compétiteur
afin de comparer la spécificité de MutY pour les duplexes GG/CC et G*G*/AC.
RESULTATS
Le rôle principal de la protéine MutS chez les bactéries et de ses homologues eucaryotes MutSα (hétérodimère MSH2/MSH6) et MutSβ (hétérodimère MSH2/MSH3) est de reconnaître les mésappariements et les insertions/délétions dans l’ADN (pour revue, Modrich et Lahue, 1996). La détection des adduits du cisplatine par le système MMR semble être une étape nécessaire pour déclencher la mort cellulaire (Nehmé et coll., 1997 ; Duckett et coll., 1999). Plusieurs études ont été menées sur l’interaction de hMutSα avec les adduits du cisplatine mais les résultats varient d’une étude à l’autre. Une étude récente montre que MutS d’E. coli reconnaît spécifiquement un ADN modifié globalement par le cisplatine (Zdraveski et coll., 2002). Duckett et coll. (1996) et Mu et coll. (1997) montrent que hMutSα reconnaît l’adduit intrabrin majoritaire 1,2-d(GpG) avec une spécificité faible mais cette reconnaissance serait suffisante pour avoir une signification biologique. hMSH2 seule présente aussi une faible affinité pour l’adduit 1,2-d(GpG) (Mello et coll., 1996). D’un autre coté, Yamada et coll. (1997) trouvent que hMutSα reconnaît fortement l’adduit 1,2-d(GpG) lorsqu’une thymine est incorporée en face de l’une des deux guanines de l’adduit.
Seules les interactions entre MutS ou MutSα et l’adduit 1,2-d(GpG) ont été étudiées in
vitro. Aucune information n’est disponible sur l’affinité de ces protéines pour les adduits
intrabrins 1,2-d(ApG), 1,3-d(GpNpG) ainsi que pour l’adduit interbrin formé dans le site de pontage d(GpC/GpC). De plus, les adduits du cisplatine sont susceptibles de former in vivo des composés de lésions du cisplatine par réplication translésionnelle (Hoffmann et coll., 1996
a ; Vaisman et Chaney, 2000 ; Vaisman et coll., 2000). Ces composés de lésions (ou produits de lésions) du cisplatine ont pour origine l’incorporation d’une base non complémentaire en face de l’une des deux purines pontées par le cisplatine lors de la réplication. Puisque le système MMR est impliqué dans la cytotoxicité du cisplatine, il est important de savoir quelles lésions simples et/ou composés de lésions du cisplatine sont susceptibles d’être reconnus spécifiquement par le système MMR.
Dans la première partie de mon travail, j’ai donc déterminé par une étude physico-
chimique la nature des adduits et des composés de lésions du cisplatine reconnus
spécifiquement par MutS d’E. coli. Après avoir déterminé par gel de retardement
électrophorétique l’affinité relative de MutS pour les quatre adduits intrabrins 1,2-d(GpG),
1,2-d(ApG), 1,3-d(GpCpG), 1,3-d(GpTpG) ainsi que pour l’adduit interbrin formé dans le site
de pontage d(GpC/GpC), j’ai déterminé dans les mêmes conditions expérimentales l’affinité
relative de MutS pour tous les composés de lésions des adduits 1,2-d(GpG) et 1,2-d(ApG).
Afin de pouvoir déterminer la nature de chacune des lésions spécifiquement étudiées, j’ai utilisé des duplexes d’ADN contenant un adduit unique.
Selon les modèles proposés par l’équipe de P. Modrich et par l’équipe de R. Fishel (voir chap. I V 2), la fixation d’ATP par la protéine MutS permet d’initier la réparation par le système MMR après l’étape de reconnaissance. L’ATP a pour effet, entre autre, de baisser fortement l’affinité de la protéine pour un hétéroduplexe (Allen et coll., 1997 ; Worth et coll., 1998 ; Blackwell et coll., 2001). D’autre part, selon ces modèles, la protéine reconnaîtrait l’ADN sous forme libre ou ayant fixé de l’ADP. Mon hypothèse de travail, basée sur l’étude présentée en première partie, est que les produits de lésions du cisplatine seraient des lésions critiques reconnues par MutS à l’origine de l’action cytotoxique du cisplatine. Pour savoir si un composé de lésion du cisplatine peut moduler certaines propriétés biochimiques de MutS en présence des nucléotides, j’ai étudié par gel de retardement électrophorétique l’interaction de la protéine avec un duplexe d’ADN contenant un composé de lésion en présence des différents nucléotides.
Dans un troisième temps, je me suis intéressée à la reconnaissance du produit de lésion du DACH Pt (1,2-diamminecyclohexanedichloroplatine) contenant une thymine opposée à la guanine en 3’ de l’adduit intrabrin majoritaire 1,2-d(GpG) (duplexe G*G/CT DACH Pt).
Cette molécule fait partie de la nouvelle génération de dérivés du cisplatine utilisée en chimiothérapie. Le DACH Pt ne présente pas de résistance croisée avec le cisplatine dans les cellules déficientes en système MMR (Fink et coll., 1997), ce qui motive les études cliniques visant à l’utiliser pour soigner les patients ne répondant pas/plus au cisplatine. Cette molécule est actuellement en phase II d’essais cliniques (Albert et coll., 2003).
On sait que le passage translésionnel de l’ADN modifié par le DACH Pt a lieu in vitro
et
in vivo (Vaisman et Chaney, 2000 ; Mamenta et coll., 1994). Il a été montré
in vitro que
lors de la réplication translésionnelle, l'ADN polymérase β incorpore une thymine en face de
la guanine platinée en 3’ de l’adduit intrabrin 1,2-d(GpG) du DACH Pt (Vaisman et Chaney,
2000). Ce résultat suggère que des composés de lésions du DACH Pt se forment in vivo. Ils
pourraient alors être reconnus par le système de réparation MMR. D’autre part, dans une
étude utilisant de l’ADN naturel modifié par le cisplatine ou par le DACH Pt, MutS reconnaît
deux fois plus efficacement les adduits du cisplatine que ceux du DACH Pt. Cette étude
suggère que les adduits intrabrins majoritaires formés dans un contexte d’homoduplexe
seraient impliqués dans les mécanismes moléculaires à la base des différences observées dans
les réponses cellulaires au cisplatine et au DACH Pt. Le but de mon étude est de savoir si
MutS peut interagir avec des composés de lésions du DACH Pt et s’il existe des différences
d’interactions entre la protéine et les composés de lésions du cisplatine et du DACH Pt qui
pourraient expliquer les différences d’activité biologique mises en évidence entre les deux
dérivés du platine.
CHAPITRE I : INTERACTION DE LA PROTEINE MutS AVEC DES
