Résultat complémentaire

Nous avons également établi le graphe de fragmentation correspondant à la perte de dU des oligodésoxynucléotides de la série 2 (figure 3), que nous avons comparé à la perte de BrdU et de BrdC (figure 2 de la publication).

0 5 10 15 20 25

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Vc (V)

% ions fragments

Figure 3 : Graphe de fragmentation, obtenue dans la source, correspondant à la perte de la base dU à partir des oligodésoxynucléotides de la série 2 (x) 5'-d(CBrCCTTTGTTTCUC)-3' et (●) 5'-d(CUCTTTGTTTCBrCC)-3'.

A 7% des ions fragments, la perte de la base dU localisée en position 2 du côté 5' est observée à 30V (20V pour BrdU et 26V pour BrdC selon la figure 2 de la publication) et la même base localisée en position 2 du côté 3' est observée à 45 V (30V pour BrdU et 38V pour BrdC selon la figure 2 de la publication). Ainsi, la perte de base se produit selon l'ordre de préférence BrdU>BrdC>dU. Les bases bromées semblent se perdre plus facilement que les non bromées.

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156

IV. Conclusion

Les oligodésoxynucléotides bromés que nous venons d'étudier se fragmentent à de faibles valeurs de Vc et les conditions idéales d'analyses permettant d'éviter la fragmentation se situent à Vc=-15V. La position de la base bromée dans la séquence a une influence sur la fragmentation. Si elle est localisée en interne, l'oligodésoxynucléotide sera moins sujet à la fragmentation que si elle est située sur une extrémité de la séquence.

Comme les oligonucléotides bromés sont communément utilisés en cristallographie, il serait intéressant de soumettre quelques oligodésoxynucléotides que nous avons étudiés aux rayons X et de les vérifier en spectrométrie de masse afin de connaître l'effet des rayons X sur une base bromée. Dans le cas où les rayons X induiraient une perte de brome ou de la base bromée, vérifiée par spectrométrie de masse, il serait intéressant de poursuivre cette étude pour savoir si on peut trouver des doses d'irradiation n'induisant pas de dommage.

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Conclusion

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La CID dans la source est un phénomène mal connu et sujet à débat. Le but de ce travail était de montrer que la CID dans la source, tout comme la CID dans une cellule de collision, pouvait 'apporter sa pierre à l'édifice' en terme d'informations sur la structure des biomolécules étudiées ainsi que sur certains mécanismes réactionnels mis en jeu par ces biomolécules en phase gazeuse aussi bien qu'en solution.

Ce travail de thèse a confirmé qu'il y avait peu de différence entre la fragmentation dans la source électrospray et la fragmentation obtenue dans une cellule de collision dans le cas d'un spectromètre de masse de type triple quadripôle (Quattro II, Micromass). Nous avons montré que nous obtenions des informations structurales identiques pour les deux processus de fragmentation et que la masse et la charge avaient un effet sur la fragmentation des biomolécules étudiées. En effet, plus la valeur de m/z de l'ion est faible, plus le processus de collision est efficace.

Lors de la comparaison de ces deux processus de fragmentation, l'étude de peptides aldéhyde a permis de visualiser en source ESI le reflet en phase gazeuse de l'équilibre existant en solution entre un peptide aldéhyde et sa forme hydratée, i.e. un peptide diol. En augmentant progressivement l'énergie de collision, ces peptides diol et leurs analogues acétal perdent successivement une puis deux molécules d'eau ou de méthanol conduisant à un même ion final. Cette observation nous a amenées à penser que ces peptides se fragmentaient selon un mécanisme similaire. Nous avons alors étudié les processus de fragmentation qui sous-tendent ces pertes de méthanol ou d'eau avec des peptides modèles.

Les principales conclusions de cette étude montrent que la première perte de méthanol ou d'eau proviendrait certainement d'une 'fragmentation dirigée par la charge' et que l'ion final

158 probablement cyclique, issu de la seconde perte, proviendrait d'une attaque nucléophile par l'azote d'une amine (N-terminal ou ε-NH₂ d'une lysine) sur le carbone fonctionnel.

L'observation de la forme hydratée de l'ion peptide aldéhyde, à de faibles valeurs de tensions appliquées sur le cône d'échantillonnage, nous a conduit à étudier l'hydratation de peptides aldéhyde et cétone par résonance magnétique nucléaire et par ionisation électrospray. Ces deux méthodes sont complémentaires puisque la RMN atteste la forme hydratée en solution et l'ESI illustre le comportement en phase gazeuse du carbonyl étudié et de sa forme hydratée tétrahédrique. Les résultats obtenus nous ont poussées à continuer par une étude du mécanisme de la réaction d'oximation qui résulte de la condensation d'un peptide aldéhyde ou cétone sur un peptide aminooxy en milieu aqueux. Cette réaction s'effectue en deux étapes dont l'état intermédiaire est constitué par une forme tétrahédrique.

La première étape de la réaction de ligation semble être l'étape limitante pour les peptides cétone en raison de l'encombrement stérique de la fonction carbonyl. Concernant les peptides aldéhyde, la deuxième étape de la réaction de ligation semblerait déterminante en raison de la basicité de l'oxygène de la fonction hydroxyle.

L'étude d'oligodésoxynucléotides bromés, cette fois en mode négatif, par fragmentation dans la source ESI, a conduit à la perte de la base bromée. Cette perte est favorisée lorsque la base modifiée se situe aux extrémités de la séquence plutôt qu'en interne. Des ions fragments, correspondant aux ions complémentaires (a_n-B_n) et w_m proches de la base bromée, permettent ainsi de localiser l'emplacement de la base modifiée dans la séquence.

Les oligonucléotides bromés étant communément utilisés en cristallographie, il serait intéressant de poursuivre cette étude en comparant le résultat des deux méthodes pour savoir si nous pouvons trouver des doses d'irradiation n'induisant pas de dommage.

La variété des informations obtenues par fragmentation dans la source électrospray illustre l'intérêt de cette technique analytique. De plus, elle a l'avantage de la rapidité et de l'économie en matériel biologique par rapport à des techniques complémentaires telles que la RMN ou la cristallographie.

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Partie expérimentale

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Les analyses en spectrométrie de masse ont été réalisées sur un spectromètre de masse triple quadripôle (Quattro II, Waters) équipé d'une source en ionisation électrospray. Le logiciel d'application est Masslynx, version 3.4. La calibration externe est effectuée au moyen de la myoglobine.