Résumé

Dans cet article, nous avons étudié fonctionnellement une mutation faux-sens fréquente du CLC-KB, puisqu’elle est retrouvée chez huits patients atteints d’un syndrome de Bartter, consistant en la substitution de la valine 170 en méthionine. La valine 170 est localisée sur l’hélice F, une region importante pour la sélectivité et le gating de tous les CLC, et est très proche de la valine 166 qui, chez tous les autres CLC, correspond au « gating glutamate » responsable du gating des protopores.

Comme pour le premier article, nous avons d’abord analysé les données cliniques de ces huits patients. Tous ont été diagnostiqués tardivement et présentent un phénotype modéré à « asymptomatique ». Quatre des huits patients présentent cette mutation à l’état homozygote, tandis que quatre patients portent la mutation V170M seulement sur un de leurs deux allèles et montrent une autre mutation sur leur autre allèle (large délétion, décalage du cadre de lecture, Y236X et G433E). Parmi ces autres mutations, trois représentent clairement des mutations « perte de fonction » : large délétion, décalage du cadre de lecture et mutation non-sens (Y236X).

À l’aide de mesures dans des ovocytes de xénope, nous avons démontré que les courants, mesurés dans un milieu extracellulaire contenant 3mM Ca²⁺ à pH 9,0, et l’expression à la membrane plasmique du mutant V170M sont réduits d’environ 50% par rapport au CLC-KB sauvage. En revanche, lorsque le milieu extracellulaire contient 1mM Ca²⁺

à pH7,4, les courants transitants par ces canaux mutées sont supérieurs à ceux transitant par les canaux sauvages. Ces résultats sont contradictoires par rapport à nos données obtenues par patch-clamp en cellule entière sur les HEK293. En effet, nous avons démontré que les courants, dans un milieu extracellulaire contenant 2mM Ca²⁺ à pH7,4, transitant par les canaux mutés V170M sont diminués d’environ 80 % comparés à ceux transitant par les canaux sauvages. Ces observations exposent la limite du modèle ovocyte qui reflète probablement moins les conséquences de la mutation V170M que les cellules rénales humaines HEK293.

La mutation V170M n’a qu’un effet limité sur les perméabilités anioniques du CLC-KB.

En revanche, elle altère profondément la sensibilité des canaux au calcium et au pH extracellulaires. En effet, le pKH se déplace vers une valeur acide (6,00 ± 0,11) comparée à celle du CLC-KB sauvage (7,60 ± 0,05). De plus, à pH7,4 la mutation V170M semble rendre le CLC-KB insensible au calcium extracellulaire car nous n’observons aucune augmentation des courants entre 3mM et 20mM Ca²⁺. Cependant, à pH6,0 la mutation V170M entraîne un retour à une sensibilité au calcium extracellulaire. La substitution de la valine 170 en méthionine ne supprime donc pas la sensibilité au calcium externe mais altére plus spécifiquement la sensibilité au pH externe.

En complément des précédentes observations, nous avons analysé les propriétés de régulation de mutants artificiels à la position 170 afin de vérifier si les altérations observées pour le mutant V170M sont bien dues à l’acide aminé substitué. La substitution de la valine 170 en sérine ou en isoleucine présente un profil intermédiaire comparé à la substitution en méthionine. Ceci démontre l’impact crucial de la substitution de la valine 170 par une méthionine sur la sensibilité au pH externe du CLC-KB.

La valine 170 étant très proche de la valine 166 qui, chez tous les autres CLC, correspond au « gating glutamate » responsable du gating des protopores, il nous a semblé nécessaire d’explorer les conséquences fonctionnelles de la substitution de la valine 166 en méthionine et alanine. Nous avons constaté que ces mutations n’entraînent pas les conséquences fonctionnelles spectaculaires que nous avons observées par la substitution de la valine 170 en méthionine.

Quatre patients portent la mutation V170M seulement sur un de leurs deux allèles et montrent une autre mutation sur leur autre allèle (large délétion, Y236X, G433E et E643G) dont trois d’entre-elles représentent clairement des mutations « perte de fonction ». Or, nous avons démontré que la mutation G433E ne laisse subsister aucune activité électrique : le niveau de production de courant n’est pas significativement différent de celui produit par les ovocytes non injectés. Par ailleurs, nous avons également observé que les mutants G433E ne sont pas exprimés à la membrane plasmique des ovocytes de xénope. Nous avons étudié la combinaison des mutations V170M et G433E dans l’ovocyte de xénope. Les courants portés par la combinaison des deux mutations ne sont pas significativement différents des courants portés par la mutation V170M dont la quantité d’ARN a été réduite de moitié.

L’expression à la membrane plasmique de la combinaison des deux canaux mutés n’est pas

significativement différente de celle du canal muté V170M dont la quantité d’ARN a été réduite de moitié. De plus, la sensibilité au pH et au calcium extracellulaires des mutants combinés est identique à celle du mutant V170M seul. L’ensemble de ces résultats semble donc indiquer qu’aucune interaction ne se produise entre les canaux V170M et les canaux G433E.

En conclusion, cette étude d’une mutation fréquente du CLC-KB, V170M, localisée dans une region importante pour la sélectivité et le gating de tous les CLC, montre une caractéristique jamais décrite pour une mutation du CLC-KB. En effet, cette mutation entraîne à la fois un défaut d’expression à la membrane plasmique mais également, et de façon surprenante, une altération du gating. Cette altération du gating tend à rendre les canaux mutés « hyperactifs » sous des conditions physiologiques (en effet, dans un milieu extracellulaire contenant 1mM Ca²⁺ à pH7,4, la conductance des canaux mutés est doublée en compaison de celle des canaux CLC-KB sauvages), tandis que la diminution d’expression à la membrane plasmique tend à réduire le nombre de canaux mutés « hyperactifs ». Ces deux observations sont en accord avec le phénotype modéré des patients présentant la mutation V170M. D’un point de vue mécanistique, la mutation ne semble pas altérer directement le site proton, ni les sites calciques.