SECTION 2 L A SPECTROMETRIE DE MASSE SUPRAMOLECULAIRE
II. Etude d’interactions non-covalentes par spectrométrie de masse
5. Reflet de l’équilibre en solution lors de l’analyse en phase gazeuse
Le KD peut être déterminé par une régression non-linéaire sur les données [L]0 et fbound en utilisant l’équation quadratique classique, où [L]0 est la variable entrée en abscisse et fbound, la variable entrée en ordonnée.
4.4.2. Constante de vitesse de dissociation (koff)
koff est la constante de 1er ordre de dissociation, elle s’exprime en s-1. koffest directement relié au temps de demi-vie du complexe :
ݐ
ଵȀଶൌ
୪୬ ଶ
Ce temps t1/2 correspond au temps au bout duquel 50% du complexe initialement présent est dissocié.
4.4.3. Constante de vitesse d’association (kon)
kon est la constante d’association bimoléculaire de 2ème ordre, elle s’exprime dans la dimension d'une concentration par unité de temps, en unités M-1. s-1. Cette constante a une limite supérieure due au fait que deux molécules doivent d’abord diffuser et se rencontrer avant de pouvoir interagir. Pour deux molécules en diffusion libre, ç.à.d. se déplaçant librement en solution par mouvements browniens, la valeur maximale pour kon, en d'autres termes la limite de diffusion, est d’environ 1.108 à 1.109 M-1. s-1(144).
l’évaporation du solvant, entraîne une mesure de KD apparent sous-estimée par rapport au KD
en solution, correspondant à une affinité plus forte. Cependant, si les taux d’association et de réaction inverse sont lents comparés au temps d’évaporation de la gouttelette, on peut s'attendre à un bon accord entre les valeurs de KD mesurées en phase gazeuse et en solution.
En nanoéletrospray, il a été établi par Peschke et ses collaborateurs (2004) que la première génération de gouttelettes issues de l'electrospray était la source majeures d’ions (145). Même en prenant le taux d’association le plus rapide, à savoir la limite de diffusion dans l’eau pour la réaction P+L → PL, il a été montré que ce temps est trop court pour qu’un nouvel équilibre correspondant à l’augmentation de la concentration des solutés provoquée par l’évaporation du solvant ait lieu. Comme les protéines sont de grande taille, la vitesse de diffusion dépend essentiellement de la diffusion du ligand, et la constante d’association à la limite de diffusion diminue lorsque la taille du ligand augmente. Des ligands de taille moyenne comme l’adénosine diphosphate/triphosphate, avec des constantes d’association à la limite de diffusion kon compris entre 106 et 107 M-1.s-1, sont trop lents pour engendrer un écart d’équilibre qui donnerait une erreur significative sur la détermination de KD (136). Ainsi, pour le nanospray, une déviation de l’équilibre n’est pas attendue pour des ligands qui ne sont pas trop petits (145).
En combinant des mesures de fluorescence et d’anémométrie de phase Doppler, le groupe de Zenobi a par la suite confirmé ces résultats dans le cas d’une source ESI en suivant l’évolution de la concentration en analyte et de la proportion de complexes à différents stades de la vie des gouttelettes chargées (146). D’après leurs travaux, il apparaît que dans des conditions usuelles, le processus ESI ne provoque pas de distorsion significative des équilibres chimiques en solution.
5.2. La conservation des interactions non-covalentes dépend du type d’interactions
La nature de l’interaction non-covalente a un effet sur sa résistance à la dissociation en phase gazeuse. Les interactions électrostatiques sont renforcées dans le vide. En 1995, Feng et ses collaborateurs ont étudié la liaison d’une spermine fortement basique à un peptide SBP (spermin-binding peptide) (147). Malgré une constante d'équilibre de dissociation élevée (100 µM en solution), le complexe SBP/spermine a pu être détecté par ESI-MS. De plus, le complexe a été inhabituellement stable en phase gazeuse, ce qu’ils ont montré avec des expériences de CID. Alors que l’énergie de collision a été augmentée, la dissociation de
liaisons covalentes est observée avant celle du complexe non covalent car, en absence d'effet d'écrantage des charges par le solvant, un environnement sans solvant augmente la stabilisation coulombienne de charges opposées (147).
Les complexes avec des oligonucléotides impliquent usuellement des forces plutôt électrostatiques. Des études de complexes protéine/ADN (148) et de complexes ARN/aminoglycoside (140), sont des exemples où la dissociation du complexe en phase gazeuse est très difficile à obtenir, c’est-à-dire, les ions multichargés du complexe sont stables à de fortes énergies de collision dans l’interface.
À l’extrême opposé, le travail de Robinson et al. (149) avec la protéine liant l’acyl coenzymeA et des analogues d’acyl coenzyme A, a illustré un exemple où les données ESI- MS ne reflètent pas les résultats observés en solution. Les analogues d’acyl coenzyme A qui présentaient des KD différents en solution ne présentent plus de différence dans les expériences ESI-MS (149). Une combinaison d’interactions hydrophobes, électrostatiques et de van der Waals maintiennent l’interaction protéine/ligand dans cet exemple. Des changements de la longueur de la chaîne carbonée de l’acyl, qui affectaient fortement la liaison en solution, ne semblent plus affecter la stabilité du complexe en phase gazeuse.
De la même manière, les stabilités en phase gazeuse de complexes non-covalents entre l’anhydrase carbonique bovine et des inhibiteurs para-substitués de benzenesulfonamide ne montrèrent aucune corrélation avec l’hydrophobicité des inhibiteurs (150). Pourtant les constantes de taux de dissociation en solution étaient bien corrélées avec l’hydrophobicité pour le même système. Robinson et ses collaborateurs notaient, en 1996, que pour les interactions qui relevaient principalement d’effet hydrophobe, la fraction de complexe observé en MS était faible (≤ 20%) (149). Il faut donc prendre ce phénomène en considération dans l’interprétation des résultats d’ESI-MS.
D’autres études ont suggéré que les complexes conservaient une stabilité similaire en passant de la solution à la phase gazeuse. Ainsi l’étude de Hunter et al., en 1997, sur la liaison de l’hème à différentes formes d’apomyoglobine ou d’apocytochrome b5 a montré des résultats en MS comparables aux données cinétiques obtenues en solution (151). L’étude de Kraunsoe et al. sur la trypsine avec une variété d’inhibiteurs a montré par CAD que l’ordre des affinités de liaison en MS reflétait bien celui observé en solution (152).