La voie de signalisation Keap1/Nrf2/ARE

Le complexe Keap1/Nrf2 est présent dans la plupart des types cellulaires et régule l’expression de gènes antioxydants et d’enzymes de détoxification de phase 2. En condition « basale » le facteur de transcription Nrf2 est inactif, lié à Keap1 et dégradé par polyubiquitinylation par la culline 3 (Figure 6). Keap1 contient de nombreux résidus cystéinyls, et en réponse à un stress oxydant, le complexe Nrf2-Keap1 se dissocie et Nrf2 s’accumule dans le noyau où il agit sur des gènes impliqués dans l’homéostasie du potentiel redox via les séquences ARE (pour « Antioxydant Réponse Elément ») présents sur les gènes, comme par exemple celui de la catalase et de l’hème oxygénase 1 (pour revue, Dinkova-Kostova et coll., 2005).

61 Figure 6 : Vue générale de la voie de signalisation Keap1/Nrf2/ARE (D’après Natsch, 2010).

De par la capacité de la voie Keap1/Nrf2/ARE à détecter les électrophiles, principales propriétés commune à la plupart des haptènes, son rôle dans la transduction du signal induit par les haptènes a donc été étudié. Le DNFB induit, dans les mono-DCs, l’expression de plusieurs gènes sous le contrôle de séquence ARE (Ryan et coll., 2004). Natsch et Emter (2008) utilisent un modèle de lignée AREc32 dérivée des cellules tumorales mammaires MCF7, stablement transfectée par le gène rapporteur de la luciférase placé sous le contrôle de huit séquences ARE et montrent, en testant 102 substances, que la plupart des sensibilisants induisent une activité luciférase contrairement aux non- sensibilisants et irritants. Ces travaux viennent d’être validés en utilisant la lignée kératinocytaire humaine HaCaT, afin de se rapprocher un peu plus des conditions cutanées (Emter et coll., 2010).

Ces résultats sont confirmés dans d’autres modèles de DCs : des CD34⁺-DCs et des THP-1 traitées par le DNCB, le nickel et le pPD montrent une accumulation de Nrf2 et l’expression des gènes hmox1 et nqo1 placés sous le contrôle de séquence ARE (Ade et coll., 2009). L’accumulation de Nrf2 induit par le DNCB dans les THP-1 a également été démontré (Megherbi et coll., 2009). D’autres observations indirectes supportent l’hypothèse de l’implication de la voie Keap1/Nrf2/ARE dans l’activation des DCs. L’IL-8, une des principales cytokines sécrétées en réponse aux allergènes, est sous le contrôle de Nrf2 (Zhang et coll., 2005). Cette voie de signalisation Keap1/Nrf2/ARE, induite par un stress oxydant, fait actuellement l’objet d’un vif intérêt pour la discrimination des allergènes par rapport aux irritants (Natsch et coll., 2009; 2010).

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Dans le contexte actuel où le 7éme amendement de la directive cosmétique européenne prévoit l’interdiction du modèle animal pour le test de substances potentiellement sensibilisantes, le développement de méthodes alternatives devient une nécessité pour les industriels. L’utilisation de modèles cellulaires pour la discrimination des allergènes versus des non-sensibilisants/irritants semble être, parmi les nombreux modèles proposés, une voie prometteuse.

Les travaux présentés ici sont réalisés sur un modèle de culture primaire (mono-DCs) et une lignée promyélomonocytaire (U937) prédisposée pour être utilisée dans les tests de sensibilisation in vitro. Le but de ce travail est de mieux caractériser les événements précoces de la signalisation intracellulaire induite par des allergènes. La compréhension des mécanismes impliqués in vitro dans l’activation des DCs devrait permettre de mieux appréhender la manière de discriminer un allergène d’un irritant. Plus particulièrement, le rôle du stress oxydant dans l’activation des DCs induite par des allergènes a été étudié.

Ces travaux se sont essentiellement focalisés sur la réponse des mono-DCs et des U937 au thimerosal, un composé mercurique possédant un pouvoir sensibilisant mais dont les effets sont bien moins décrits que ceux du DNCB et du nickel. Depuis plusieurs années, de nombreux auteurs ont mis en avant le danger de l’exposition à des métaux toxiques comme le mercure. Le mercure est un métal lourd, qui existe sous plusieurs formes : le mercure métallique élémentaire (noté Hg°), le mercure inorganique que l’on retrouve sous forme gazeuse ou ionique appelé atome de mercure (notés Hg²⁺) et le mercure organique, combiné avec une molécule contenant du carbone (éthyle et méthyle mercure par exemple).

Le thimérosal, aux propriétés anti-bactériennes et anti-fongiques, est composé d’éthyle mercure (EtHgCl) et peut être aussi appelé thiomersal ou merthiolate. Il est composé d’approximativement 49,6% (en masse) d’EtHgCl, et se dissocie en EtHgCl et acide thiosalicylique (TSA) non mercurique. Le thimérosal est retrouvé dans de nombreux agents antiseptiques, et est utilisé comme conservateur dans les préparations à usage ophtalmique, dans les cosmétiques, dans les préparations antigéniques utilisées dans le cadre de diagnostics d'allergies, les antivenins et dans de nombreux vaccins (Geier et coll., 2007).

C’est sa présence dans les vaccins qui a notamment fait l’objet d’une grande attention. Le thimerosal est retrouvé dans la vaccination anti-diphtérique, anti-tétanique, anti-coquelucheuse et dans les vaccins contre la grippe, et tout particulièrement d’actualité, dans le vaccin contre le virus A(H1N1). On le retrouve habituellement à 0,01% (247 µM), correspondant à 25 µg de thimérosal par dose de 0,5 ml (www.afssaps.fr; www.eurosurveillance.org; www.fda.gov; www.vaccinesafety.edu).

Un enfant reçoit en moyenne durant ses premières années de vie, une série de vaccins qui l’expose à des doses de mercure bien supérieure à ce que recommande l’Agence de Protection Environnementale

63 (Agrawal et coll., 2007). L’exposition au mercure, et plus particulièrement au mercure organique, peut induire des troubles neuro-développementaux comme un retard de langage, l'hyperactivité avec déficit de l'attention et même l'autisme (Geier et Geier, 2005). D’autre part, l’administration de vaccins peut déclencher des réactions d’hypersensibilité au thimérosal qu’ils contiennent (Zenarola et coll., 1995;

Goncalo et coll., 1996; Patrizi et coll., 1999; Suneja et Belsito, 2001; Lee-Wong et coll., 2005). Des études synthétisant les résultats de patch-tests dans différents pays révèlent une sensibilité au thimerosal chez de nombreux patients et le classe même comme le deuxième allergène le plus courant après le nickel (Goon et Goh, 2006; Wattanakrai et Rajatanavin, 2007; Tudela et coll., 2008; Cheng et coll., 2008; Hammonds et coll., 2009). Bien que quelques patients réagissent à la partie non mercurique du thimérosal, le TSA, la partie sensibilisante de la molécule est principalement l’EtHgCl (Goncalo et coll., 1996).

L’allergie aux métaux tels que le nickel et le mercure est bien documenté (Garner, 2004), cependant seules quelques d’études ont investit le rôle du thimérosal sur le système immunitaire, ou principalement sur des modèles murins. L’effet du thimérosal sur les DCs, et même plus généralement ceux d’autres dérivés de mercure, a été peu étudié malgré le rôle clé de ces cellules dans l’initiation des réactions allergiques. Le thimérosal est un réactif perméable aux membranes cellulaires qui possèdent la propriété de réagir avec les groupements sulfhydryles. Le thimérosal perturbe l’homéostasie calcique (Elferink, 1999) et dans les cellules T, perturbe les défenses antioxydantes telles que le GSH en produisant des ERO (Makani et coll., 2002). L’EtHgCl qu’il contient, en tant que métal, est également un agent oxydant producteur d’ERO (Ercal et coll., 2001). Le thimerosal induit la phosphorylation des résidus tyrosine des mono-DCs de manière similaire à l’allergène fort MCI/MI (Bruchhausen et coll., 2003) et induit dans ces cellules une réponse de type Th2, associée à une déplétion du GSH intracellulaire (Agrawal et coll., 2007). Par ailleurs, le thimérosal induit l’apoptose des U937 par une voie dépendante des caspases et du stress oxydant (Woo et coll., 2006). Des travaux récents réalisés par l’équipe du Dr. Serres montrent que le thimerosal active p38 MAPK et JNK et inhibe Erk1/2 dans les mono-DCs, comme le DNCB. Dans cette étude, l’utilisation de l’antioxydant N-acetyl-L-cystéine (NAC) a permis de révéler le rôle du stress oxydant dans l’activation de p38 MAPK et dans l’activation des DCs en réponse au thimerosal (Trompezinski et coll., 2008, article présenté en annexe).

Au vu de ces données, le but de la première partie de ce travail (article 1 et 2) a été de mieux caractériser les effets du thimérosal sur les DCs, en comparaison au DNCB. Plus spécifiquement, le rôle du stress oxydant a été étudié. Ce dernier est caractérisé par une production d’ERO associée le plus souvent à une diminution des fonctions antioxydantes. Les travaux présentés ici s’appuient sur cette définition. Ils étudient d’une part la production d’ERO induite par le thimerosal, son dérivé mercurique l’EtHgCl mais aussi par d’autres composés mercuriques (méthyle mercure(II), thiocyanate de mercure(II), chlorure de mercure(II)) et d’autre part, étudient la déplétion du principal antioxydant

64 intracellulaire, le glutathion (GSH). Comme la mitochondrie est la principale source d’ERO, son rôle ainsi que l’état de polarisation de sa membrane (ΔΨm) ont été étudiés. L’implication du stress oxydant dans l’activation des DCs induites par les composés de mercure et les allergènes est mise en évidence par l’utilisation d’antioxydants.

Dans une dernière partie (article 3), les travaux ont porté sur l’étude du mécanisme d’apoptose induit par le thimerosal et l’allergène DNCB dans la lignée U937 et son rôle éventuel dans l’induction du CD86. L’implication du stress oxydant et de p38 MAPK dans l’apoptose induite par les allergènes a été déterminée et la relation entre apoptose et expression du CD86 a été étudié par le biais d’inducteurs et d’inhibiteurs d’apoptose.

Cette étude de la signalisation rédox induite par le thimerosal et le DNCB a été complétée par des travaux sur le calcium, et la mesure de l’influx calcique après exposition des U937 à ces allergènes a été réalisée. La relation entre stress oxydant et calcium est discutée (article 2 et 3).

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