Luna-Acosta A, Rosenfeld E, Amari M, Fruitier-Arnaudin I, Bustamante P, Thomas-Guyon H (2010) First evidence of laccase activity in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Luna-Acosta A, Fruitier-Arnaudin I, Barthélémy C, Bustamante P, Thomas-Guyon H (2008) Identification of molecular immune-related biomarker in the Pacific oyster Crassostrea gigas.
Sigles et abréviations
Avant-propos
- Contexte de l’étude
- Problématique
- Objectifs
- Stratégie de l’étude
- Organisation du manuscrit
- Identification des activités phénoloxydase chez Crassostrea gigas et implication dans les mécanismes de défense
- Partie 2 : Implication potentielle des activités phénoloxydase dans les mécanismes de défense de Crassostrea gigas
- CHAPITRE 2 : Potentiel des phénoloxydases comme biomarqueurs de l’exposition à des contaminants organiques : Expérimentation in vivo
- CHAPITRE 3 : Potentiel des phénoloxydases comme biomarqueurs de stress environnemental, dans des études de biosurveillance in situ
- Partie 2 : Implication des phénoloxydases dans les mécanismes de défense immunitaire de Crassostrea gigas
- Annexe 1 : Matériels et méthodes relatifs au protocole optimisé du dosage des phénoloxydases chez Crassostrea gigas
- Characterization of tissue-specific phenoloxidase activities in the Pacific oyster Crassostrea gigas
- Detection of early effects of a single herbicide (diuron) and a mix of herbicides and pharmaceuticals (diuron, isoproturon, ibuprofene) on
- Annexe 9 : Biological effects of persistent organic pollutants in juveniles of the Pacific oyster Crassostrea gigas: a transplantation study in the French
43 Partie 1 : Optimisation du protocole de dosage, identification et caractérisation partielle des phénol oxydases dans différents tissus……. 119 CHAPITRE 3 : Potentiel des phénol oxydases comme biomarqueur de stress dans les études de biosurveillance in situ……….
95 Figure 32 Effet du HLS brut et de l'inhibiteur spécifique de PO, PTU, sur la croissance de V. 96 Figure 33 Effet des fractions protéiques partiellement purifiées de HLS et de l'inhibiteur spécifique de PO, PTU, sur la croissance de V.
Liste des tableaux
143 Tableau 35 Résultats du test de corrélation de rang de Spearman sur les réponses biologiques de différents tissus de Crassostrea gigas transplantés en différents endroits de la côte atlantique française pendant trois mois en été …………. 147 Tableau 37 Résultats des tests de corrélation des rangs de Spearman sur les réponses biologiques de différents tissus de Crassostrea gigas transplantés en différents endroits de la côte atlantique française au cours de l'année……….
Introduction générale
Au sein de l’organisme, ces composés peuvent se bioaccumuler5, c’est-à-dire se bioconcentrer6 ou se bioamplifier7 à des niveaux supérieurs à ceux de la contamination de l’environnement physique. Les mortalités estivales peuvent être associées à un affaiblissement des capacités de défense de l'hôte et/ou à une augmentation de la présence et/ou de la virulence des pathogènes C..
Etat de l’art
Le modèle biologique : l’huître creuse Crassostrea gigas
- Taxonomie et répartition
- Ecologie
- Biologie
- Anatomie
- Les systèmes circulatoire, nerveux, respiratoire et digestif
- L’ostréiculture
- Les mortalités estivales
La ponte des femelles a lieu une ou plusieurs fois par été lorsque la température de l'eau est supérieure à 18°C. Les autres composants du système digestif (un estomac, une glande digestive, un intestin et un anus) sont contenus dans la masse viscérale située dans la partie dorsale.
Les mécanismes de défense chez Crassostrea gigas
- Protections mécaniques
- La reconnaissance du non-soi
- La réponse immunitaire innée
- La réponse immunitaire innée à médiation cellulaire
- La réponse immunitaire innée à médiation humorale
Chez d'autres espèces d'invertébrés, des protéines de reconnaissance des peptidoglycanes provenant de bactéries Gram-(+) appelées PGRP (protéines de reconnaissance des peptidoglycanes) ont également été signalées (Yoshida et al. 1996). Par la suite, chez les invertébrés, la dégranulation des hémocytes permet la libération de protéines impliquées dans les mécanismes de défense telles que les agglutinines, les peroxynectines, les enzymes cytolytiques, les enzymes du système pro-phénoloxydase (proPO) et les peptides antimicrobiens dans l'hémolymphe ou au niveau du site d'infection ou de blessure. (Söderhäll & Cerenius 1998, Cerenius et al.2008).
Protoxyde d'azote synthase ou NO synthase : Elle catalyse la production de protoxyde d'azote qui agit comme un agent antibactérien et antitumoral (Arumugan et al. 2000). L'oxyde nitreux combiné aux anions superoxydes produits lors de la phagocytose génère l'anion peroxynitrique (ONOO-), un composé labile et hautement toxique (Figure 11).
CAT / GPxSOD
ONOO •NO synthase
Présence d’une réponse immunitaire adaptative chez C
La présence de récepteurs spécifiques tels que les PRP (pathogen reconnus protéines) (Rowley & Powell 2007), puis l'identification du phénomène de sensibilisation26 (priming), semblent indiquer la présence d'une réponse spécifique chez les invertébrés (Rowley & Powell 2007). . 26 Prise de conscience : Après une exposition répétée à une situation stimulante et contrairement à l'habituation, l'amorçage (ou prise de conscience) correspond à une augmentation de la réponse d'alarme.
La réponse aux xénobiotiques
Contaminants affectant les mécanismes de défense chez Crassostrea gigas
- Pesticides
- Organo-étains
- PBDE et PPSP, des contaminants émergents
D'autre part, les organophosphates comme le glyphosate sont capables de moduler l'expression de gènes impliqués dans diverses fonctions biologiques, notamment les mécanismes de défense immunitaire (Tanguy et al. 2005). Les PCB, et en particulier les PCB 47, 153 et 77, ont des effets sur divers paramètres hémocytaires des bivalves marins (Canesi et al. 2003).
Les biomarqueurs et le stress environnemental
La structure et le fonctionnement de l'écosystème dans son ensemble peuvent donc être modifiés (Figure 14 ; Moore et al. 2004b). Les biomarqueurs pertinents de l'exposition et/ou de l'effet de la contamination sont des indices sensibles de. 30 Biomarqueurs d'effet : indiquent l'effet, toxique ou non, exercé par le contaminant sur une cible critique de l'organisme. 2000, De Lafontaine et al. a proposé une nouvelle classification qui permet de distinguer les biomarqueurs 1) de défense et 2) de dommages.
- Généralités sur les PO et la mélanisation
- Les principaux rôles de la mélanine chez les être vivants
- Les phénoloxydases, enzymes-clé de la mélanisation
- Aspects biochimiques des phénoloxydases
- Classification des phénoloxydases
- Structure des phénoloxydases
- Le système prophénoloxydase chez les invertébrés
- Le mécanisme d’activation
- Principales méthodes utilisées pour étudier l’effet des contaminants sur les phénoloxydases des bivalves
- Approches cellulaires
- Approches moléculaires
- Approches biochimiques
- Les substrats des phénoloxydases
- Les substrats des phénoloxydases et leur interférence avec d’autres protéines
- Les inhibiteurs des phénoloxydases
- Les activateurs des phénoloxydases
- Localisation cellulaire et tissulaire des phénoloxydases chez les bivalves
- La structure quaternaire et le poids moléculaire des phénoloxydases chez les bivalves
- Les méthodes utilisées pour déterminer la structure des phénoloxydases chez les bivalves
- La purification
- La zymographie
- La spectrométrie de masse
Cependant, récemment, un mécanisme d'activation de la proPO a été proposé par Cerenius et al. 2008) chez les crustacés et plus particulièrement chez les écrevisses (Figure 21). Ils ont une activité oxydase dépendante du cuivre mais n'ont été démontrés, à notre connaissance, que chez les vertébrés (Schosinsky et al. 1974). Ainsi, bien que la PO et les hémocyanines aient un site actif commun, elles jouent des rôles différents (Decker et al. 2007).
DEMARCHE SCIENTIFIQUE ET PRINCIPAUX RESULTATS
Optimisation du protocole de dosage des phénoloxydases chez Crassostrea gigas
- L’approche cinétique
- Les inhibiteurs de protéases et leur interférence avec le dosage
- Le choix du tampon
- La définition de l’activité enzymatique et de l’unité d’activité enzymatique spécifique
La composition du tampon est également très importante pour mesurer l’activité enzymatique d’intérêt. Tampon CAC 0,01 M, utilisé pour évaluer l'activité PO dans le protocole de Hellio et al. Les activités enzymatiques ont été calculées sur la base de la définition suivante : une unité d'activité enzymatique de PO correspond à une augmentation de l'absorbance de 0,001.
Identification des activités phénoloxydase dans le plasma de Crassostrea gigas
- Utilisation de différents substrats des phénoloxydases
- Utilisation de différents inhibiteurs des phénoloxydases
Puisque les résultats de l'oxydation enzymatique (en présence de l'activateur) sont systématiquement corrigés par rapport aux résultats de l'autoxydation. En revanche, une augmentation de l'activité PO n'entraînant pas d'inhibition de l'autoxydation a été observée en présence de trypsine-TPCK (à 0,10 mg.ml-1) avec PPD comme substrat. L'optimisation du protocole de dosage de PO dans le cadre de cette thèse a permis de répondre à diverses questions concernant l'activité des espèces PO présentes dans le plasma de C.
Identification et caractérisation partielle des activités PO dans d’autres compartiments hémolymphatiques et tissus
- Identification des activités phénoloxydase dans d’autres compartiments hémolymphatiques, les hémocytes
- Identification des activités phénoloxydase dans d’autres tissus : les branchies, la glande digestive, le manteau et le muscle
- Caractérisation des phénoloxydases chez C. gigas
Tous les résultats suggèrent que les activités catécholase et laccase sont présentes dans les muscles, tandis que les activités laccase sont présentes dans les branchies, la glande digestive et le manteau (tableau 16; annexe 3). Ces homologies observées avec des protéines majoritairement présentes dans les tissus (actine, myosine, cavortine) pourraient ainsi masquer la présence de PO, de poids moléculaire relativement équivalent, qui migrerait au même niveau que ces protéines majoritaires. 88 Tableau 17 Résumé de l'identification et de la caractérisation des activités de type PO dans les tissus et les compartiments hémolymphatiques de Crassostrea gigas.
CONTEXTE SCIENTIFIQUE
Le rôle du système proPO chez les invertébrés
D'autres pathogènes, comme les espèces bactériennes, V. 2004, Garnier et al. 2007) étaient également souvent associés à des épisodes de mortalité estivale de C. gigas. Cependant, à notre connaissance, aucune étude n'a été menée sur l'effet de ces infections 1) sur l'expression du gène codant pour la laccase chez C. gigas ou 2) sur le mode d'action de la PO dans les mécanismes de défense immunitaire de C.
L’infection par les Vibrio chez C. gigas associée aux évènements de mortalités estivales
L'inhibition transitoire de l'activité PO chez l'hôte semble jouer un rôle important dans l'infection à Perkinsus marinus. In vivo 4 jours Hc ↓ 75 et 50 % de l'activité PO chez les huîtres diploïdes et triploïdes exposées à A. Avec l'inhibiteur de PO, PTU, l'activité antibactérienne du HLS est inhibée en présence de PPD mais pas de L-DOPA, suggérant l'implication de l'activité laccase dans l'inhibition de la croissance bactérienne (Figures 31, 32 et 33 ; Annexe 4).
Potentiel des phénoloxydases comme biomarqueurs de l’exposition à des contaminants
- Comportement de l’activité phénoloxydase en présence de contaminants chimiques
- Modulation de l’activité constitutive par les contaminants chimiques
- Modulation de l’activité stimulée et de l’activité induite par les contaminants chimiques
- Saturation ou inhibition des phénoloxydases
- Les herbicides et les molécules pharmaceutiques
Nilles et coll. 2010 PCRq (expression relative de l'ARNm correspondant au gène codant pour la laccase). Nous avons également suivi l'expression de certains gènes impliqués dans les mécanismes de défense chez C. Deuxièmement, nous avons étudié l'activité PO chez des huîtres juvéniles exposées au diuron (5 µg.l-1), à l'isoproturon (5 µg.l-1) et à l'ibuprofène ( 5 µg ) .l- 1) pendant 6 heures.
Dans un premier temps, nous avons étudié les modulations de l’activité PO chez de jeunes huîtres exposées à 20 g d’huile légère arabe34 à 110°C (BAL 110). De plus, les activités catécholase et laccase sont corrélées à la teneur en HAP des tissus des huîtres (tableau 26 ; annexe 6). Concernant les activités PO, les résultats ont révélé une augmentation de l'activité laccase et surtout de l'activité catécholase après 10 jours d'exposition à des boues contaminées par des hydrocarbures (Annexe 7).
Potentiel des phénoloxydases comme biomarqueur de stress dans des études de
Implication des facteurs environnementaux dans les variations saisonnières des activités phénoloxydase
- Variations physiologiques saisonnières de l’activité phénoloxydase
- Facteurs environnementaux susceptibles de moduler l’activité phénoloxydase
Il a été suggéré que la redistribution de l'énergie vers la reproduction entraînerait une diminution des capacités de défense à cette période de l'année et pourrait faciliter l'infection à V. Toutes ces études montrent alors qu'il est très important de connaître les changements saisonniers des biomarqueurs. , surtout s'ils sont utilisés pour surveiller la présence et/ou l'effet de contaminants in situ. Les réponses biologiques impliquées dans les mécanismes de défense peuvent ainsi offrir une vision holistique de l’effet des contaminants sur les organismes exposés à différentes sources de stress.
BOY LP
En revanche, l’activité catécholase dans le plasma est positivement corrélée (rs=0,70, p<0,01) avec la teneur en HAP des huîtres. 144 Concernant les PCB, l'activité des catécholases dans la glande digestive est négativement corrélée à la teneur en PCB des huîtres (rs=-0,60, p<0,01). Au contraire, l'activité des laccases dans la glande digestive, dans le pelage et dans le plasma est positivement corrélée à la teneur en PCB (rs et 0,57, respectivement, p < 0,01).
Discussion générale et conclusions
Rôle des phénoloxydases chez C. gigas
Ces corrélations semblent indiquer que les PO peuvent jouer différents rôles dans les mécanismes de défense de C. gigas. De cette manière, la mesure de l’activité PO pourrait détecter une activation anormale du système immunitaire. De plus, en raison de ces propriétés oxydoréductrices, et sur la base des corrélations positives obtenues entre les activités PO et les activités CAT, GPx et SOD et/ou les niveaux de contaminants dans les huîtres, la PO pourrait jouer un rôle antioxydant dans vs.
Limitations à utiliser les phénoloxydases chez Crassostrea gigas comme biomarqueurs de stress
Ainsi, les corrélations positives observées dans notre étude entre les activités de la PO et la teneur en contaminants dans C. Si la PO a un rôle antioxydant, l'inhibition de la PO peut conduire à l'apparition d'effets génotoxiques (Nappi & Vass 2001). De plus, on ne peut pas dire dans quelle mesure la modulation observée de l’activité de PO serait hors des limites de l’homéostasie.
Avantages à utiliser les phénoloxydases chez Crassostrea gigas comme biomarqueurs de stress environnemental
Ensuite, si les OP jouent un rôle dans la détoxification des contaminants, l'inhibition de ces activités enzymatiques peut affecter le métabolisme des contaminants favorisant leur élimination. Enfin, les OP semblent jouer trois rôles principaux : 1) un rôle immunitaire, 2) un rôle antioxydant et 3) un rôle détoxifiant. Dans ce contexte, l’OP peut jouer un rôle immunitaire, un rôle antioxydant ou encore un rôle détoxifiant.
Perspectives
Existe-t-il un lien entre une immunité réduite et la mortalité estivale et les polluants qui en résultent ? Relier les effets immunosuppresseurs des polluants et spécifiquement des activités PO à la survenue de la mortalité estivale. Le suivi d'autres paramètres comme l'état reproducteur de l'animal, la qualité et la quantité de nourriture présente dans l'environnement, la température et la salinité, entre autres, permettrait de mieux comprendre d'autres causes de modulation des activités des OP.
Quels contaminants sont susceptibles de réduire cette immunité ?
Ainsi, des études comparatives sur les effets des contaminants sur les activités PO endogènes et stimulées pourraient être menées, dans le but de déterminer à quel niveau le système proPO serait affecté. Des études avec d'autres polluants tels que des métaux ou des biocides présents dans les peintures antifouling permettraient ainsi d'avoir une vision plus large sur les effets des polluants pouvant être présents dans l'environnement sur les activités des PO et sur d'autres paramètres impliqués dans les mécanismes de défense de C. sur l'environnement. performances physiologiques de l'animal et notamment sur la défense immunitaire de l'hôte (besoin primordial de contrôles positifs).
Bharathi N, Ramalingam K (1983) Electrophoretic study of the enzyme phenoloxidase from the enzyme gland in the foot of Perna viridis Linnaeus. Coles J, Pipe R (1994) Phenol oxidase activity in the hemolymph and hemocytes of the marine mussel, Mytilus edulis. Cheng W, Chen J-C (2000) Effects of pH, temperature and salinity on the immune parameters of the freshwater shrimp Macrobrachium rosenbergii.
