Sebastien Poulain

Caractérisation de l'activité microbiologique de l'argile à Opalinus du Mont Terri et de l'argilite du Callovo-Oxfordien de Meuse/Haute-Marne - Rapport d'activité 2003-2004. Stockage géologique profond de déchets HV : Détection et identification de micro-organismes autochtones dans les argilites du Mont Terri et de Meuse/Haute-Marne.

INTRODUCTION

C ONTEXTE SCIENTIFIQUE

P LAN DE LA THESE

La loi de 1991 a permis la création d'un établissement public chargé de la gestion à long terme des déchets radioactifs : l'Andra ou l'Agence nationale de gestion des déchets radioactifs. État de l'art en microbiologie des milieux souterrains profonds et des sites expérimentaux pour l'étude de la faisabilité du stockage géologique des déchets radioactifs.

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

E NFOUISSEMENT REVERSIBLE DES DECHETS RADIOACTIFS MHA-VL

• Concept de stockage géologique profond
• Laboratoires souterrains de recherche
• Caractéristiques des argilites étudiées

M ICROORGANISMES ET TRANSFERT DE RADIONUCLEIDES

• Interactions microorganismes-radionucléides
• Survie microbienne en conditions simulées de stockage

M ICROBIOLOGIE DES ENVIRONNEMENTS DE SUBSURFACE

• Ecologie microbienne des formations géologiques profondes
• Microbiologie de l'argile à Opalinus et du Callovo-Oxfordien
• Microorganismes et environnements radioactifs

D ETECTION ET IDENTIFICATION MICROBIENNE EN SUBSURFACE

• Méthodes basées sur les techniques de biologie moléculaire
• Autres méthodes de détection directe de microorganismes

O BJECTIFS DE LA THESE

• Enjeux scientifiques de cette étude
• Stratégie envisagée

Cette matière organique pourrait ainsi être protégée de la biodégradation des micro-organismes [Gallori et al., 1994]. Une augmentation de la masse d'eau a été observée dans le puits utilisé lors de l'expérience PAC2001.

MATERIELS ET METHODES

E CHANTILLONS

• Argilite à l'état zéro
• Prélèvements en galerie souterraine
• Echantillons d'eau des expériences géochimiques PAC et DIR

M ICROORGANISMES ET CULTURES

• Souches microbiennes
• Cultures d'enrichissement

P REPARATION DE MELANGES ARGILITE / BACTERIES

T ECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

• Extractions d'ADN
• Amplification d'ADN ribosomique par PCR
• Electrophorèse en gel à gradient d’agent dénaturant (DGGE)
• Analyse des espaces intergéniques ribosomiques (RISA)
• Séquençage d'ADN ribosomique
• Analyses phylogénétiques

M ICROSCOPIE ELECTRONIQUE

A UTRES TECHNIQUES DE CARACTERISATION MICROBIOLOGIQUE

• Colorations de Gram
• Tests d'activité oxydase et catalase

Localisation de la niche PP dans le laboratoire souterrain du Mont Terri où a été réalisé le forage BPC-C1. Procédure d'échantillonnage de la carotte d'argile Opalinus non perturbée extraite du forage BPC-C1 dans le cadre de l'expérience MA. Plan de localisation de la plateforme de forage F1 par rapport au laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne.

Stratégie de prélèvement d'argile par grattage de la paroi de la galerie 4d ​​du laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne. Les tranches marquées d'une croix, situées aux extrémités des échantillons, ont été retirées lors de la découpe. Cultures de micro-organismes allochtones présents dans l'air ambiant et sur les parois de la galerie 4d ​​du laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne 48 heures après fouille (T0).

Localisation de la niche PP du laboratoire souterrain du Mont Terri dans laquelle a été réalisé le forage BPC-C1. Procédure d'échantillonnage de la carotte d'argile Opalinus non perturbée récupérée du forage BPC-C1 dans le cadre de l'expérience MA. Cultures de micro-organismes immigrants présents dans l'air ambiant et sur les parois de la galerie 4d ​​du laboratoire souterrain Maas/Haute-Marne 48 heures après fouille (T0).

MICROORGANISMES AUTOCHTONES DE L'ARGILE A OPALINUS ET

A RGILE A O PALINUS

• Introduction
• Choix des échantillons
• Essais d'extraction directe d'ADN
• Détection et identification de microorganismes en culture
• Caractérisation des souches BPC-C1/20-1 et BPC-C1/31-1

A RGILITE DU C ALLOVO -O XFORDIEN

• Introduction
• Choix des échantillons
• Essais d'extraction directe d'ADN
• Détection et identification de microorganismes en culture

D ISCUSSION

Les fragments intermédiaires obtenus lors de la coupe des sections BPC-C1/20 et BPC-C1/34 ont été utilisés pour des tests d'extraction directe d'ADN. La souche BPC-C1/20-2, appartenant au genre Exiguobacterium, est apparentée à Exiguobacterium aurantiacum, isolée dans une usine de transformation alimentaire [Collins et al., 1983]. Enfin, la souche BPC-C1/34-1, identifiée comme membre de la famille des Microbacteriaceae, présente un pourcentage élevé (>99 %) d'identité de séquence 16S avec Microbacterium testaceum, une bactérie isolée des sols de surface et des rizières [Komagata et Iizuya , 1964].

Ces résultats suggèrent que les isolats BPC-C1/20-1 et BPC-C1/31-1 constituent deux espèces bactériennes jusqu'alors inconnues isolées dans des échantillons d'argile Opalinus non perturbés du Mont Terri. Analyse phylogénétique des souches BPC-C1/20-1 et BPC-C1/31-1 isolées d'échantillons d'argile Opalinus en condition zéro. Les bactéries de la souche BPC-C1/20-1 ont une morphologie en bâtonnets aux contours irréguliers et de longueur variable (0,5 x 1 à 2 µm) et aux arêtes vives.

Observation au microscope électronique à transmission par coloration négative de cellules bactériennes des souches BPC-C1/20-1 et BPC-C1/31-1. D. De même, l'étude approfondie des conditions de culture des souches BPC-C1/20-1 et BPC-C1/31-1 ne fait que commencer. La souche BPC-C1/20-1 appartient probablement au genre Sphingomonas, dont plusieurs membres ont été isolés dans des environnements extrêmes [par exemple Fredrickson et al., 1995 et 1999].

MICROORGANISMES ALLOCHTONES DU SITE SOUTERRAIN DE

• L’O BSERVATOIRE I NTERDISCIPLINAIRE DE L 'EDZ
• I DENTIFICATION DE MICROORGANISMES ALLOCHTONES CULTIVABLES
• E VOLUTION DE LA POPULATION ALLOCHTONE AU COURS DU TEMPS
• D ISCUSSION

Une collection de souches bactériennes et fongiques non indigènes isolées de l'air ambiant et de l'argile murale de la Galerie 4d ​​du Laboratoire Souterrain de Meuse/Haute-Marne. Évaluation de l'identification de souches bactériennes et fongiques isolées dans l'air ambiant et dans l'argile en surface des murs de la galerie 4d ​​du laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne. Evolution des proportions d'UFC bactériennes et fongiques par rapport aux souches de la collection de micro-organismes allochtones obtenue dans la galerie 4d ​​du laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne.

Evolution dans le temps des proportions de colonies bactériennes et fongiques par rapport aux souches majoritairement représentées dans la population immigrée cultivable de la galerie 4d ​​du laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne. Ces résultats très préliminaires semblent indiquer des variations significatives dans la composition de la population microbienne immigrée introduite dans le laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne. Ces expérimentations de caractérisation de la population microbienne immigrée dans le laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne, toujours en cours, seront complétées par l'analyse d'autres échantillons.

La caractérisation de la population microbienne allochtone introduite dans le laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne sera poursuivie avec de nouveaux prélèvements réalisés dans la galerie 4d ​​dans le cadre de l'Observatoire Interdisciplinaire EDZ. Localisation de la galerie 4d ​​du laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne, et fenêtres grattantes FOR1904 et FOR1905 dédiées au suivi de l'introduction de micro-organismes dans le milieu souterrain nouvellement créé. Bilan de l'identification de souches bactériennes et fongiques isolées dans l'air ambiant et dans l'argile du revêtement mural de la galerie 4d ​​du laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne.

CARACTERISATION MICROBIOLOGIQUE D'EAUX PRELEVEES EN

I NTRODUCTION

E XPERIENCE PAC2001

• Principe de l'expérience et objectifs
• Résultats des analyses microbiologiques et discussion

E XPERIENCES DIR 1001, DIR 1002 ET DIR 1003

• Principe des expériences et objectifs
• Résultats des analyses microbiologiques et discussion

C ONCLUSIONS

Analyse RISA de la diversité bactérienne des colonies obtenues à partir de l'échantillon d'eau EST02130F-01 par cultures d'enrichissement. Compte tenu des concentrations élevées de bactéries sulfato-réductrices observées tout au long de l’expérience PAC2001, il nous a semblé probable que les volumes d’eau circulant lors des expériences DIR1001, DIR1002 et DIR1003 fournissaient également des environnements propices au développement de BSR. De plus, la présence de bactéries sulfato-réductrices (SRB) a été détectée dans les échantillons DIR 1001-t29j, DIR 1002-t26j et DIR 1003-t26j, mais pas dans l'eau initialement injectée (DIR H2O-t0+15j). suggérant que ces BSR pourraient également provenir de la roche.

Toutes les analyses microbiologiques réalisées lors des expériences PAC2001, DIR1001, DIR1002 et DIR1003 soulèvent la question de l'origine des souches bactériennes relativement atypiques d'un point de vue génétique détectées lors de ces travaux, ainsi que les modalités de migration bactérienne de la formation géologique vers les forages dans lesquels circule l’eau. L'identification des micro-organismes lors de ces travaux s'est donc généralement basée sur des cultures préalables d'enrichissement microbien, nécessaires pour observer une partie de la diversité microbienne caractéristique des argiles évaluées pour le stockage géologique profond des déchets radioactifs. L'originalité de la séquence ribosomale 16S des souches bactériennes révélée dans l'argile à Opalinus fournit un argument particulièrement fort en faveur d'une origine autochtone.

La description de la détection et de la réanimation de micro-organismes dans des échantillons d’ambre vieux de plusieurs dizaines de millions d’années a fortement attiré l’attention de la communauté scientifique dans ce domaine au cours de la dernière décennie. Parallèlement à la caractérisation de la flore microbienne indigène présente dans ces formations géologiques, les analyses microbiologiques sont réalisées dans la galerie 4d ​​du laboratoire souterrain de Maas/Haute-Marne (air, parois) et dans le cadre des PAC2001 et DIR 1001. , les expériences DIR 1002 et DIR 1003 (eaux de forage) ont permis une première évaluation des espèces microbiennes susceptibles d'être massivement introduites sous terre lors de l'exploitation d'un futur centre de stockage de déchets radioactifs. La finalisation des analyses microbiologiques des échantillons d'eau prélevés lors des expériences PAC et DIR, et notamment la caractérisation des produits d'amplification obtenus directement à partir des échantillons, devraient de même compléter l'inventaire microbiologique du nouveau milieu souterrain créé par la construction de le laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne.

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

R ECAPITULATIF ET DISCUSSION DES RESULTATS OBTENUS

P ERSPECTIVES EXPERIMENTALES

C ONCLUSIONS DANS LE CADRE DU STOCKAGE GEOLOGIQUE DE DECHETS RADIOACTIFS . 153

C'est pourquoi nous avons abordé la recherche de micro-organismes dans l'argile à Opalinus du Mont Terri et dans l'argilite du Callovo-Oxfordien de Meuse/Haute-Marne en essayant de s'affranchir le plus possible d'une caractérisation microbiologique basée sur l'obtention d'une croissance sur milieu de culture. qui sélectionne uniquement les micro-organismes capables de s'y développer. En comparaison, l'argile à Opalinus et l'argilite du Callovo-Oxfordien ne constituent que des milieux déficitaires caractérisés par une limitation de l'espace disponible dans la porosité. Quant à l'étude de la population indigène, la nécessité d'utiliser des techniques de culture pour caractériser les micro-organismes allochtones fait que la diversité microbiologique actuellement observée dans le cadre de cette partie du travail est susceptible de ne refléter qu'une petite fraction des espèces microbiennes qui en fait effectivement introduit dans le milieu souterrain.

Cette étude suggère que l'argile à Opalinus contiendra cependant des cellules viables, éventuellement inactives in situ en raison de l'espace limité qui existe entre les couches d'argile et du manque de sources de carbone qui caractérisent cet environnement. Si des micro-organismes indigènes sont présents dans des formations sédimentaires telles que l’argile Opalinus ou l’argile du Callovo-Oxfordien, leur effet devrait en outre être négligeable par rapport à l’apport microbien massif attendu lors de la construction et de l’entretien. analyses microbiologiques réalisées dans la galerie 4d ​​et lors des expériences PAC et DIR. L'enfouissement de déchets radioactifs en milieu souterrain profond constitue un problème de société pour lequel l'importance et l'urgence de la prise de décision et de la responsabilité ont été largement encouragées par la communauté scientifique.

Concrètement, les déchets nucléaires existent et doivent être isolés de toutes les composantes de la biosphère. Les possibilités de stockage des déchets radioactifs à vie longue dans des couches géologiques profondes sont étudiées notamment grâce au laboratoire de Bure, à la frontière entre les départements de la Meuse et de la Haute-Marne, dans une couche géologique profonde et stable vieille de plus de 150 ans. d'années. Les principales évolutions apportées par cette loi par rapport aux objectifs de la loi Bataille du 30 décembre 1991 est présenté à la figure 41.

Un fonds a été créé à l'Andra, destiné à financer la construction, l'exploitation, la fermeture définitive, l'entretien et le suivi des installations de stockage et de stockage exploitées par l'Agence (financement par les contributions des producteurs de déchets). Viabilité et activité bactérienne à Mol-ser en fonction de la profondeur d'échantillonnage par rapport à la paroi de la galerie.