In our experiments we were focused on the development of a potential non/semi- invasive diagnostic test of endometriosis and on the assessment of retrograde menstruation, a crucial factor in understanding the pathogenesis of endometriosis. The aim of our first study was to test the hypothesis that multiple sensory small diameter nerve fibers are present in a higher density in endometrium from patients with endometriosis when compared to women with a normal pelvis, enabling the development of a semi-invasive diagnostic test for minimal-mild endometriosis.
Secretory phase endometrium samples (n=40), obtained from women with laparoscopically/histologically confirmed minimal-mild endometriosis (n=20) and from women with a normal pelvis (n=20) were selected from the biobank at the Leuven University Fertility Centre. Immunohistochemistry was performed to localise neural markers for sensory C, Aδ, adrenergic and cholinergic nerve fibers in the functional layer of the endometrium. Sections were immunostained with antihuman protein gene product 9.5 (PGP9.5) anti-neurofilament protein (NF), anti-substance P (SP), anti- vasoactive intestinal peptide (VIP), anti-neuropeptide Y (NPY), and anti-calcitonine gene-related polypeptide (CGRP). Statistical analysis was done using Mann-Whitney test, Receiver Operator Characteristic (ROC) analysis, Stepwise Logistic Regression and Least Squares Support Vector Machines (LSSVMs). The density of small nerve fibres was about 14 times higher in endometrium from patients with minimal-mild endometriosis (1.96±2.73) when compared to women with a normal pelvis (0.14±0.46, p <.0001). The combined analysis of neural markers PGP9.5, VIP, SP could predict the presence of minimal-mild endometriosis with 95% sensitivity, 100% specificity, and 97.5 % accuracy. Since we believe that the detailed investigation of the pathogenesis of endometriosis will create a solid background for future research with clinical relevance, such as the development of a diagnostic method, we have investigated the biological changes during the mentsrual cycle in the peritoneal cavity.
In our second experiment we have tested the hypothesis that menstruation is associated with a higher concentration of endometrial cells in peritoneal fluid (PF) and with increased white and red blood cell concentration in PF when compared to nonmenstrual phases of the cycle. PF was obtained at laparoscopy from 107 women with endometriosis (n= 59) and controls with a normal pelvis (n= 48) during the luteal
57
(n=46), follicular (n=38) or menstrual (n=23) phase of the cycle. Endometriosis was classified according to the classification of the American Society for Reproductive Medicine (rAFS into minimal (n=25), mild (n=20), moderate (n=6) and severe(n=8) disease. Cell counts (leucocytes, erythrocytes, thrombocytes) were determined on a cell counter. In a subset of 32 patients (13 controls and 19 women with endometriosis), PF was fixed, processed and thinlayers were prepared and stained with Papanicolaou method and with immunocytochemistry using monoclonal antibodies against cytokeratin 7 (CK 7), CK 8/18, Ber-Ep4, vimentin, calretinin and CD68. Ber-Ep4 is a marker for cells with epithelial origin (in some cases for mesothelial cells as well).
CD68 is specific for cells from monocyte/macrophage lineage; CK7 and CK8/18 are markers for both endometrial epithelial and mesothelial cells, whereas calretinin and vimentin are markers for both endometrial stromal and mesothelial cells. In comparison with the nonmenstrual phase of the cycle, analysis of PF during menstruation showed an increased concentration of leucocytes (3.3x109/L vs 0.8x109/L, P = 0.03), erythrocytes (0.3x1012/L vs 0.02x1012/L, P = 0.006), hematocrit (0.03 L/L vs 0.003 L/L, P = 0.01) and hemoglobin (0.8 g/dL vs 0.1 g/dL, P = 0.01). Mesothelial cells stained positively with CK7, CK8/18, vimentin, and calretinin. Cells positive for Ber-Ep4 were not observed, except in 2 patients with endometriosis we investigated during menstruation.
58 Összefoglalás
Az endometriosis gyakori, ösztrogén dependens, krónikus nőgyógyászati betegség, melynek lényege, az endometriumhoz hasonló szövet jelenléte a méh üregén kívül, legtöbbször a kismedencében. Etiológiája ismeretlen, azonban napjainkig számos elmélet született a betegség patomechanizmusának tisztázására. A legszélesebb körben elfogadott magyarázat a transzplantációs elmélet, mely szerint az endometriális sejtek retrográd menstruácio során jutnak a hasüregbe. Nincs azonban bizonyíték arra, hogy a peritoneális folyadékban található endometriális sejtek koncentrációja, vörös-és fehérvérsejt valamint hemoglobintartalma menstruáció során magasabb lenne, mint a menstruációs ciklus többi részében. Az endometriosis diagnózisa a kismedence laparoscopos áttekintésével lehetséges. Non-invazív diagnosztikai módszer hiányában, a tünetek kezdete és a definitív diagnózis között átlagosan 8 év telik el, a diagnosztikus késés, amennyiben a betegség kezelés nélkül marad, éveken át tartó szenvedéshez illetve meddőséghez vezethet. A perifériás vérből kimutatott biomarkereken alapuló non-invazív diagnosztikai eljárások hatékonysága, elégtelen szenzitivitásuk és specificitásuk miatt, korlátozott. Az endometriosisban szenvedők endometriumát túlnyomórészt kis átmérőjű szenzoros (főként C-tipusú), adrenerg és kisebb számban Aδ és cholinerg neuronok idegzik be.
Transcervicálisan nyert endometriális szenzoros idegrostok immunhisztokémiai analízisét végeztük olyan neurális transmitterek és fehérjék kimutatásával mint a substance P (SP), a vasoactiv intestinalis polypeptid (VIP), a protein gene product 9.5 (PGP9.5), a neurofilamentum (NF), a neuropeptid Y (NPY) valamint a calcitonin gene–related protein (CGRP). A betegség pathomechanizmusának vizsgálata révén lehetőség nyílhat klinikai jelentőségű eljárások kifejlesztésére. Ezért második vizsgálat sorozatunkban a peritoneális folyadék ciklikus biológiai változásait tanulmányoztuk. A retrográd menstruáció vizsgálatára irányuló kísérletünkben laparoscopia során nyertünk peritonális folyadékmintát endometriózisban szenvedő páciens kismedencéjéből illetve egészséges kontrollokból, a menstruációs ciklus luteális, follikuláris és menstruációs fázisaiban. Citokeratin 7 (CK), CK 8/18, Ber-Ep4, vimentin, kalretinin és CD68-ellenes monoklonális antitesteket használtunk a periotnealis folyadék sejtjeinek immuncytokémiai identifikációja céljából. Eredményeink bizonyítják, hogy a női menstruáció során a peritoneális folyadék leukocita, eritrocita és hemoglobinkoncentrációja magasabb a menstruációs ciklus többi fázisával összevetve, alátámasztva a retrográd menstruáció elméletét. Azonban a peritoneális folyadék endometriális eredetű sejtkoncentrációjában nem emelkedett a ciklus menstruációs fázisában. A dolgozatban vizsgált vékony, velőhüvely nélküli, szenzoros idegrostok
59
előfordulási gyakorisága nagyobb az igazoltan endometriosisban szenvedő nők endometriumának funkcionális rétegében, mint az egészséges kontrollokéban.
Eredményeink alapját képezik egy potenciális semi-invazív tesztnek mellyel lehetővé válhat az endometriosis korai klinikai diagnózisa.
60