Nanostrukturalne ciekłokrystaliczne lipidowe nośniki chemioterapeutyków oraz emiterów promieniowania

Celem pracy doktorskiej było zaprojektowanie i określenie właściwości chemicznych i biologicznych ciekłokrystalicznych lipidowych nośników leków zawierających w swojej strukturze różne pary substancji leczniczych. Określono wpływ połączenia chemioterapii i terapii alfa na komórki HeLa.

Metody dostarczania leków w terapii nowotworów

Chemioterapia

Przeciwnowotworowe działanie doksorubicyny polega na hamowaniu topoizomerazy II, polimeraz RNA i DNA, helikaz oraz enzymów naprawiających uszkodzenia DNA. Prowadzone są jednak badania mające na celu wyjaśnienie mechanizmów kardiotoksyczności leku, co pomoże opracować skuteczną i selektywną metodę dostarczania DOX bez zmiany działania przeciwnowotworowego.

Radioterapia

Większość radionuklidów używanych do wytwarzania radiofarmaceutyków pochodzi z grupy metali, a do ich wiązania wybiera się bifunkcyjne ligandy polikleszczowe. Stabilne kompleksy radionuklidu z ligandem są zarówno termodynamicznie, jak i kinetycznie niezwykle ważne z punktu widzenia skutków ubocznych – zapobiegają gromadzeniu się wolnego radioizotopu w zdrowych tkankach.

Celowana terapia radionuklidowa

71] W marcu 2022 roku FDA zatwierdziła 177Lu-PSMA-617 (PluvictoTM) do leczenia pacjentów z przerzutowym rakiem gruczołu krokowego opornego na kastrację (mCRPC). Preparat stosuje się w leczeniu chorych na objawowego raka gruczołu krokowego opornego na kastrację z przerzutami do kości.

Wyspecjalizowane nośniki leków

Ciekłe kryształy

Układy ciekłokrystaliczne występują powszechnie w przyrodzie (np. jako budulec błony komórkowej), a poznanie i określenie struktury ciekłych kryształów pozwala na opis mechanizmów i zjawisk biologicznych. Liotropowe fazy ciekłokrystaliczne są tworzone przez cząsteczki amfifilowe (np. lipidy) znajdujące się w odpowiednim rozpuszczalniku, a na powstawanie takich faz ma wpływ temperatura i zawartość rozpuszczalnika.

Polimorfizm lipidów

Dla CPP < 1 obszar polarny lipidu ma większą objętość niż część niepolarna, a cząsteczki lipidów układają się w warstwy o dodatniej krzywiźnie. Dla CPP = 1 polarna część lipidu ma taką samą powierzchnię jak część niepolarna, a cząsteczki układają się w płaskie dwuwarstwy bez krzywizny.

Charakterystyka liotropowych faz ciekłokrystalicznych

• Faza lamelarna
• Faza heksagonalna
• Faza kubiczna

Ponadto faza płytkowa wykazuje stosunkowo niską lepkość w porównaniu z fazami otrzymanymi z większą zawartością wody w układzie. W strukturze dwuciągłych odwróconych faz sześciennych można wyróżnić układ dwóch niezależnych, nieprzecinających się kanałów wodnych (o średnicy od około 4 do 20 nm), otoczonych dwuwarstwą lipidową (ok.

Ciekłokrystaliczne nanocząstki – kubosomy

Faza ta jest tworzona w pewnych warunkach przez dodanie związku, który „pęcznieje” fazę sześcienną i zmniejsza krzywiznę na granicy faz lipid/woda, umożliwiając uzyskanie fazy z szerszymi kanałami wodnymi. 33 Wprowadzenie lipidów naładowanych dodatnio zwiększa szerokość kanału wodnego, natomiast modyfikacja lipidami naładowanymi obojętnie powoduje zmniejszenie kanału wodnego.

Czynniki wpływające na szybkość uwalniania leków z nośnika

156] Aktywacja światłem lasera NIR umożliwiła manipulację strukturą fazową, powodując przejście z fazy sześciennej do fazy heksagonalnej, zmieniając profil uwalniania leku (ryc. 28). Rodamina 110 uwalnia profil magnetokubosomów pod wpływem pola magnetycznego (czerwony) i bez przyłożonego pola magnetycznego (czarny).

Zastosowanie kubosomów w nanomedycynie

• Kubosomy jako nośniki leków przeciwnowotworowych
• Kubosomy jako nośniki do miejscowego dostarczania leków

Różnica w wydajności między kubosomami pokrytymi poli-ε-lizyną a kubosomami niepowlekanymi była związana z szybszym uwalnianiem leku z niepowlekanych kubosomów. Przeżywalność komórek raka szyjki macicy po podaniu wolnego TMZ lub DOX, kubosomów domieszkowanych miRNA oraz miRNA i TMZ/DOX (B). Kubosomy fluoresceiny były również domieszkowane hydrofobowym lekiem przeciwnowotworowym, kwercetyną, uzyskując przybliżoną skuteczność kapsułkowania na poziomie 80%.

Obrazy Cryo-TEM kubosomów domieszkowanych fluoroforem i obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek fibroblastów 3T3 po ekspozycji na kubosomy domieszkowane fluoresceiną. Po ekspozycji na elastazę Pseudomonas aeruginosa lub elastazę neutrofilową wolny LL-37 uległ całkowitemu rozkładowi, podczas gdy LL-37 unieruchomiony w kubosomach pozostał nienaruszony. W zastosowanym podejściu zewnętrzna błona bakteryjna była najpierw destabilizowana przez oddziaływania elektrostatyczne między peptydem a lipidem, a następnie uszkadzana przez działanie kubosomów (ryc. 40).

Stosowane metody badawcze

• Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami
• Dynamiczne rozpraszanie światła
• Kriomikroskopia elektronowa
• Woltamperometria cykliczna
• Woltamperometria pulsowa różnicowa
• Spektroskopia UV-Vis
• Chromatografia cienkowarstwowa
• Test MTS
• Cytometria przepływowa

Technika Dynamic Light Scattering (DLS) umożliwia wyznaczenie hydrodynamicznej średnicy cząstek, ich dyspersji oraz pomiar potencjału zeta. Potencjał zeta to potencjał hipotetycznej granicy wyznaczonej przez płaszczyznę poślizgu (Rysunek 42), która służy do wyznaczania stabilności układów koloidalnych. Przyjmuje się, że nanocząstki o wartości potencjału bardziej dodatniej niż +30 mV i bardziej ujemnej niż -30 mV tworzą stabilny układ koloidalny.

W przypadku elektrodowego procesu odwracalnego różnica potencjałów szczytowych nie przekracza 0,059/nV, a stosunek szczytowych prądów utleniania i redukcji jest bliski jedności. W procesie quasi-odwracalnym różnica między potencjałem końcówki anodowej a końcówką katodową mieści się w zakresie od 0,059 V do 0,1 V. Różnicowa woltamperometria impulsowa (DPV) jest techniką elektrochemiczną, w której liniowa zmiana potencjał jest nakładany przez impulsy o stałej i małej amplitudzie (Rysunek 46A).

Materiały i odczynniki chemiczne

Aparatura i wykonanie pomiarów

• Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami
• Dynamiczne rozpraszanie światła
• Transmisyjna kriomikroskopia elektronowa
• Badanie profilu uwalniania leku z faz kubicznych za pomocą metod
• Badanie profilu uwalniania leku z kubosomów za pomocą spektrofotometrii
• Określenie kinetyki uwalniania leku
• Pomiar radioaktywności
• Hodowla linii komórkowej HeLa
• Badania cytotoksyczności
• Cytometria przepływowa
• Sferoidy

Przed pomiarami elektrody robocze na tarczach polerskich zostały oczyszczone tlenkiem glinu (średnica 1 µm, 0,3 µm, 0,05 µm) i przemyte wodą destylowaną. Następnie elektrody zanurzano w 10 ml elektrolitu zasadowego (0,1 M bufor MES, pH 5,5) Przed każdym pomiarem roztwór elektrolitu odtleniano argonem przez 15 minut. Hodowlę komórek linii HeLa prowadzono w sterylnych butelkach polistyrenowych iw pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami (penicylina 10 000 U/ml, streptomycyna 10 mg/ml).

Komórki HeLa hodowano w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami (penicylina 10 000 U/ml, streptomycyna 10 mg/ml). W tym celu wykorzystaliśmy komórki HeLa hodowane w podłożu RPMI-1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami (penicylina 10 000 U/ml, streptomycyna 10 mg/ml). Ponadto sferoidy traktowane 213Bi w kubosomach w dawce 0,5 MBq/ml barwiono odczynnikami fluorescencyjnymi, takimi jak jodek propidyny i Hoechst 33258.

Metodyka badań

Synteza p-NCS-benzyl-DOTA-GA-oleiloaminy

Przygotowanie faz kubicznych

Przygotowanie kubosomów

Aby przygotować kubosomy domieszkowane DOTAGA-OA, ligand najpierw rozpuszczono w stosunku objętościowym 4 do 1 chloroformu i metanolu, a następnie zmieszano z GMO. LuCl3 rozpuszczono w buforze octanowym i dodano do kubosomów domieszkowanych DOTAGA-OA (stosunek molowy Lu:DOTAGA-OA wynosił 1:1).

Charakterystyka faz kubicznych domieszkowanych DOX oraz DOTAGA-OA

Charakterystyka ligandu DOTAGA-OA

Charakterystyka strukturalna faz kubicznych domieszkowanych DOTAGA-

Analiza uzyskanych wyników obejmowała przypisanie liniom dyfrakcyjnym odpowiednich wskaźników Millera hkl na podstawie stosunku kolejnych sygnałów do pierwszego piku q0 oraz wyznaczenie parametru sieci krystalicznej a i szerokości kanału wodnego d. Domieszkowanie wpłynęło również na szerokość kanału wodnego (4,5 nm dla nagiej fazy sześciennej), powodując jego poszerzenie do 10,1 nm (dla fazy sześciennej domieszkowanej 15% wag. DOTAGA-OA). Wynika to z oddziaływań elektrostatycznych ujemnie naładowanej hydrofilowej części ligandu (DOTAGA), która jest wystawiona na działanie kanału wodnego fazy sześciennej.

Domieszkowanie DOX (0,2% mas.), co odpowiada ilości stosowanej w badaniach biologicznych, spowodowało nieznaczne obniżenie parametru sieci krystalicznej. Ze względu na fakt, że mezofazy o większej zawartości DOTAGA-OA przygotowano z nadmiarem wody, we wszystkich obliczeniach przyjęto długość łańcucha lipidowego 1,8 nm.

Charakterystyka elektrochemiczna DOX unieruchomionej w fazach

Zarejestrowane cykliczne woltamogramy procesu redukcji DOX w fazie sześciennej przy różnych szybkościach zmian potencjału Zależność szczytowego prądu katody (czarny) i szczytowego prądu anody (czerwony) od pierwiastka zmiany potencjału dla DOX w fazie sześciennej (wewnętrzny rysunek) (B). Aby stwierdzić, czy unieruchomienie DOX w mezofazie nie zmienia sposobu transportu leku do elektrody, zarejestrowano krzywe cykliczne dla procesu redukcji DOX przy różnych szybkościach zmian potencjału oraz zależność szczytowego prądu katody od określono pierwiastek potencjalnej zmiany kursu (Wykres 57B). Cykliczne woltamogramy zarejestrowane dla DOX w fazie sześciennej (0,2% wag. leku w fazie) bez ligandu i dla fazy domieszkowanej DOTAGA-OA (0,2% wag.)

Zależność szczytowego prądu katodowego (czarny) i szczytowego prądu anodowego (czerwony) od pierwiastka kwadratowego zmiany potencjału dla DOX w fazie sześciennej z dodatkiem DOTAGA-OA (wstawiony obraz). Przesunięcie piku potencjału redukcji jest wyraźnie widoczne na woltamogramach zarejestrowanych metodą różnicowej woltamperometrii impulsowej (DPV) (ryc. 59A). Różnicowe woltamogramy pulsacyjne dla DOX wprowadzonego w fazę sześcienną (0,2% wag. leku w fazie) i DOX unieruchomionego w fazie sześciennej za pomocą DOTAGA-OA (0,2% wag.)

Ciekłokrystaliczne nośniki chemioterapeutyku i emitera promieniowania β -

• Charakterystyka strukturalna kubosomów
• Określenie profilu uwalniania DOX z kubosomów
• Znakowanie ligandu DOTAGA-OA 177 Lu
• Wyznaczenie lipofilowości koniugatu DOTAGA-OA- 177 Lu
• Znakowanie DOTAGA-OA wbudowanej w kubosomy
• Badania in vitro na linii komórkowej HeLa

Ze względu na warunki prowadzenia reakcji znakowania DOTAGA-OA (95 °C) z radionuklidem, na wstępie sprawdzono wpływ temperatury na strukturę kubosomów. Na podstawie tych wyników określono profil uwalniania DOX z kubosomów domieszkowanych DOTAGA-OA metodą UV-Vis. Model opisuje kinetykę uwalniania DOX z kubosomów bez mieszaniny DOTAGA-OA iw obecności ligandu.

Badania stabilności kubosomów z DOTAGA-OA-177Lu przeprowadzono w roztworach o znaczeniu biologicznym: buforze PBS oraz w surowicy ludzkiej. Stwierdzono, że ponad 86% aktywności (bufor PBS) i 78% aktywności (surowica) pozostało w nanocząstkach po 24 h (Tabela 11), co świadczy o dobrej stabilności kubosomów domieszkowanych DOTAGA-OA- kompleks 177Lu. Przeżywalność komórek HeLa po inkubacji w obecności roztworu kubosomów z DOTAGA-OA-177Lu (177Lu-Cubo) i kubosomów bimodalnych z DOX i DOTAGA-OA-177Lu (177Lu-Cubo-DOX).

Kubosomy jako nośniki chemioterapeutyku i emiterów promieniowania α

Charakterystyka strukturalna kubosomów przeznaczonych do znakowania

Dyfraktogramy dla kubosomów domieszkowanych różnymi ilościami (% wag.) DOTAGA-OA i DOX oraz DOTAGA-OA zarejestrowanych w 25 ° C (A) i 37. Jednak dodanie DOTAGA-OA (0, 16% wag.) zwiększyło parametr sieci a . , prymitywna symetria kubosomów została zachowana. Również jednoczesne domieszkowanie kubosomów DOX (0,02% wagowych) i DOTAGA-OA (0,16% wagowych) nie zmieniło symetrii.

Jednoczesne wbudowanie kubosomów DOTAGA-OA, DOX i DOTAGA-OA do struktury spowodowało zmianę potencjału zeta do -20 mV i -17 mV. Obrazy Cryo-TEM dla pustych kubosomów (A), kubosomów z DOX (B), kubosomów z wbudowanym DOTAGA-OA (C) i kubosomów domieszkowanych zarówno DOTAGA-OA, jak i DOX (D).

Znakowanie DOTAGA-OA 225 Ac i wyznaczenie lipofilowości koniugatu

Znakowanie kubosomów 225 Ac i badania in vitro na linii komórkowej HeLa

Komórki inkubowano z kubosomalnym roztworem z unieruchomionym kompleksem DOTAGA-OA-225Ac i jednocześnie wprowadzono DOX i radioaktywny kompleks do struktury nośnej. Kubosomy domieszkowane samym DOX wykorzystano jako punkt odniesienia do określenia efektu, który występuje, gdy biomodalne kubosomy są podawane komórkom. Przeżywalność komórek HeLa po inkubacji w obecności roztworu kubosomów z DOTAGA-OA-225Ac i bimodalnych kubosomów z DOX i DOTAGA-OA-225Ac.

Komórki inkubowane z roztworem kubosomów z włączonym DOX (stężenie leku 0,21 ug/ml) zastosowano jako punkt odniesienia do określenia wpływu bimodalnych kubosomów. Okres półtrwania aktynu-225 wynosi 10 dni, więc brak efektu interakcji między radionuklidem a chemioterapeutykiem może wynikać z niedostosowanej do badań in vitro skali czasowej z wykorzystaniem kubosomów.

Znakowanie kubosomów 213 Bi i badania in vitro na linii komórkowej HeLa

W celu określenia efektu terapii skojarzonej jako punkt odniesienia wykorzystano kubosomy domieszkowane DOX, co spowodowało większy efekt cytotoksyczny w porównaniu z kubosomami domieszkowanymi kompleksem radioaktywnym. Przeżywalność komórek HeLa po inkubacji w obecności roztworu kubosomów z DOTAGA-OA-213Bi i bimodalnych kubosomów z DOX i DOTAGA-OA-213Bi. Komórki inkubowane z roztworem kubosomów z osadzonym DOX (stężenie leku 0,21 µg/ml) zastosowano jako punkt odniesienia do określenia efektu bimodalnych kubosomów.

Podobnie jak w badaniach in vitro przeprowadzonych dla aktynu-225, nie zaobserwowano efektu synergistycznego pomiędzy DOX i 213Bi w nośnikach ciekłokrystalicznych.

Sekwencyjne podanie kubosomów – badania in vitro na linii komórkowej

The effect of enhanced permeability and retention (Epr): Importance of the concept and methods to improve its implementation. Biomarkers to personalize 177Lu-PSMA-617 treatment in men with metastatic castration-resistant prostate cancer - a state-of-the-art review. Treatment of carcinoma in situ of the urinary bladder with an alpha-emitter immunoconjugate targeting the epidermal growth factor receptor: a pilot study.

Cubosomes as an emerging platform for drug delivery: a review of the state of the art. A review of liposomes as a drug delivery system: current status of approved products, regulatory environments and future perspectives. Lyotropic cubic phases for drug delivery: diffusion and sustained release from the mesophase evaluated by electrochemical methods.

Paclitaxel-loaded self-assembled lipid nanoparticles as targeted drug delivery systems for the treatment of aggressive ovarian cancer. In vitro and in vivo toxicity and biodistribution of paclitaxel-loaded cubosomes as nanocarriers for drug delivery: a case study using an A431 skin cancer xenograft model.