4.3 Kubosomy jako nośniki chemioterapeutyku i emiterów promieniowania α
4.3.5 Sekwencyjne podanie kubosomów – badania in vitro na linii komórkowej
W dalszych eksperymentach postanowiono zastosować sekwencyjne podanie chemioterapeutyku i radionuklidu wbudowanych w kubosomy. Kolejne eksperymenty biologiczne na linii HeLa przeprowadzono podając najpierw kubosomy z radioizotopem, w celu uwrażliwienia komórek promieniowaniem, a następnie kubosomy z chemioterapeutykiem. Zastosowano różne dawki promieniowania oraz stężenie DOX wynoszące 0,21 µg/mL. Do określenia aktywności metabolicznej komórek wykorzystano test MTS. Otrzymane rezultaty przedstawiono na Rysunku 77.
Rysunek 77. Przeżywalność komórek HeLa inkubowanych w roztworze zawierającym kubosomy (Cubo). Komórki były inkubowane 24 h w obecności roztworu kubosomów z DOTAGA-OA-213Bi (213Bi-Cubo) o różnej aktywności. Po tym czasie roztwór z kubosomami odciągnięto, komórki przemyto buforem PBS i dodano odpowiednio kubosomy z DOX (Cubo- DOX) lub puste kubosomy (Cubo). Ponownie inkubowano przez 24 h, 48 h i 72 h. Jako punkt odniesienia wykorzystano puste kubosomy (Cubo), po 24 h roztwór odciągnięto, komórki przemyto PBS i dodano kubosomy z DOX (Cubo-DOX). Inkubowano przez 24 h, 48 h, 72 h.
Pomiary powtórzono trzykrotnie, wyniki istotne statystycznie (w odniesieniu do kontroli) przy p≤0,05, p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***).
110 Sekwencyjne podanie pozwoliło na znaczne wzmocnienie efektu współdziałania doksorubicyny oraz radionuklidu. Podanie kubosomów z 213Bi, a następnie kubosomów z DOX, skutkowało znacznym obniżeniem aktywności metabolicznej komórek HeLa, w porównaniu do kubosomów domieszkowanych tylko radionuklidem lub chemioterapeutykiem. Efekt był obserwowany szczególnie po 72 h inkubacji, przy zastosowaniu dawki promieniowania wynoszącej 2000 kBq/mL. Przeżywalność komórek wynosiła w tych warunkach ok. 26 %. Wyniki jednoznacznie wykazały, że terapia skojarzona, z zastosowaniem najwyższej dawki 213Bi i 0,2 μg/mL DOX (wbudowanymi w osobne nośniki), jest najbardziej obiecującym podejściem terapeutycznym.
Aby określić, czy zahamowanie wzrostu komórek pod wpływem działania promieniowania α oraz DOX, jest związane z uruchomieniem szlaków programowanej śmierci komórki, analizowano apoptozę komórek HeLa. Programowaną śmierć komórki oceniano za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem barwienia fluorescencyjnego (Rysunek 78).
111 Rysunek 78. Ilość komórek we wczesnym lub późnym stadium apoptozy (wyrażona w procentach) inkubowanych w roztworze zawierającym kubosomy (Cubo). Komórki były inkubowane 24 h z 213Bi-Cubo o aktywności 500 kBq/ml lub 2000 kBq/ml, po tym czasie roztwór z kubosomami odciągnięto, komórki przemyto buforem PBS i dodano odpowiednio kubosomy z DOX (DOX-Cubo) lub puste kubosomy (Cubo). Ponownie inkubowano 24 h i 48 h. Jako punkt odniesienia wykorzystano puste kubosomy (Cubo), po 24 h roztwór odciągnięto, komórki przemyto PBS i dodano DOX-Cubo. Inkubowano 24 h i 48 h.
Badania pozwoliły ustalić, że po sekwencyjnym podaniu kubosomów śmierć komórek następuje głównie na drodze apoptozy. Ilość komórek we wczesnej apoptozie nie zwiększyła się znacząco po podaniu kubosomów domieszkowanych 213Bi oraz DOX. Ponadto, po dłuższym czasie inkubacji (48 h) zaobserwowano mniej komórek we wczesnej apoptozie niż przy krótszym czasie inkubacji (24 h). Wraz ze zwiększeniem dawki izotopu oraz
112 z wydłużeniem czasu inkubacji występuje więcej komórek w późnym stadium apoptozy.
Najwięcej komórek w stadium późnej apoptozy (ok. 58 %) zaobserwowano po sekwencyjnym podaniu kubosomów z 213Bi (2000 kBq/mL), a następnie kubosomów z DOX (213Bi- Cubo/DOX-Cubo), po czasie inkubacji wynoszącym 48 h.
Aby dokładniej scharakteryzować wpływ domieszkowanych kubosomów na linię komórkową HeLa, przeanalizowano cykl komórkowy. Komórki HeLa zostały wyeksponowane na działanie promieniowania α, w dawkach wynoszących 500 kBq/mL i 2000 kBq/mL, oraz na działanie DOX (stężenie 0,2 μg/mL), oddzielnie wbudowanej w kubosomy. Wyniki przedstawiono na Rysunku 79.
Rysunek 79. Zatrzymanie cyklu komórkowego w komórkach HeLa indukowane przez 213Bi- Cubo/Cubo, Cubo/DOX-Cubo i 213Bi-Cubo/DOX-Cubo. Przedstawione jako procent komórek w fazach G0/G1, S, i G2/M (n=3±SD).
Sekwencyjne podanie kubosomów z 213Bi, a następnie kubosomów z DOX, znacznie wpłynęło na ilość komórek w fazie G2/M po 24 i 48 h inkubacji. Wpływ promieniowania α (213Bi- Cubo/Cubo) na odsetek komórek w fazie G2/M nie był tak duży jak w przypadku sekwencyjnego podania chemioterapeutyku (Cubo/DOX-Cubo), ale wzrastał wraz z czasem i stosowaną dawką. Najwięcej komórek w fazie G2/M (75 %) zaobserwowano, gdy komórki poddano działaniu 213Bi-Cubo/DOX-Cubo (dawka 2000 kBq/mL), po 48 h inkubacji.
113 Otrzymane wyniki są zgodne z danymi literaturowymi, w których promieniowanie α [215–217]
i doksorubicyna [218] powodują zatrzymanie w fazie G2/M w komórkach nowotworowych, co może prowadzić do zainicjowania śmierci komórki.
W celu szerszego scharakteryzowania właściwości cytotoksycznych kubosomów względem komórek nowotworowych HeLa przeprowadzono badania ich wpływu na trójwymiarowy (3D) model hodowli komórkowej - sferoidy. Sferoidy, ze względu na swój rozmiar dobrze symulują model mikroprzerzutów nowotworowych. Badania przeprowadzone na sferoidach pozwalają na lepszą ocenę działania preparatu w potencjalnych warunkach in vivo w porównaniu do badań toksyczności prowadzonych w płaskiej przestrzeni dwuwymiarowej.
Znaczne różnice w wielkości i strukturze sferoidów po sekwencyjnym podaniu kubosomów można zaobserwować po upływie kolejnych dni pomiarowych (Rysunek 80).
Rysunek 80. Mikroskopowe obrazy wybranych reprezentatywnych sferiodów po podaniu 213Bi-Cubo/Cubo, Cubo/DOX-Cubo, 213Bi-Cubo/DOX-Cubo (dawki 213Bi: 500 kBq/mL i 2000 kBq/mL); stężenie DOX 0,2 µg/mL) oraz kontrolne sferoidy HeLa po 1, 3, 6 i 12 dniach inkubacji.
Wyniki te wskazują, że podanie 213Bi-Cubo/DOX-Cubo (dawka 2000 kBq/mL) znacząco hamuje wzrost sferoidów w porównaniu do ich początkowego rozmiaru. Dla porównania, podanie kubosomów tylko z 213Bi (213-Bi-Cubo, dawka 2000 kBq/mL) lub kubosomów z DOX (0,2 µg/mL) ma mniejszy wpływ na zahamowanie wzrostu sferoidów.
Dodatkowo, w celu dalszej weryfikacji wpływu badanych kubosomów na modele hodowli komórek nowotworowych 3D, sferoidy poddano barwieniu jodkiem propidyny (PI)
114 oraz Hoechst 33258 (Rysunek 81). Jodek propidyny, ze względu na posiadany ładunek elektryczny, nie przenika przez nieuszkodzoną błonę cytoplazmatyczną komórek żywych i we wczesnej apoptozie. Barwi on jednak na czerwono komórki z uszkodzoną błoną, a więc komórki nekrotyczne lub w późnej apoptozie. Hoechst służy natomiast do wybarwiania żywych komórek.
Rysunek 81. Zdjęcia mikroskopowe wybranych reprezentatywnych sferoidów w jasnym polu (BF), wybarwionych jodkiem propidyny (PI) i Hoechst 33258 (Hoechst) po inkubacji z 213Bi-Cubo/Cubo, Cubo/DOX-Cubo i 213Bi-Cubo/DOX-Cubo (dawka 213Bi 500 kBq/mL, stężenie DOX 0,2 μg/mL) w porównaniu do kontroli po 1, 3 i 10 dniach inkubacji.
115 W pierwszym dniu po zaaplikowaniu kubosomów wszystkie sferoidy wykazywały podobną intensywność czerwonego zabarwienia PI. Po 3 dniach inkubacji sferoidów, poddanych działaniu 213Bi-Cubo/DOX-Cubo, obserwowany był intensywniejszy sygnał PI, wskazujący na występowanie komórek w późnym stadium apoptozy lub komórek nekrotycznych.
W przeciwieństwie do terapii skojarzonej, inkubacja tylko z 213Bi-Cubo lub DOX-Cubo prowadziła do mniej intensywnego zabarwienia PI, co świadczyło o niższej cytotoksyczności.
Wyniki te są porównywalne z testem MTS i badaniami cytometrii przepływowej, gdzie obserwowano najwyższą cytotoksyczność i zablokowanie cyklu komórkowego w fazie G2/M po podaniu sekwencyjnym radionuklidu i chemioterapeutyku.
116
5 Podsumowanie i wnioski
W pracy otrzymano bimodalne kubosomy zawierające chemioterapeutyk oraz emiter promieniowania β- lub α. Wydajność enkapsulacji doksorubicyny w nanocząstkach była wysoka (>96 %), co oznacza, że kubosomy są potencjalnie odpowiednimi kandydatami do zastosowań w terapii przeciwnowotworowej. W celu stabilnego unieruchomienia radionuklidu w ciekłokrystalicznym nośniku otrzymano makrocykliczny ligand z hydrofilową częścią (DOTAGA) oraz hydrofobowym, oleiloaminowym łańcuchem.
Stosując metody elektrochemiczne oraz spektroskopię UV-Vis wykonano badania profilu uwalniania chemioterapeutyku z faz kubicznych oraz kubosomów. Przy pomocy modeli matematycznych określono kinetykę uwalniania leku z nośnika. Wykazano, że uwalnianie doksorubicyny z faz kubicznych oraz kubosomów jest kontrolowane przez dyfuzję.
We wcześniejszych pracach opisano, że uwalnianie doksorubicyny zachodzi szybko w pH środowiska bliskim pH komórki nowotworowej, natomiast w pH obojętnym lek pozostawał wbudowany w nośnik.[162,163] Dzięki temu możliwe jest zwiększenie selektywności leku wbudowanego w ciekłokrystaliczną matrycę oraz ograniczenie występowania działań niepożądanych. Przeprowadzone badania uwalniania leku wskazują na użyteczność ciekłokrystalicznych nośników do enkapsulacji doksorubicyny. Sprawdzono również profil uwalniania DOX w obecności ligandu DOTAGA-OA. W pH 5,5 dodatni ładunek DOX jest neutralizowany przez ujemnie naładowaną DOTAGA-OA, co sprawia, że większe ilości DOX wbudowane są w dwuwarstwę lipidową kubosomu, z której dyfuzja leku jest znacznie wolniejsza. W związku z tym mniejsze ilości leku są uwalniane w badanym przedziale czasu.
Stosując metodę SAXS wykonano badania strukturalne faz kubicznych oraz kubosomów, które potwierdziły, że domieszkowanie doksorubicyną oraz ligandem nie wpłynęły na symetrię otrzymanych mezofaz. Badania wykonane techniką DLS pozwoliły ustalić, że domieszki nie wpływają na stabilność otrzymanych formulacji.
Kubosomy z wbudowanym ligandem wyznakowano emiterem promieniowania β-, otrzymując wysoką wydajność znakowania (> 99 %). Dla porównania, wydajność znakowania liposomów
131I mieściła się w zakresie od 70 do 90 %. [197] Można zatem wnioskować, że kubosomy mogą być obiecującymi nośnikami radionuklidów, pozwalającymi na stabilne unieruchomienie skompleksowanego izotopu w ich strukturze.
117 Poszukując synergii bądź addytywności chemioterapii oraz terapii radionuklidowej, przeprowadzono badania in vitro kubosomów domieszkowanych DOX i 177Lu. Efekt synergii między chemioterapeutykiem a emiterem promieniowania β-,unieruchomionymi w jednym nośniku, występował tylko po krótszym czasie inkubacji (24 h) oraz przy zastosowaniu wysokiej dawki promieniowania (15 MBq/mL). W przypadku dłuższego czasu inkubacji oraz niższych dawek promieniowania wzmocnienie efektu cytotoksycznego nie było obserwowane.
Wykazano, że obecność DOTAGA-OA w nośniku wpływa na profil uwalniania DOX ze względu na elektrostatyczne oddziaływania między dodatnio naładowanym chemioterapeutykiem, a ujemnie naładowanym ligandem. Wpływa to zatem na zmniejszoną cytotoksyczność obserwowaną w badaniach in vitro.
W celu uzyskania lepszego efektu współdziałania chemioterapii i terapii radionuklidowej przeprowadzono badania z wykorzystaniem α-emitera, 225Ac. Emitery α cechuje większa cytotoksyczność w stosunku do emiterów β- [209], a zatem spodziewano się uzyskać lepszą efektywność działania chemioterapeutyku i radionuklidu wbudowanych w ciekłokrystaliczne matryce. Jednak na podstawie badań na linii komórkowej HeLa ustalono, że między DOX a 225Ac unieruchomionymi w kubosomach nie występuje efekt synergii ani addytywności, niezależnie od czasu inkubacji oraz stosowanej dawki. Ze względu na ograniczoną stabilność kubosomów w czasie, brak efektu współdziałania chemioterapeutyku i radionuklidu prawdopodobnie był związany z zastosowaniem radionuklidu ze zbyt długim czasem połowicznego rozpadu, niedostosowanego do skali czasowej wykorzystywanej w badaniach komórkowych.
Aby uzyskać lepsze dopasowanie kombinowanej terapii do stabilności kubosomów w czasie, w kolejnych eksperymentach komórkowych, wykorzystano krótkożyciowy emiter promieniowania α, 213Bi. Wyniki badań na linii komórkowej HeLa były analogiczne do badań przeprowadzonych dla 225Ac. Niezależnie od czasu inkubacji oraz zastosowanej dawki promieniowania, nie zaobserwowano efektu synergii między DOX a 213Bi w ciekłokrystalicznych nośnikach.
Biorąc pod uwagę wcześniejsze wyniki badań in vitro oraz ograniczone uwalnianie DOX z nośnika w obecności DOTAGA-OA, postanowiono zastosować sekwencyjne podanie chemioterapeutyku i radionuklidu unieruchomionych w kubosomach. W tym celu komórkom najpierw zaaplikowano kubosomy z radioizotopem, w celu uwrażliwienia komórek promieniowaniem, a następnie podano kubosomy z chemioterapeutykiem. Podanie
118 chemioterapeutyku i radionuklidu w oddzielnym nośniku pozwoliło na uniknięcie oddziaływań między DOX a ligandem, co wpłynęło na zwiększenie efektu cytotoksycznego i uniemożliwiło niekorzystne oddziaływania elektrostatyczne DOX z wolnym ligandem DOTAGA-OA.
W literaturze istnieją już doniesienia, że sekwencyjna chemio- i radioterapia pozwalają na osiągnięcie dobrego efektu terapeutycznego szczególnie u pacjentów z chorobami współistniejącymi, u których nie można zastosować obu metod jednocześnie. [219] Ponadto, sekwencyjne leczenie pozwala na zmniejszenie działań niepożądanych w porównaniu z jednoczesnym stosowaniem chemio- i radioterapii. [220] Jest to zatem obiecujące podejście terapeutyczne o potencjalnie wysokiej skuteczności przy równoczesnym minimalizowaniu wpływu na zdrowe tkanki organizmu. Przyjmuje się, że miarą skuteczności terapii przeciwnowotworowej, poza zahamowaniem proliferacji komórek, jest zdolność do indukowania w komórkach nowotworowych procesu apoptozy, a jednocześnie doprowadzenie do jak najmniejszego uszkodzenia zdrowych komórek. [221] Otrzymane wyniki badań wyraźnie wskazują na indukowanie procesu apoptozy w komórkach HeLa po sekwencyjnym podaniu kubosomów z 213Bi oraz DOX. Wyniki badań na sferoidach są porównywalne z rezultatami otrzymanymi przy zastosowaniu testu MTS oraz przy badaniach metodą cytometrii przepływowej. Przeprowadzone badania in vitro dają zatem spójny obraz podstawowych mechanizmów biologicznych zachodzących pod wpływem sekwencyjnej terapii z wykorzystaniem ciekłokrystalicznych nośników.
Wyniki badań ujętych w niniejszej rozprawie pozwalają wysunąć następujące wnioski:
✓ Po raz pierwszy pokazano, że typowe radiofarmaceutyki mogą być podawane w formie ciekłokrystalicznej mezofazy lipidowej lub jej nanocząstek o strukturze kubosomu.
Kubosomy domieszkowane ligandem DOTAGA-OA cechowała wysoka wydajność znakowania (>99%), niezależnie od zastosowanego radionuklidu.
✓ Domieszkowanie faz kubicznych chemoterapeutykiem, DOX oraz ligandem DOTAGA-OA nie prowadził do zmiany symetrii mezofazy (Pn3m). Zwiększeniu uległ jedynie parametr sieci krystalicznej oraz szerokość kanału wodnego.
✓ Otrzymane nanocząstki fazy kubicznej kubosomy mają inną symetrię niż objętościowa mezofaza kubiczna, a mianowicie symetrię prymitywną (Im3m). Domieszkowanie nanocząstek DOX, DOTAGA-OA oraz LuCl3 nie zmienia ich struktury wewnętrznej, a jedynie powoduje zmianę parametru sieci krystalicznej i zwiększenie szerokości kanału wodnego.
✓ Przygotowane formulacje były stabilne i nie agregowały.
119
✓ Badania kinetyki uwalniania doksorubicyny z faz kubicznych i kubosomów wskazały na dyfuzyjny mechanizm uwalniania leku. W obecności DOTAGA-OA uwalniane były w tym samym czasie mniejsze ilości DOX z nośnika, co wytłumaczono oddziaływaniem elektrostatycznym dodatnio naładowanej doksorubicyny i ujemnie naładowanego wolnego ligandu
✓ Badania cytotoksyczności wykazały, że kubosomy pozwalają na zastosowanie mniejszych ilości doksorubicyny w terapii w porównaniu z lekiem podawanym bez nośnika.
✓ Efekt współdziałania doksorubicyny i 177Lu w kubosomach był obserwowany przy czasie inkubacji wynoszącym 24 h i przy zastosowaniu dawki promieniowania wynoszącej 15 MBq/mL.
✓ Nie zaobserwowano synergii ani addytywności działania doksorubicyny i α-emitera (225Ac lub 213Bi) wbudowanych jednocześnie w ten sam nośnik, w przeciwieństwie do korzystnego efektu widocznego w przypadku sekwencyjnego podawania leków w osobnym nośniku.
✓ Największy efekt cytotoksyczny uzyskuje się stosując sekwencyjne podanie doksorubicyny i 213Bi. Cytotoksyczność zaobserwowano nie tylko w badaniach z wykorzystaniem testu MTS, ale również w przypadku badań z wykorzystaniem sferoidów. Wyniki badań metodą cytometrii przepływowej wykazały wzrost ilości komórek w stadium późnej apoptozy po sekwencyjnym podaniu doksorubicyny 213Bi.
Po raz pierwszy przeprowadzono badania wykorzystujące kubosomy jako nośniki radionuklidów. Uzyskane wyniki przekonują, że ciekłokrystaliczne nośniki są obiecującymi kandydatami do zastosowań w skojarzonej terapii nowotworów. Warto dalej pracować nad optymalnym składem nośników z punktu widzenia ich stabilności w środowisku biologicznym, a więc w warunkach badań in vitro oraz in vivo. Na podstawie badań stabilności monooleinowych kubosomów w osoczu ustalono, że poszczególne składniki osocza, np.
albuminy, oddziaływały z kubosomami i przyspieszały ich rozpad w długich czasach pomiarów. [222] Jednocześnie substancja aktywna wbudowana w kubosomy krążyła w osoczu na skutek trwałości produktów rozpadu nanocząstek. W innych badaniach podkreślono, że stabilność kubosomów w płynach ustrojowych zależy od rodzaju zastosowanego lipidu oraz polimeru stabilizującego. [222,223] Zastosowanie np. fitantriolu prowadzi do większej stabilności kubosomów in vivo, jednak zwiększa się jednocześnie toksyczność samego nośnika.
[127] Potencjalnie korzystnym rozwiązaniem może być zatem zastosowanie monooleinowych
120 kubosomów stabilizowanych np. PEG. Istotny jest również sposób podawania bifunkcjonalnych kubosomów. Najbardziej korzystną drogą aplikacji otrzymanych nośników wydaje się bezpośrednie podanie do guza. Pozwala to na wprowadzenie maksymalnego stężenia leku do stosunkowo małego i ograniczonego obszaru, co zwiększa ekspozycję komórek nowotworowych na stosowany chemioterapeutyk. Takie podanie nanocząstek pozwala również na ograniczenie ich degradacji przez lipazy. Dalsze badania powinny być również ukierunkowane na przyłączenie wektorów naprowadzających w celu bardziej selektywnego dostarczania nośników bezpośrednio do guza i tym samym zmniejszenia kumulacji leku w zdrowych organach.
Ciekłokrystaliczne nośniki mogą być użyteczne nie tylko w terapii nowotworów. Jednym z większych zagrożeń dla zdrowia publicznego, poza chorobami nowotworowymi, jest obecnie rosnąca bakteriooporność na antybiotyki. Alternatywą dla konwencjonalnych antybiotyków są peptydy przeciwdrobnoustrojowe. Zapewniają one szerokie spektrum działania bakteriobójczego i są również są mniej podatne na rozwój bakterii opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe. Jednakże większość peptydów przeciwbakteryjnych jest podatna na degradację chemiczną i proteolityczną w warunkach fizjologicznych i potrzebuje matrycy ochronnej, aby umożliwić skuteczne leczenie. Odpowiednimi matrycami do unieruchomienia takich peptydów mogą okazać się także ciekłokrystaliczne nanocząstki zaproponowane w tej rozprawie.
121
5 Bibliografia
1. Didkowska, J.; Wojciechowska, U.; Michałek, I.; Caetano dos Santos, F.; Olasek, P.
Nowotwory Złośliwe W Polsce W 2019 Roku (Cancer in Poland in 2019). Kraj. Rejestr Nowotworów 2021.
2. DeVita Jr., V.T.; Chu, E. A History of Cancer Chemotherapy. Cancer Res. 2008, 68, 8643–8653, doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-6611.
3. Kummar, S.; Gutierrez, M.; Doroshow, J.H.; Murgo, A.J. Drug development in oncology: classical cytotoxics and molecularly targeted agents. Br. J. Clin. Pharmacol.
2006, 62, 15–26, doi:https://doi.org/10.1111/j.1365-2125.2006.02713.x.
4. Łyskawa, W. Chemioterapia w leczeniu choroby nowotworowej i jej neurotoksyczność.
Anestezjol. i Ratow. 2009, 3, 80–87.
5. Baskar, R.; Lee, K.A.; Yeo, R.; Yeoh, K.W. Cancer and radiation therapy: Current advances and future directions. Int. J. Med. Sci. 2012, 9, 193–199.
6. Damiana, T.S.T.; Dalm, S.U. Combination therapy, a promising approach to enhance the efficacy of radionuclide and targeted radionuclide therapy of prostate and breast cancer.
Pharmaceutics 2021, 13, doi:10.3390/pharmaceutics13050674.
7. Bartelink, H.; Kallman, R.F.; Rapacchietta, D.; Hart, G.A.M. Therapeutic enhancement in mice by clinically relevant dose and fractionation schedules of cis- diamminedichloroplatinum(II) and irradiation. Radiother. Oncol. 1986, 6, 61–74, doi:10.1016/S0167-8140(86)80110-4.
8. Durand, R.E.; LePard, N.E. Effects of mitomycin C on the oxygenation and radiosensitivity of murine and human tumours in mice. Radiother. Oncol. 2000, 56, 245–
252, doi:10.1016/S0167-8140(00)00180-8.
9. Nylén, U.; Cekan, E.; Jonasson, G.-B.; Lewin, F.; Skog, S. Effects of 5-fluorouracil on cell cycle arrest and toxicity induced by X-irradiation in normal mammalian cells. Cell Prolif. 2001, 34, 85–98, doi:https://doi.org/10.1046/j.1365-2184.2001.00200.x.
10. Seiwert, T.Y.; Salama, J.K.; Vokes, E.E. The chemoradiation paradigm in head and neck cancer. Nat. Clin. Pract. Oncol. 2007, 4, 156–171, doi:10.1038/ncponc0750.
11. Nagasawa, S.; Takahashi, J.; Suzuki, G.; Hideya, Y.; Yamada, K. Why concurrent cddp
122 and radiotherapy has synergistic antitumor effects: A review of in vitro experimental and clinical-based studies. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1–13, doi:10.3390/ijms22063140.
12. Kranjc Brezar, S.; Prevc, A.; Niksic Zakelj, M.; Brozic, A.; Cemazar, M.; Strojan, P.;
Sersa, G. Synergistic effect of cisplatin chemotherapy combined with fractionated radiotherapy regimen in HPV-positive and HPV-negative experimental pharyngeal squamous cell carcinoma. Sci. Rep. 2020, 10, 1–9, doi:10.1038/s41598-020-58502-9.
13. Ersahin, D.; Doddamane, I.; Cheng, D. Targeted radionuclide therapy. Cancers (Basel).
2011, 3, 3838–3855, doi:10.3390/cancers3043838.
14. Zhang, Y.; Chan, H.F.; Leong, K.W. Advanced materials and processing for drug delivery: The past and the future. Adv. Drug Deliv. Rev. 2013, 65, 104–120, doi:10.1016/j.addr.2012.10.003.
15. Vargason, A.M.; Anselmo, A.C.; Mitragotri, S. The evolution of commercial drug delivery technologies. Nat. Biomed. Eng. 2021, 5, 951–967, doi:10.1038/s41551-021- 00698-w.
16. Salvioni, L.; Rizzuto, M.A.; Bertolini, J.A.; Pandolfi, L.; Colombo, M.; Prosperi, D.
Thirty years of cancer nanomedicine: Success, frustration, and hope. Cancers (Basel).
2019, 11, doi:10.3390/cancers11121855.
17. Etheridge, M.L.; Campbell, S.A.; Erdman, A.G.; Haynes, C.L.; Wolf, S.M.;
McCullough, J. The big picture on nanomedicine: The state of investigational and approved nanomedicine products. Nanomedicine Nanotechnology, Biol. Med. 2013, 9, 1–14, doi:10.1016/j.nano.2012.05.013.
18. Tibbals, H.F. Medical Nanotechnology and Nanomedicine; 1st Editio.; CRC Press: Boca Raton, 2011; ISBN 9781315218250.
19. Wu, J. The enhanced permeability and retention (Epr) effect: The significance of the concept and methods to enhance its application. J. Pers. Med. 2021, 11, doi:10.3390/jpm11080771.
20. Murthy, S.K. Nanoparticles in modern medicine: state of the art and future challenges.
Int. J. Nanomedicine 2007, 2, 129–41.
21. Mitchell, M.J.; Billingsley, M.M.; Haley, R.M.; Wechsler, M.E.; Peppas, N.A.; Langer, R. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 2021,
123 20, 101–124, doi:10.1038/s41573-020-0090-8.
22. DiMasi, J.A.; Hansen, R.W.; Grabowski, H.G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. J. Health Econ. 2003, 22, 151–185, doi:10.1016/S0167- 6296(02)00126-1.
23. Mokhtari, R.B.; Homayouni, T.S.; Baluch, N.; Morgatskaya, E.; Kumar, S.; Das, B.;
Yeger, H. Combination therapy in combating cancer. Oncotarget 2017, 8, 38022–38043.
24. Plana, D.; Palmer, A.C.; Sorger, P.K. Independent drug action in combination therapy:
implications for precision oncology. Cancer Discov. 2022, 12, 606–624, doi:10.1158/2159-8290.CD-21-0212.
25. Chen, K.; Huang, Y.H.; Chen, J.L. Understanding and targeting cancer stem cells:
Therapeutic implications and challenges. Acta Pharmacol. Sin. 2013, 34, 732–740, doi:10.1038/aps.2013.27.
26. Tran, S.; DeGiovanni, P.; Piel, B.; Rai, P. Cancer nanomedicine: a review of recent success in drug delivery. Clin. Transl. Med. 2017, 6, doi:10.1186/s40169-017-0175-0.
27. Lu, Z.R.; Qiao, P. Drug delivery in cancer therapy, quo vadis? Mol. Pharm. 2018, 15, 3603–3616, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.8b00037.
28. Li, S.D.; Huang, L. Pharmacokinetics and biodistribution of nanoparticles. Mol. Pharm.
2008, 5, 496–504, doi:10.1021/mp800049w.
29. Falzone, L.; Salomone, S.; Libra, M. Evolution of cancer pharmacological treatments at the turn of the third millennium. Front. Pharmacol. 2018, 9, doi:10.3389/fphar.2018.01300.
30. Zer, A.; Prince, R.M.; Amir, E.; Abdul Razak, A.R. Multi-agent chemotherapy in advanced soft tissue sarcoma (STS) – A systematic review and meta-analysis. Cancer Treat. Rev. 2018, 63, 71–78, doi:10.1016/j.ctrv.2017.12.003.
31. Wallace, K.B. Doxorubicin-induced cardiac mitochondrionopathy. Pharmacol. Toxicol.
2003, 93, 105–115, doi:10.1034/j.1600-0773.2003.930301.x.
32. Martins-Teixeira, M.B.; Carvalho, I. Antitumour Anthracyclines: Progress and Perspectives. ChemMedChem 2020, 15, 933–948, doi:10.1002/cmdc.202000131.
33. Szuławska, A.; Czyz, M. Molekularne mechanizmy działania antracyklin. Postepy Hig.
124 Med. Dosw. 2006, 60, 78–100.
34. Pommier, Y.; Leo, E.; Zhang, H.; Marchand, C. DNA topoisomerases and their poisoning by anticancer and antibacterial drugs. Chem. Biol. 2010, 17, 421–433, doi:10.1016/j.chembiol.2010.04.012.
35. Głogowska, I.; Dubiański, R.; Skrzypczyk, A.; Pieńkowski, T. Rola antracyklin w leczeniu zaawansowanego raka piersi - miejsce niepegylowanej doksorubicyny liposomalnej. Onkol. w Prakt. Klin. 2010, 6, 8–17.
36. van der Zanden, S.Y.; Qiao, X.; Neefjes, J. New insights into the activities and toxicities of the old anticancer drug doxorubicin. FEBS J. 2021, 288, 6095–6111, doi:10.1111/febs.15583.
37. Turrens, J.F.; Alexandre, A.; Lehninger, A.L. Ubisemiquinone is the electron donor for superoxide formation by complex III of heart mitochondria. Arch. Biochem. Biophys.
1985, 237, 408–414, doi:https://doi.org/10.1016/0003-9861(85)90293-0.
38. Murabito, A.; Hirsch, E.; Ghigo, A. Mechanisms of anthracycline-induced cardiotoxicity: is mitochondrial dysfunction the answer? Front. Cardiovasc. Med. 2020, 7, 1–12, doi:10.3389/fcvm.2020.00035.
39. Minotti, G.; Menna, P.; Salvatorelli, E.; Cairo, G.; Gianni, L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity.
Pharmacol. Rev. 2004, 56, 185 LP – 229, doi:10.1124/pr.56.2.6.
40. Licata, S.; Saponiero, A.; Mordente, A.; Minotti, G. Doxorubicin metabolism and toxicity in human myocardium: Role of cytoplasmic deglycosidation and carbonyl reduction. Chem. Res. Toxicol. 2000, 13, 414–420, doi:10.1021/tx000013q.
41. Przybyszewski, W.M.; Wideł, M.; Rzeszowska-Wolny, J. Kardiotoksyczne następstwa promieniowania jonizującego i antracyklin. Postep. Hig Med Dosw. 2006, 60, 397–405, doi:http://www.phmd.pl/pub/phmd/vol_60/9494.pdf.
42. Gammella, E.; Maccarinelli, F.; Buratti, P.; Recalcati, S.; Cairo, G. The role of iron in anthracycline cardiotoxicity. Front. Pharmacol. 2014, 5 FEB, 1–6, doi:10.3389/fphar.2014.00025.
43. Ichikawa, Y.; Ghanefar, M.; Bayeva, M.; Wu, R.; Khechaduri, A.; Naga Prasad, S. V.;
Mutharasan, R.K.; Jairaj Naik, T.; Ardehali, H. Cardiotoxicity of doxorubicin is
125 mediated through mitochondrial iron accumulation. J. Clin. Invest. 2014, 124, 617–630, doi:10.1172/JCI72931.
44. Štěrba, M.; Popelová, O.; Vávrová, A.; Jirkovský, E.; Kovaříková, P.; Geršl, V.;
Šimůnek, T. Oxidative stress, redox signaling, and metal chelation in anthracycline cardiotoxicity and pharmacological cardioprotection. Antioxidants Redox Signal. 2013, 18, 899–929, doi:10.1089/ars.2012.4795.
45. Jurczak, W.; OgóRka, T. Kardiotoksyczność po leczeniu chorych z chłoniakami złośliwymi. Onkol. Prak. Klin 2010, A18–A24.
46. Theodoulou, M.; Hudis, C. Cardiac profiles of liposomal anthracyclines: greater cardiac safety versus conventional doxorubicin? Cancer 2004, 100, 2052–2063, doi:10.1002/cncr.20207.
47. Ewer, M.S.; Martin, F.J.; Henderson, I.C.; Shapiro, C.L.; Benjamin, R.S.; Gabizon, A.A.
Cardiac safety of liposomal anthracyclines. Semin. Oncol. 2004, 31, 161–181, doi:https://doi.org/10.1053/j.seminoncol.2004.08.006.
48. Lao, J.; Madani, J.; Puértolas, T.; Álvarez, M.; Hernández, A.; Pazo-Cid, R.; Artal, Á.;
Antón Torres, A. Liposomal doxorubicin in the treatment of breast cancer patients: a review. J. Drug Deliv. 2013, 2013, 1–12, doi:10.1155/2013/456409.
49. Franco, Y.L.; Vaidya, T.R.; Ait-Oudhia, S. Anticancer and cardio-protective effects of liposomal doxorubicin in the treatment of breast cancer. Breast Cancer Targets Ther.
2018, 10, 131–141, doi:10.2147/BCTT.S170239.
50. Szmit, S.; Filipiak, K.J.; Litwiniuk, M.; Opolski, G.; Wysocki, P.; Zaborska, B.;
Krzakowski, M. Doksorubicyna liposomalna u chorych na raka piersi ze współistniejącymi chorobami sercowo-naczyniowymi — wielodyscyplinarne stanowisko ekspertów. Kardiol. Pol. 2016, 74, 1031–1036.
51. Rafiyath, S.M.; Rasul, M.; Lee, B.; Wei, G.; Lamba, G.; Liu, D. Comparison of safety and toxicity of liposomal doxorubicin vs. conventional anthracyclines: a meta-analysis.
Exp. Hematol. Oncol. 2012, 1, 1–9, doi:10.1186/2162-3619-1-10.
52. Wouters, K.A.; Kremer, L.C.M.; Miller, T.L.; Herman, E.H.; Lipshultz, S.E. Protecting against anthracycline-induced myocardial damage: A review of the most promising strategies. Br. J. Haematol. 2005, 131, 561–578, doi:10.1111/j.1365-